Мед портал рб: Единый медицинский портал

Последствия раннего социального контакта

Abstract

Как единственная репродуктивная самка в колонии медоносных пчел ( Apis mellifera ), здоровье королевы имеет решающее значение для продуктивности и долголетия колонии.Операции пчеловодства обычно основаны на коммерческом массовом производстве маток для размножения колоний, которое включает в себя манипулирование и изоляцию маток путем помещения их в клетки на раннем этапе развития. Используя распространенные методы выращивания маток, это исследование показывает, что отделение только что закрытых маток от их обслуживающего персонала на 72 часа с использованием защитных клеток маток оказывает значительное влияние на общее количество кишечных бактерий, переносимых этими матками, по сравнению с матками, которые имеют неограниченный доступ к обслуживающему персоналу. после взрыва.Изолированные девственные матки, взятые сразу после изоляции через 4 дня после заключения, имели значительно больше бактерий и менее согласованный состав микробиоты, чем их неизолированные сверстники. Кроме того, этот эффект сохранялся в течение брачной жизни маток, поскольку у маток, которые были изолированы после вылупления, а затем взяты пробы через 14 дней после вылупления, также было значительно больше микробиоты по сравнению с неизолированными спарившимися матками того же возраста. Причины и возможные последствия этого изменения не ясны и заслуживают дальнейшего изучения.Это исследование также подтверждает более ранние выводы о том, что у пчелиных маток отсутствует основной микробиом, обнаруживаемый у рабочих медоносных пчел.

Образец цитирования: Powell JE, Eiri D, Moran NA, Rangel J (2018) Модуляция микробиоты матки медоносных пчел: эффекты ранних социальных контактов. PLoS ONE 13 (7): e0200527. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200527

Редактор: Дэниел Э. Розен, Лейденский университет, Нидерланды

Поступила: 9 февраля 2018 г .; Одобрена: 28 июня 2018 г .; Опубликован: 12 июля 2018 г.

Авторские права: © 2018 Powell et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все файлы последовательностей доступны в Архиве чтения последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), идентификатор (ID) биопроекта PRJNA429464. Дополнительные файлы и информация доступны во вспомогательной информации.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана финансированием Джулианы Рангель наградой USDA-NIFA (2015-67013-23170) (https: // portal.nifa.usda.gov/lmd4/recent_awards) и проект Hatch Project Техасского университета A&M (TEX09557) (https://agrilifeas.tamu.edu/fiscal/project-records/), награда Национального научного фонда за измерение биоразнообразия (1415604) ( https://www.nsf.gov/awardsearch/showAward?AWD_ID=1415604) Нэнси А. Моран и награды Национального института здравоохранения (1R01GM108477-01) (http://grantome.com/grant/NIH/ R01-GM108477-01) Нэнси А. Моран. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Медоносные пчелы ( Apis mellifera ), являясь очень эусоциальными насекомыми, живут колониями, состоящими из одной матки, выполняющей все репродуктивные функции, десятков тысяч рабочих женщин и ограниченного числа сезонных самцов, называемых трутнями [1 , 2] Матка пассивно регулирует эту крайнюю форму репродуктивной монополии, высвобождая железистые феромоны [3–5], которые очень привлекательны для рабочих [6–10], препятствуют выращиванию маток [11–13] и подавляют активацию яичников рабочих [6–10]. 14,15].Поскольку королева отвечает за производство рабочих, продуктивность колонии напрямую связана с общим репродуктивным здоровьем королевы [16,17].

Отказ королевы, который может происходить из-за патогенов [18,19], воздействия пестицидов [9,20], неадекватного спаривания [6–8] или комбинации факторов, недавно был объявлен одной из основных причин колонии. потери в США [21–23]. Чтобы избежать внезапного отказа матки, многие современные пчеловоды перестали полагаться на естественные процессы замены матки в колонии [2,24].Вместо этого они предпочитают полагаться на систематическую процедуру ежегодной замены маток, в которой используются матки, выращенные в массовом порядке коммерческими операциями по выращиванию маток. Вкратце, однодневных рабочих личинок прививают в пластиковые чашки-матки и помещают в колонии без маток, где медсестры кормят их маточным молочком до тех пор, пока их клетки не будут закрыты, после чего они подвергаются окукливанию [2]. За несколько дней до того, как матки, как ожидается, вырастут, пчеловоды либо перемещают клетки по отдельности в небольшие «ядерные» колонии, содержащие несколько сотен рабочих, где молодые матки появляются и спариваются естественным образом, либо они заключают клетки в защитные клетки и помещают их в матку. «Банковские» колонии, где молодые королевы, девственные или спарившиеся, содержатся в течение нескольких дней или недель, пока не будут приняты на работу [25].Этот банковский процесс не позволяет ферзям напрямую контактировать с другими ферзями, тем самым избегая дуэлей на выбывание ферзь-ферзь [25].

Аналогичный эксперимент по изоляции, проведенный с недавно появившимися рабочими-медоносными пчелами, показал, что рабочие клетки, которые позволяли им контактировать с товарищами по гнезду только через трофалаксис, предотвращали нормальную колонизацию микробиотой ядра кишечника [26]. Это нарушение может, следовательно, влиять на реакцию социального иммунитета на уровне колонии [27]. У рабочих микробиом ядра кишечника состоит из восьми основных бактериальных линий, которые передаются через социальные взаимодействия [26].Эти линии очень согласованы по возрасту и географическому положению [28] и способствуют пищеварению и развитию [29], потенциально защищая пчел от патогенов [30]. Предыдущие исследования [31,32] установили, что микробиота маток существенно отличается от таковой рабочих. По сравнению с рабочими, королевы содержат более высокое представительство бактериальных линий, обнаруженных в нектаре, личинках и улье. К ним относятся определенные линии Acetobacteraceae (называемые «Alpha 2.1» и «Alpha 2.2 ”), которые являются такими же или близкими к Parasaccharibacter apium [33]. Как на микробиоту кишечника маток влияет изоляция в клетках-защитниках маток, в настоящее время неизвестно. Это исследование направлено на изучение возможных последствий изоляции матки для состава микробиоты кишечника, что, в свою очередь, может повлиять на общее состояние здоровья матки и колонии.

Мы использовали количественную ПЦР вместе с глубоким секвенированием ампликонов области V4 бактериального гена 16S рРНК, чтобы охарактеризовать как размер, так и состав микробиома маток.Мы сравнили особенности микробиома на двух этапах развития маток: девственных маток через 4 дня после выпадения и маток через 14 дней после выпадения. Мы сравнили маток, которые либо поддерживали контакт со своими пчелами-кормилицами на протяжении всего развития (неизолированная, контрольная группа), либо были отделены от медсестер на 72 часа через 24 часа после заключения в защитную клетку маток (изолированная, экспериментальная группа). Поскольку последнее лечение соответствует методу содержания в клетке, который обычно используется для коммерческого выращивания маток, наше исследование предоставляет новую информацию о том, могут ли существующие методы выращивания маток влиять на развитие нормальной кишечной микробиоты маток медоносных пчел.

Материалы и методы

Экспериментальная установка и выращивание матки

Для этого исследования использовались две пчелиные семьи медоносных пчел, расположенные на базе медоносных пчел Дженис и Джона Дж. Томаса Техасского университета A&M в Колледж-Стейшн, штат Техас. Двадцать однодневных рабочих личинок из каждой колонии были пересажены в индивидуальные чашки маток, а затем перенесены в колонию для строительства клеток с 5 рамками, следуя стандартным процедурам выращивания маток [25]. После закрытия маточников их помещали по отдельности в пластиковые защитные клетки.Всех маток, которые вылупились в клетках, по отдельности помещали в двухкамерные колонии без маток, содержащие несколько сотен рабочих и небольшой участок расплода разного возраста, а также мед и пыльцу. Еще пять маток были получены методом прививки и вырастили до взрослого возраста без содержания в клетке. После выхода последних пяти маток из клеток их хранили в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл с 95% этанолом при -20 ° C.

Поскольку отбор проб пчелиного кишечника основан на взятии всего кишечника путем вскрытия, невозможно многократно отбирать пробы у одних и тех же особей с течением времени.Из-за этого ограничения мы выбрали выборку маток в два периода сбора: в 4-дневном возрасте, когда матки были еще девственниками, и в 14-дневном возрасте, после того, как они спарились и были замечены откладывающими яйца, предназначенные рабочими. Взрослые кошки, помещенные в основные колонии, были разделены на 4 группы обработки: (1) изолированные девственные матки (IVQ), (2) изолированные спарившиеся матки (IMQ), (3) неизолированные девственные матки (NVQ) и (4) неизолированные спарившиеся матки (NMQ). Изолированные матки (IVQ и IMQ) оставались в клетках маток в течение четырех дней после вылупления.Неизолированные кошки (NVQ и NMQ) были выпущены из клеток через 24 часа после появления всходов, чтобы увеличить скорость их принятия рабочими в колониях ядра. Таким образом, изолированные и неизолированные королевы различались на 3 дня в их воздействии полного контакта с медсестрами и материалами улья. Отбор маток-девственниц и маток проводили через 4 и 14 дней после появления всходов, соответственно. Все 14-дневные матки успешно спарились (IMQ и NMQ), что подтверждено подтверждением наличия предназначенных для рабочих яиц в зоне расплода колоний ядра спаривания.Наша выборка не разделяла эффекты спаривания и возраста. На практике матки спариваются через 14 дней после раскрытия, и мы стремились представить нормальные этапы жизненного цикла матки.

Кроме того, 5 рамок расплода с крышками (без взрослых пчел) из обеих исходных колоний помещали в инкубатор на ночь при 34 ° C. Новорожденных рабочих наносили на грудную клетку латексной краской разных цветов (Testors, Vernon Hills, Иллинойс, США), чтобы указать дату появления каждого рабочего и колонию происхождения.Все рабочие вышли в течение двенадцати часов из всех подопытных маток. Примерно 20 вновь появившихся рабочих были помещены в каждую основную колонию одновременно с введением матки. Поскольку рабочие происходили из той же колонии, что использовалась для прививки, они были сестрами маток. Отмеченные рабочие были собраны одновременно со сбором маток в возрасте 4 или 14 дней. Для колонии 2 мы не смогли восстановить отмеченных рабочих через 14 дней, поэтому они представлены только одной колонией.Всех маток и рабочих помещали в микроцентрифужные пробирки на 1,5 мл или конические пробирки на 15 мл, соответственно, и хранили в 95% этаноле при -20 ° C до экстракции ДНК. Эта экспериментальная стратегия представлена ​​на рис. 1.

Рис. 1. Схема эксперимента.

Схематическая диаграмма экспериментов, проведенных для определения эффекта изоляции матки медоносных пчел после заключения на последующую микробиоту кишечника и для сравнения микробиоты кишечника матки и рабочего. Детали экспериментов приведены в разделе «Методы «.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200527.g001

Извлечение ДНК

из всей кишки (от урожая до прямой кишки) 45 маток и 20 рабочих экстрагировали в стерильных условиях, как описано Powell et al. [26] с использованием метода взбивания шариков CTAB (бромид цетилтриметиламмония). Вкратце, свежие пчелиные кишки живых пчел помещали в этанол. Для обработки их извлекали из флаконов и помещали по отдельности в отдельные пробирки для сушки на воздухе.Через 5-10 минут в каждую пробирку добавляли 728 мкл CTAB и 20 мкл протеиназы K (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) и образец гомогенизировали пестиком. Гомогенат переносили пипеткой в ​​свежую трубку для взбивания шариков с ~ 0,5 мл 0,1 мм гранул диоксида кремния и циркония (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США). Затем 2 мкл 2-меркаптоэтанола (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) добавляли в каждую пробирку, которую отбивали шариками (BioSpec Products, Бартлсвилл, Оклахома, США) в течение 2 минут на полной скорости, а затем 1 минуту. на льду и последние 2 минуты взбивания бусинок на полной скорости.Пробирки инкубировали при 56 ° C в течение 45 минут перед добавлением 2 мкл РНКазы A (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), а затем инкубировали в течение ночи. Приблизительно 600 мкл расщепленного лизата добавляли в новую пробирку с 600 мкл смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт 25: 24: 1 (Ambion, Остин, Техас, США). Затем пробирки 5 раз переворачивали и помещали на лед на 2 мин перед центрифугированием на полной скорости в течение 15 мин при 4 ° C. Водную фазу осаждали спиртом, промывали, сушили на воздухе и затем ресуспендировали в 50 мкл воды, свободной от нуклеаз.Экстрагированную ДНК количественно оценивали с помощью флуориметра Qubit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) и нормализовали до 10 нг / мкл водой, свободной от нуклеаз.

Диагностический ПЦР

Наличие бактериальной ДНК у недавно появившихся маток и рабочих было подтверждено с использованием универсальных праймеров для генов 16S рРНК бактерий 27f-short и 1507r. Для проверки качества ДНК образцы также подвергали скринингу с помощью праймеров ef1α эукариот [34]. ПЦР-скрининг проводился с отрицательным (ddH ₂ 0) и положительным (взрослый A . mellifera кишечная ДНК) контроль на 2% агарозном геле (120 В, 30 мин). Образцы, которые не продуцировали ампликоны с универсальными бактериальными праймерами, не были количественно определены с помощью кПЦР и не использовались для секвенирования Illumina.

Численность бактерий оценивается по количеству копий гена 16S рРНК

Количественная ПЦР была проведена для оценки количества копий гена 16S рРНК в отдельных образцах. Мы амплифицировали ген 16S рРНК с использованием универсальных бактериальных праймеров, как описано у Raymann et al.[35]. Статистические различия в абсолютном количестве копий гена 16S рРНК были проанализированы в R [36], сначала выполнив тест нормальности Шапиро-Уилка. После определения нормального распределения сравнения между группами маток и рабочих выполняли с помощью теста однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Последующий апостериорный попарный анализ проводили с использованием теста множественных сравнений по методу Tukey Honest Significant Difference (HSD).

Секвенирование Illumina

была проведена для амплификации области V4 16S рРНК в трех повторностях с использованием праймеров 515F и 806R [37].Затем реакционные смеси очищали с помощью гранул AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Индианаполис, Индиана, США). Полученный очищенный ампликон был отправлен в Центр секвенирования и анализа генома Техасского университета в Остине для секвенирования Illumina на платформе MiSeq (прогон 2×250 п.о.). Необработанная статистика чтения и обработки чтения представлена ​​в таблице S1. Отдельные образцы, которые не подверглись амплификации, или образцы с низким количеством качественных считываний, были исключены из набора данных. Информация о выборке представлена ​​в таблице S2, а сводная информация о распределении типов выборки включена в таблицу S3.

Поскольку все праймеры, обычно используемые для исследования микробного разнообразия, демонстрируют различные уровни систематической ошибки, выбор праймеров влияет на пропорции клонов в полученной библиотеке ампликонов [38,39]. Недавние исследования изучали новые подходы, такие как поли-А-хвосты с обратной транскрипцией рРНК [40] или использование альтернативных мишеней, таких как ген rpoB [41]. Выбор праймеров для гена 16S рРНК в этом исследовании в значительной степени определялся накопленными данными о микробиоме кишечника пчел, основанными на характеристике гена 16S рРНК; во многих из этих предыдущих исследований использовались те же самые гипервариабельные области и последовательности праймеров [28,34,42–48].Этот выбор праймера позволил нам получить данные, которые можно было легко сопоставить между исследованиями.

Регистрационный номер нуклеотидной последовательности

Все файлы последовательностей доступны в Архиве чтения последовательностей (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra), идентификатор (ID) биопроекта PRJNA429464.

Анализ последовательности

считывания последовательностей Illumina были обработаны с помощью QIIME 1.9 [49]. Прямые и обратные чтения Illumina были объединены с использованием метода SeqPrep [50] через join_paired_ends.py-скрипт с измененными настройками: минимально допустимая доля совпадающих баз была установлена ​​на 0,2, а максимально несовпадающие высококачественные базы были разрешены для присоединения к чтениям на 0,06. Химерные последовательности были удалены с помощью метода обнаружения usearch6.1 [51], реализованного в скрипте identify_chimeric_seqs.py в QIIME. Операционные таксономические единицы (OTU) были сгруппированы на 97%, а репрезентативные последовательности были назначены через uclust [51]. Митохондрии, хлоропласты, синглтон и чтения, содержащие несколько неоднозначных базовых вызовов, были отфильтрованы из набора данных.

Таксономия была отнесена к репрезентативным последовательностям OTU с использованием выравнивателя SILVA SINA (v1.2.11) [52]. Прочтения Lactobacilli и Acetobacteraceae были дополнительно исследованы, чтобы правильно определить таксономию и различать связанные с хозяином и экологические клоны. Таксономическое размещение этих клонов сложнее, чем легко определяемых связанных с хозяином групп, таких как Snodgrassella , Gilliamella и Frischella [53]. Для OTU Lactobacilli и Acetobacteraceae репрезентативные последовательности были помещены в выравнивания и использованы для реконструкции деревьев максимального правдоподобия с использованием выравниваний и методов, используемых Cariveau et al.[53]. Вкратце, полноразмерные или почти полноразмерные последовательности 16S рРНК бактерий, связанных с корбикулятами пчел ( Bombus и Apis ) и другими близкородственными бактериальными таксонами, были получены из Genbank и использованы вместе с репрезентативными последовательностями из нашего набора данных. Для тех, которые были объединены как Acetobacteraceae с помощью SILVA, последовательности были выровнены с помощью Infernal aligner в RDP 10 [54], и выравнивание было использовано для реконструкции деревьев максимального правдоподобия с поддержкой бутстрапа через RAxML v7.4.2 [55]. Модель замещения базовой GTRgamma использовалась с 1000 итераций. Дерево Lactobacillus было выведено другим путем из-за сложности и размера рода и неоднозначностей в выравнивании генов 16S рРНК [56]. Выравнивание на основе тщательно подобранной модели вторичной структуры было использовано из исследования специфичности хозяина между перепончатокрылыми и лактобациллами [57]. Репрезентативные последовательности Lactobacilli из нашего набора данных были добавлены к выравниванию с помощью PyNAST [58]. Полученные деревья были визуализированы с помощью FigTree 1.4.3 (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/). Затем чтения были объединены в зависимости от того, имеют ли они филогеномные размещения с родословными, ассоциированными с хозяином.

Таксономический анализ

44 наиболее распространенных OTU, составляющих 96% отфильтрованных считываний, были использованы для таксономического анализа. Таксономические определения для этих OTU с высокой численностью включены в Таблицу S5, а репрезентативные последовательности — в Приложении S1. Они были объединены в виды и использованы для построения графиков относительной численности.Абсолютное количество видов бактерий в образцах было получено с использованием методов, описанных в Raymann et al. [35]. Вкратце, общее количество копий 16S рРНК, представленное для отдельного образца, было умножено на относительную численность данного таксона в этом образце. Затем этот продукт был разделен на количество оперонов 16S рРНК, о которых сообщалось для этого таксона, на основе полных, полностью собранных последовательностей генома. Хотя штаммы могут различаться по числу оперонов 16S рРНК, мы ожидаем, что это изменение будет незначительным.Средние относительные пропорции и абсолютная численность конкретных таксономических линий были статистически сравнены с односторонними тестами ANOVA Краскела-Уоллиса из пакета R pgirmess [59], а прямоугольные диаграммы были сделаны в R с использованием ggplot2 [60].

Альфа- и бета-разнообразие

Альфа-разнообразие исследовали путем расчета индекса разнообразия Шеннона и его преобразования в линейное эффективное число видов [61]. Этот расчет был основан на методе подвыборки, выполняемой с 10 итерациями на каждые 100 считываний.Использовалась равномерная глубина 1800 считываний на образец, так как эта глубина позволяет сохранить большое количество образцов для исследования и продемонстрировать насыщение альфа-разнообразия (S2, рис.). Для проверки альфа-разнообразия между группами мы сначала использовали тест Бартлетта на однородность дисперсий, затем ANOVA Уэлча [36] и апостериорный тест Геймса-Хауэлла для множественных сравнений [62]. Для бета-разнообразия мы использовали таблицу OTU с подвыборкой 1800 чтений без замены в качестве основы для анализа расстояний Брея-Кертиса. Были построены графики анализа главных компонентов (PCA) расстояний Брея-Кертиса, и статистические различия между группами маток и рабочих были изучены с помощью метода R VEGAN Adonis для пермутационного многомерного анализа дисперсии (PERMANOVA) тестов [63,64].

Результаты

Общая численность бактерий и альфа-разнообразие

Все неизолированные королевы, как девственные, так и спарившиеся (NVQ и NMQ), имели значительно меньше средних копий гена 16S рРНК и более низкое альфа-разнообразие (по данным Эффективного числа видов) по сравнению с 4-дневными (W4s) и Рабочие в возрасте 14 дней (W14) (рис. 2). Кроме того, у NMQ было значительно меньше копий гена 16S рРНК и более низкое эффективное количество видов, чем у любых изолированных (IVQ и IMQ) маток (рис. 2A и 2B; p <0.05, HSD Тьюки для копий 16S рРНК и тест множественных сравнений Games-Howell на альфа-разнообразие). IVQ имели сходное количество копий гена 16S рРНК по сравнению с IMQ или W4 и W14 (рис. 2A; p > 0,05, HSD Тьюки). Таким образом, изоляция маток в течение первых нескольких дней после заражения приводит к более позднему увеличению количества кишечных бактерий.

Рис. 2. Сравнение количества копий гена 16SrRNA и альфа-разнообразия между группами образцов.

a) Общее количество копий гена 16S рРНК для маток, сгруппированных по состоянию спаривания и изоляции, а также для рабочих.б) Среднее эффективное количество видов из 10 выборок таблицы с разреженными ОТЕ на глубине 1800 отсчетов. Прямоугольные диаграммы представляют квантили, а ромбики обозначают среднее количество копий гена в каждом состоянии спаривания и в каждом состоянии изоляции. Буквы над графиками обозначают значимые различия между группами ( p <0,05, тест множественных сравнений Games-Howell).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200527.g002

Таксономический анализ

Состав микробных сообществ кишечника пчелиной матки сильно отличался от такового у рабочих.В кишечнике матки преобладали линии Acetobacteraceae (Alpha-2.1 и Alpha-2.2) и лактобациллы клады Firm-5 (рис. 3). Относительные пропорции типичных основных видов рабочих различались между IVQ и NVQ (например, Snodgrassella alvi ), а также между IMQ и NMQ (например, Gilliamella apicola ) с неизолированными матками, демонстрируя более высокие пропорции этих таксонов в каждая когорта спаривания (S1 Fig, p <0,05, критерий Краскела-Уоллиса). Доля этих основных видов была в основном низкой: во всех образцах было обнаружено <1% для этих таксонов, за исключением одного NVQ, у которого было ~ 5% S . alvi относительная численность. Абсолютная и относительная численность этих таксонов показана в таблице S4.

Рис. 3. Гистограммы абсолютной и относительной численности бактериальных таксонов в образце.

a) Абсолютное обилие видов бактерий в образцах маток, разделенных по состоянию спаривания и изоляции, а также по колонии происхождения. Гистограммы были построены путем умножения общего количества копий 16S рРНК на пропорции относительной численности, а затем деления таксон-специфичных групп на количество оперонов 16S рРНК, наблюдаемых в соответствующих полных геномах.б) Относительное количество видов бактерий в образцах, разделенных по состоянию спаривания и изоляции, а также по колонии происхождения.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200527.g003

Что касается абсолютной численности видов, то лактобациллы клады Firm-4 и Firm-5 были более многочисленными в IVQ, чем в NVQ (рис. 4A; p <0,05). , Краскал-Уоллис). Лактобациллы Alpha-2.1 и Firm-4 были более многочисленными в IMQ по сравнению с NMQ (рис. 4B; p <0,05, Kruskal-Wallis).

Рис. 4. Ящичковые диаграммы, на которых сравнивается средняя абсолютная численность конкретных таксонов между изолированными и неизолированными группами маток.

Средняя абсолютная численность таксономических линий у маток из а) девственных групп (собранных через 4 дня после выведения) или б) спарившихся групп (собранных через 14 дней после вылупления). Коробчатые диаграммы показывают сравнение таксонов между изолированными и неизолированными матками (* = p <0,05, N.S. = p > 0,05, критерий Краскалла-Уоллиса).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0200527.g004

PCA расстояний Брея-Кертиса, который основан на наличии и численности OTU, был проведен для всех образцов. В этом анализе рабочие обоих возрастных классов были сгруппированы вместе, и были обнаружены значительные различия между рабочими как группой и матками (включая оба состояния спаривания) как группой (рис. 5). Однако не было обнаружено значительных различий между группами, когда изолированное и неизолированное состояния были исследованы в рамках состояний спаривания матки (девственница по сравнению со спариванием; p > 0.05, Адонис ПЕРМАНОВА). Таким образом, у рабочих было отчетливое микробное сообщество кишечника, тогда как у маток, независимо от точки отбора проб или статуса изоляции, отдельных сообществ не было. Вместе анализ относительной и абсолютной численности показывает, что изоляция после эклозии оказала наибольшее влияние на абсолютный размер сообщества кишечника матки, а не на его видовой состав, что отражено в общем профиле или присутствии конкретных членов бактериального сообщества.

Рис. 5. Графики PCA Брея-Кертиса состава кишечного микробного сообщества.

Графики PCA были основаны на выборке OTU на глубине 1800 считываний. а) График всех образцов, закодированных по состоянию спаривания. Желтый внешний эллипсоид обозначает площадь, занятую рабочими, а внутренний эллипсоид показывает плотное скопление 14-дневных рабочих. Существенные различия наблюдались между рабочими и состояниями спаривания (спаривание или девственница) маток (Adonis PERMANOVA, R ² = 0,39; F _4,43 = 6,88; p <0,001). б) Только девственные матки (4 дня после заключения).c) Только участок с вязкой маток (14 дней после выпадения). Существенных различий между изолированными и неизолированными матками в двух возрастных группах не наблюдалось ( p > 0,05, Adonis PERMANOVA). Расстояния основаны на взвешенном по численности анализе Брея-Кертиса.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200527.g005

Обсуждение

Мы обнаружили, что в кишечных микробных сообществах маток медоносных пчел преобладают Acetobacteraceae и лактобациллы на ранних этапах развития матки (на 4-й день после появления всходов) и перехода в основном к линиям Acetobacteraceae (в основном Alpha-2.1) по мере старения матки (14-й день после появления всходов; рис. 3). Наше исследование воспроизвело результаты предыдущих исследований, которые показали, что у маток медоносных пчел отсутствует стабильная основная микробиота, связанная с рабочими, и они обладают гораздо менее разнообразными и менее устойчивыми бактериальными сообществами, чем рабочие того же возраста [31,32].

Изоляция девственных маток от медсестер на ранних этапах их жизненного цикла (72 часа изоляции, начиная с первого дня после появления на свет) привела к появлению маток с более крупными и разнообразными кишечными микробными сообществами по сравнению с девственными матками, которые не были изолированы (IVQ по сравнению с NVQ).Этот эффект не уменьшался со временем, а становился более серьезным по мере старения маток и спаривания (рис. 2). Действительно, образцы NMQ, отобранные через 14 дней после эклозии, имели наименьшее количество копий гена 16S рРНК по сравнению с любой из выбранных групп (среднее значение = 6,16 ± 0,4 SD log ₁₀ копий гена 16S рРНК), тогда как у изолированных маток эквивалентного возраста (IMQ) было значительно больше копий гена 16S рРНК. Копии гена 16S рРНК (среднее значение = 6,97 ± 0,66 SD log ₁₀ копий гена 16S рРНК). Кроме того, измерения абсолютной численности показали, что в IVQ наблюдались большие доли лактобацилл Firm-4 и Firm-5, которые в меньшей степени сохранялись в более старых IMQ (рис. 3 и 4).

Наш окончательный отбор образцов проводился у молодых маток после начала размножения. Однако королевы медоносных пчел могут жить несколько лет, и отбор проб маток старше нескольких недель может показать, сохраняется ли влияние ранней изоляции на микробиом матки на протяжении значительной части ее жизни [2].

Результаты предыдущего исследования [31] напоминали наши результаты для маток, которые были изолированы в раннем взрослом возрасте. В этом исследовании бактериальные сообщества, взятые у маток, увеличивались в размере по мере созревания маток, а у взрослых маток микробиомы были аналогичного размера по сравнению с рабочими из той же колонии.Если королевы в этом исследовании действительно столкнулись с периодом сегрегации после эклозии (который авторы этого исследования не указали), то результаты нашего и предыдущего исследования согласуются друг с другом. Другие потенциальные мешающие факторы, которые могут повлиять на размер микробиома зрелой королевы и которые могли привести к различиям между исследованиями, включают гигиеническую генетику, географию и питание. Например, в нашем исследовании использовались близкородственные сестринские королевы, и другие генотипы потенциально могли показать разные паттерны микробиома.Однако на сегодняшний день A . mellifera рабочих показали довольно постоянный состав микробиома в разных колониях и местах [42–48], что позволяет предположить, что генотипические вариации не имеют большого влияния на микробиом кишечника медоносных пчел.

Мы обнаружили, что изоляция молодых маток, которая предотвращает полный контакт с медсестрами в раннем возрасте, приводит к последующему увеличению размера кишечного бактериального сообщества, альфа-разнообразия и количества кишечников, в которых преобладают единичные таксоны.Таким образом, полный контакт с медсестрами в первые дни взрослой жизни, по-видимому, сокращает последующий размер микробиома королевы. Механизмы, лежащие в основе этих эффектов, не ясны, но они могут включать активацию собственной иммунной системы королевы в начале взрослой жизни [65], социальный иммунитет [27] или прерывание доступа к антимикробным веществам, предоставляемым медсестрами молодым маткам [ 3]. Социальный иммунитет потенциально включает элементы, подобные тем, которые описаны у муравьев и термитов [66–68], включая передачу эндокринных факторов для активации иммунной системы королевы или передачу антимикробных пептидов от медсестер королеве.Недавнее исследование [69] задокументировало перемещение молекул дцРНК между пчелами в пределах колонии через маточное молочко, которое передается от пчел-кормилиц к личинкам. Поскольку этот перенос продолжается в зрелом возрасте у взрослых кошек, ранняя изоляция потенциально может повлиять на такой перенос и изменить экспрессию генов и иммунную функцию у маток. Дальнейшее изучение того, как матки приобретают и регулируют свой микробиом, поможет нам лучше понять, как можно улучшить здоровье маток медоносных пчел в коммерческих операциях по выращиванию маток.

Подтверждающая информация

S1 Рис.

Средняя относительная численность таксономических линий у маток, которые принадлежали к одной из двух групп: а) девственные, собранные через 4 дня после выпадения, или б) спарившиеся, собранные через 14 дней после выпадения. Коробчатые диаграммы показывают сравнение таксонов между изолированными и неизолированными матками (* = p <0,05, критерий Краскалла-Уоллиса).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200527.s001

(EPS)

Благодарности

Мы благодарим Кима Хаммонда за понимание методов пчеловодства и помощь с цифрами.Эта работа была частично поддержана финансированием Джулианы Рэнджел за счет награды USDA-NIFA (2015-67013-23170) и проекта «Хэтч» Техасского университета A&M (TEX09557), а Нэнси Моран — награды Национального научного фонда «Измерения биоразнообразия» (1415604). награда Национального института здравоохранения (1R01GM108477-01).

Ссылки

1. 1. Крозье Р. Х., Памило П. Эволюция колоний социальных насекомых: определение пола и родственный отбор. Оксфорд, Великобритания: Издательство Оксфордского университета; 1996 г.
2. 2. Winston ML. Биология медоносной пчелы. Кембридж, Массачусетс, США: Издательство Гарвардского университета; 1987.
3. 3. ЛеКонт Й., Хефец А. Феромоны праймера в социальных перепончатокрылых. Анну Рев Энтомол. 2008; 53: 523–42. pmid: 17877458
4. 4. Слессор К.Н., Уинстон М.Л., ЛеКонт Ю. Феромонная связь у медоносной пчелы. J Chem Ecol. 2005. 31 (11): 2731–45. pmid: 16273438
5. 5. Кочер С.Д., Грозингер СМ. Сотрудничество, конфликт и эволюция феромонов королевы.J Chem Ecol. 2011; 37: 1263–75. pmid: 22083225
6. 6. Кочер С.Д., Ричард Ф., Тарпи Д.Р., Грозингер С.М., Государственный штат Северная Каролина. Репродуктивное состояние королевы регулирует выработку феромонов и взаимодействие маток и рабочих у медоносных пчел. Behav Ecol. 2009; 20: 1007–14. pmid: 22476212
7. 7. Ричард Ф., Тарпи Д.Р., Грозингер СМ. Влияние количества осеменения на физиологию пчелиной матки. PLoS One. 2007; 2 (10): e980. pmid: 17
   7
8. 8. Ниньо Е.Л., Малка О., Хефец А., Тил П., Хейс Дж., Грозингер С.М.Влияние объема осеменения матки медоносной пчелы ( Apis mellifera L .) На поведение и физиологию рабочих. J. Insect Physiol. 2012; 58: 1082–9. pmid: 22579504
9. 9. Рангель Дж., Бёрёчки К., Шаль С., Тарпи ДР. Репродуктивный потенциал королевы медоносной пчелы ( Apis mellifera ) влияет на состав феромонов нижней челюсти матки и реакцию свиты рабочих. PLoS One. 2016; 11 (6): e0156027. pmid: 27281328
10. 10. Панкив Т., Уинстон М.Л., Слессор К.Н. Поведение матки рабочих медоносных пчел ( Apis mellifera L .), которые высоко и низко реагируют на феромон нижней челюсти королевы. Insectes Soc. 1995. 42 (4): 371–8.
11. 11. Melathopoulos AP, Winston ML, Pettis JS, Pankiw T. Влияние феромона нижней челюсти матки на инициацию и поддержание маточников у медоносной пчелы ( Apis mellifera L .). Может Энтомол. 1996. 128: 263–72.
12. 12. Петтис Дж. С., Уинстон М. Л., Коллинз А. М.. Подавление выращивания маток у европейских и африканизированных медоносных пчел ( Apis mellifera L .) синтетическим феромоном нижней челюсти королевы. Insectes Soc. 1995; 42: 113–21.
13. 13. Петтис Дж. С., Хиго Х.А., Панкив Т., Уинстон М.Л. Подавление выращивания матки у медоносных пчел — признак плодовитости. Insectes Soc. 1997; 44: 311–22.
14. 14. Батлер CG, Fairey EM. Роль матки в предотвращении оогенеза рабочих пчел. J Apic Res. 1963; 2 (1): 14–8.
15. 15. СЭР Гувер, К.И. Килинг, Уинстон М.Л., Слессор К.Н. Влияние феромонов королевы на развитие яичников медоносных пчел.Naturwissenschaften. 2003; 90: 477–80. pmid: 14564409
16. 16. ВанЭнгельсдорп Д., Тарпи Д.Р., Ленгерих Э.Дж., Петтис Дж.С. Синдром идиопатической болезни расплода и события маток как предвестники гибели колоний при мигрирующих операциях пчеловодства на востоке США. Ранее Vet Med. 2013. 108 (2–3): 225–33. pmid: 22939774
17. 17. Рангель Дж., Келлер Дж., Тарпи ДР. Влияние репродуктивного потенциала матки медоносной пчелы ( Apis mellifera L .) На рост колонии.Insectes Soc. 2013; 60: 65–73.
18. 18. Лоскотова Ю., Перутка М., Веселый В. Носовые болезни маток медоносных пчел. Apidologie. 1980. 11 (2): 153–61.
19. 19. Camazine S, Cakmak I, Cramp K, Finley J, Fisher J, Frazier M и др. Насколько здоровы американские королевы медоносных пчел промышленного производства? Ам Би Дж. 1998; 138.
20. 20. Рангель Дж., Тарпи ДР. Митициды в улье и их влияние на суперседу матки и рост колоний медоносной пчелы ( Apis mellifera ).J Environ Anal Toxicol. 2016; 6 (3).
21. 21. Кульханек К., Штайнхауэр Н., Ренних К., Карон Д.М., Сагили Р.Р., Петтис Дж. С. и др. Национальное исследование ежегодных потерь пчелиных семей в США за 2015–2016 гг. J Apic Res. 2017; 56 (4): 328–40.
22. 22. Зейтц Н., Трейнор К.С., Штайнхауэр Н., Ренних К., Уилсон Э., Эллис Дж. Д. и др. Национальное исследование ежегодных потерь пчелиных семей в США в 2014–2015 гг. J Apic Res. 2016; 54 (4): 292–304.
23. 23. ВанЭнгельсдорп Д., Хейс мл., Андервуд Р.М., Петтис Дж. Исследование потерь колоний медоносных пчел в США с осени 2007 г. по весну 2008 г. PLoS One. 2008. 3 (12): 8–13.
24. 24. Ранжел Дж., Сили Т. Д.. Деление колонии у медоносных пчел: размер и значение фракции роя. Insectes Soc. 2012; 59: 453–62.
25. 25. Laidlaw HH, Page RE. Выращивание маток и пчеловодство. Чешир, Мичиган, США: Wicwas Press; 1997.
26. 26. Пауэлл Дж. Э., Мартинсон В. Г., Урбан-Мид К., Моран Н. А.. Пути получения микробиоты кишечника медоносной пчелы Apis mellifera .Appl Environ Microbiol. 2014. 80 (23): 7378–87. pmid: 25239900
27. 27. Эванс Дж. Д., Спивак М. Социализированная медицина: индивидуальные и коллективные барьеры болезней у медоносных пчел. J Invertebr Pathol. 2010; 103 (ПРИЛОЖЕНИЕ 1): 62–72.
28. 28. Мартинсон В.Г., Данфорт Б.Н., Минкли Р.Л., Рюппелл О., Тингек С., Моран Н.А. Простая и характерная микробиота, связанная с медоносными пчелами и шмелями. Mol Ecol. 2011; 20 (3): 619–28. pmid: 21175905
29. 29. Чжэн Х., Пауэлл Дж. Э., Стил М. И., Дитрих С., Моран Н. А..Микробиота кишечника медоносной пчелы способствует увеличению веса хозяина за счет метаболизма бактерий и гормональных сигналов. Proc Natl Acad Sci. 2017; 114 (18): 4775–80. pmid: 28420790
30. 30. Кох Х., Шмид-Хемпель П. Социально передаваемая кишечная микробиота защищает шмелей от кишечных паразитов. Proc Natl Acad Sci USA. 2011. 108 (48): 19288–92. pmid: 22084077
31. 31. Tarpy DR, Mattila HR, Newton ILG. Развитие микробиома кишечника медоносной пчелы на протяжении всего процесса выращивания матки.Appl Environ Microbiol. 2015; 81 (9): 3182–91. pmid: 25724964
32. 32. Kapheim KM, Rao VD, Yeoman CJ, Wilson BA, White BA, Goldenfeld N, et al. Кастовые различия в микробных сообществах задней кишки медоносных пчел ( Apis mellifera ). PLoS One. 2015; 10 (4): 1–14.
33. 33. Корби-Харрис В., Снайдер Л.А., Шван М.Р., Маес П., Макфредерик К.С., Андерсон К.Э. Происхождение и действие Acetobacteraceae Alpha 2.2 на личинок медоносных пчел и описание Parasaccharibacter apium , gen . ноя ., сп . ноя . Appl Environ Microbiol. 2014. 80 (24): 7460–72. pmid: 25239902
34. 34. Мартинсон В.Г., Мой Дж., Моран Н.А. Установление характерных кишечных бактерий во время развития пчелы. Appl Environ Microbiol. 2012. 78 (8): 2830–40. pmid: 22307297
35. 35. Райманн К., Шаффер З., Моран Н.А. Воздействие антибиотиков нарушает микробиоту кишечника и увеличивает смертность пчел. PLoS Biol. 2017; 15 (3): e2001861.pmid: 28291793
36. 36. R Core Team. R: Язык и среда для статистических вычислений. Вена, Австрия; 2013.
37. 37. Капорасо Дж. Г., Лаубер С. Л., Уолтерс В. А., Берг-Лайонс Д., Хантли Дж., Фирер Н. и др. Сверхвысокопроизводительный анализ микробного сообщества на платформах Illumina HiSeq и MiSeq. ISME J. 2012; 6 (8): 1621–4. pmid: 22402401
38. 38. Cai L, Ye L, Hin A, Tong Y, Lok S, Zhang T. Смещенные показатели разнообразия, выявленные бактериальными пиротагами 16S, полученными из различных наборов праймеров.PLoS One. 2013; 8 (1): 1–11.
39. 39. Елоэ-фадрош Е.А., Иванова Н.Н., Войке Т., Кирпидес NC. Обнаружение микробного разнообразия. Nat Microbiol. 2016; 1 (4): 1–4.
40. 40. Karst SM, Dueholm MS, Mcilroy SJ, Kirkegaard RH, Nielsen PH, Albertsen M. Получение миллиона высококачественных полноразмерных микробных последовательностей гена 16S и 18S рРНК без смещения праймеров. Nat Biotechnol. 2018; 36 (2): 190–5. pmid: 292

41. 41. Дело RJ, Boucher Y, Dahllo I, Holmstro C, Doolittle WF, Kjelleberg S.Использование генов 16S рРНК и rpoB в качестве молекулярных маркеров для исследований микробной экологии J Appl Environ Microbiol. 2007. 73 (1): 278–88.
42. 42. Бабендрайер Д., Джоллер Д., Ромейс Дж., Биглер Ф., Видмер Ф. Структуры бактериального сообщества в кишечнике медоносных пчел и их реакция на два инсектицидных белка. FEMS Microbiol Ecol. 2007. 59 (3): 600–10. pmid: 17381517
43. 43. Кокс-Фостер Д.Л., Конлан С., Холмс Е.С., Паласиос Г., Эванс Д.Д., Моран Н.А. и др. Метагеномное исследование коллапсов.Наука. 2007; 318: 283–7. pmid: 17823314
44. 44. Квонг В.К., Моран Н.А. Сообщества кишечных микробов социальных пчел. Nat Rev Microbiol. 2016; 14 (6): 374–84. pmid: 27140688
45. 45. Jeyaprakash A, Hoy MA, Allsopp MH. Бактериальное разнообразие взрослых особей рабочих Apis mellifera capensis и Apis mellifera scutellata (Insecta: Hymenoptera) оценивалось с использованием последовательностей 16S рРНК. J Invertebr Pathol. 2003. 84 (2): 96–103. pmid: 14615218
46. 46.Моран Н.А., Хансен А.К., Пауэлл Дж.Э., Сабри З.Л. Отличительная микробиота кишечника медоносных пчел оценивалась с помощью глубокого отбора проб у отдельных рабочих пчел. PLoS One. 2012; 7 (4): 1–10.
47. 47. Ан Дж. Х, Хонг И. П., Бок Джи, Ким Б., Сон Дж., Веон Х.Й. Пиросеквенирующий анализ бактериальных сообществ в кишечнике медоносных пчел Apis cerana и Apis mellifera в Корее. J Microbiol. 2012; 50 (5): 735–45. pmid: 23124740
48. 48. Дисаятханооват Т., Янг JPW, Хельгасон Т., Чантаваннакул П.Анализ T-RFLP бактериальных сообществ в средней кишке медоносных пчел Apis mellifera и Apis cerana в Таиланде. FEMS Microbiol Ecol. 2012. 79 (2): 273–81. pmid: 22092273
49. 49. Caporaso JG, Kuczynski J, Stombaugh J, Bittinger K, Bushman FD, Costello EK, et al. Соответствие: QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Нормализация интенсивности улучшает цветовой вызов в секвенировании SOLiD. Нат методы. 2010. 7 (5): 335–6. pmid: 20383131
50. 50.Сент-Джон Дж. SeqPrep [программное обеспечение] [Интернет]. [цитируется 13 февраля 2017 г.]. Доступно по ссылке: https://github.com/jstjohn/SeqPrep
51. 51. Эдгар RC. Поиск и кластеризация на порядки быстрее, чем BLAST. Биоинформатика. 2010. 26 (19): 2460–1. pmid: 20709691
52. 52. Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T., Yarza P, et al. Проект базы данных генов рибосомных РНК SILVA: улучшенная обработка данных и веб-инструменты. Nucleic Acids Res. 2013; 41 (D1): 590–6.
53. 53. Кариво Д.П., Пауэлл Дж. Э., Кох Х., Винфри Р., Моран Н. А.. Изменения в микробных сообществах кишечника и их связь с инфекцией патогенов у диких шмелей ( Bombus ). ISME J. 2014; 8 (10): 2369–79.
54. 54. Ван Кью, Гроссмейстер Гаррити, Тидже Дж. М., Коул Дж. Р. Наивный байесовский классификатор для быстрого отнесения последовательностей рРНК к новой бактериальной таксономии. Appl Environ Microbiol. 2007. 73 (16): 5261–7. pmid: 17586664
55. 55. Стаматакис А.RAxML-VI-HPC: филогенетический анализ на основе максимального правдоподобия с использованием тысяч таксонов и смешанных моделей. Биоинформатика. 2006. 22 (21): 2688–90. pmid: 16928733
56. 56. Клаэссон М.Дж., ван Синдерен Д., О’Тул П.В. Lactobacillus phylogenomics — К реклассификации рода. Int J Syst Evol Microbiol. 2008. 58 (12): 2945–54.
57. 57. Макфредерик QS, Wcislo WT, Тейлор Д.Р., Ishak HD, Дауд SE, Мюллер UG. Окружающая среда или родственники: откуда пчелы получают ацидофильные бактерии? Mol Ecol.2012. 21 (7): 1754–68. pmid: 22340254
58. 58. Капорасо Дж. Г., Биттингер К., Бушман Ф. Д., Десантис Т. З., Андерсен Г. Л., Найт Р. PyNAST: гибкий инструмент для выравнивания последовательностей по матричному выравниванию. Биоинформатика. 2010. 26 (2): 266–7. pmid: 19

    1

59. 59. Пакет программ Giraudoux P.R «pgirmess». [программное обеспечение] [Интернет]. 2017 [цитируется 13 февраля 2017 г.]. Доступно по ссылке: https://cran.r-project.org/web/packages/pgirmess/index.html
60. 60. Уикхэм Х. ggplot2 Элегантная графика для анализа данных.Нью-Йорк, США: Springer-Verlag; 2009.
61. 61. Йост Л. Энтропия и разнообразие. Ойкос. 2006. 113 (2): 363–375.
62. 62. Программный пакет Peters G.R «userfriendlyscience». [Программное обеспечение] [Интернет]. 2017 [цитируется 23 мая 2018 г.]. Доступно по адресу: https://cran.r-project.org/web/packages/userfriendlyscience/index.html
63. 63. Оксанен Дж., Бланше Ф.Г., Киндт Р., Лежандр П., Минчин П.Р., О’Хара Р.Б. и др. веган: Community Ecology Package [программное обеспечение] [Интернет].Доступно по ссылке: https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html
64. 64. Андерсон MJ. Дистанционные тесты на однородность многомерных дисперсий. Биометрия. 2006. 62 (1): 245–53. pmid: 16542252
65. 65. Контрерас-Гардуно Дж., Ланц-Мендоса Х., Франко Б., Нава А., Педраса-Рейес М., Каналес-Ласкано Дж. Иммунное праймирование против насекомых: экология и экспериментальные данные. Ecol Entomol. 2016; 41: 351–366.
66. 66. Гамильтон К., Лежен Б.Т., Розенгаус РБ.Трофаллаксия и профилактика: социальный иммунитет у муравьев-плотников Camponotus pennsylvanicus . Biol Lett. 2011; 7 (1): 89–92. pmid: 20591850
67. 67. Угельвиг Л. В., Кремер С. Социальная профилактика: групповое взаимодействие способствует коллективному иммунитету в колониях муравьев. Curr Biol. 2007. 17 (22): 1967–71. pmid: 17980590
68. 68. Traniello JFA, Rosengaus RB, Savoie K. Развитие иммунитета у социального насекомого: доказательства группового содействия устойчивости к болезням.Proc Natl Acad Sci. 2002. 99 (10): 6838–42. pmid: 12011442
69. 69. Маори Э, Гарбиан Ю., Куник В., Мозес-Кох Р., Малка О., Калев Х., Сабат Н., Села И., Шафир С. 2018. Путь передачи РНК у медоносных пчел. biorxiv. https://doi.org/10.110/299800

границ | Роль динамики патогенов и экспрессии иммунных генов в выживании одичавших медоносных пчел

Введение

Одичание — это процесс, с помощью которого ранее одомашненные организмы создают популяции в дикой природе в отсутствие антропогенного влияния (Gering et al., 2019а). Результаты одичания обычно изучаются в эволюционном контексте, исследуя, как экологические и генетические факторы влияют на приспособленность одичавших организмов по сравнению с их домашними источниками. Было высказано предположение, что из-за генетических узких мест и искусственного отбора в процессе одомашнивания приспособленность снижается за пределами неволи, из-за чего дикие организмы демонстрируют пониженную приспособленность при повторной интродукции в дикую природу (Araki et al., 2009; Baskett and Waples, 2013; Meyer and Пуругганан, 2013).Однако дикие организмы часто процветают (например, кошки, собаки, свиньи) и не всегда возвращаются к «дикому типу» (Taylor et al., 1998; Bellard et al., 2017). Действительно, одичавшие организмы часто превосходят численностью своих диких собратьев и могут приводить к сдвигам в составе сообщества на уровне экосистемы за счет увеличения давления хищников на доступную добычу и потенциального распространения патогенов на дикие виды (Leiser et al., 2013; Bevins et al., 2014; Maeda et al., 2019; Lepczyk et al., 2020). Эти экологические последствия одичания привлекают все больше внимания из-за их последствий для природоохранной биологии и управления экосистемами.

Дикие организмы часто взаимодействуют как с одомашненными, так и с дикими видами и играют важную экологическую роль в динамике патогенов, общих для этих близкородственных групп. Повышенная плодовитость и расширение географических ареалов, являющиеся результатом процессов одомашнивания, часто приводят к появлению больших неконтролируемых популяций диких организмов, укрывающих инфекции и служащих мостом между одомашненными и дикими хозяевами (Bevins et al., 2014). Это случай одичавших свиней ( Sus scrofa domestica ), вида, который имеет высокие темпы воспроизводства, высокую нагрузку патогенными микроорганизмами и частично совпадает с домашними свиньями ( S.scrofa domestica ) и кабанов ( S. scrofa ) (Taylor et al., 1998; Hill et al., 2014). Передача нескольких патогенов, включая вирусы и бактерии, была задокументирована от одичавших свиней домашним свиньям и диким кабанам, что вызывает опасения по поводу роли диких организмов как резервуаров передачи патогенов как диким, так и одомашненным популяциям (Cvetnic et al., 2003; Le Potier et al., 2006; Meng et al., 2009).

Экологические условия одичания могут способствовать толерантности или устойчивости к болезням.С патогенами одомашненных видов обычно борются люди, чтобы избежать быстрого распространения болезней среди домашних животных. Напротив, передача патогенов в одичавших популяциях не контролируется. Таким образом, в этих условиях взаимодействия хозяин-патоген в одичавших популяциях могут способствовать быстрой эволюции естественных механизмов устойчивости или устойчивости к болезням (LeConte et al., 2007; Locke, 2016). Таким образом, поддержание характеристик, связанных с устойчивостью к болезням, может быть ослаблено у одомашненных видов, в то время как большая способность смягчать негативные эффекты патогенов имеет решающее значение для выживания диких организмов (Moreira et al., 2018).

Одичавшие колонии медоносной пчелы ( Apis mellifera L.) представляют собой идеальную модель для исследования гипотезы о том, что динамика патоген-хозяин во время одичания способствует более высокому проявлению защитных сил и устойчивости к болезням у одичавших организмов. Apis mellifera — эусоциальный вид пчел, который подвергся обширным усилиям по одомашниванию по таким признакам, как увеличение производства меда, снижение агрессивного поведения и уменьшение частоты роения (Lecocq, 2018). Управляемые колонии медоносных пчел часто колонизируют дикую среду и становятся одичавшими, потому что колонии размножаются путем роения (Winston, 1991).Как одомашненные, так и одичавшие медоносные пчелы сталкиваются с серьезными проблемами из-за большого количества вредителей и патогенов (Calderone, 2012; Mcmahon et al., 2016). Одним из основных факторов, приводящих к болезням и потере колоний среди медоносных пчел, является эктопаразитарный клещ Varroa destructor , который действует как переносчик множественных заражающих пчел РНК-вирусов, которые значительно ослабляют колонии и снижают их выживаемость в период перезимовки (Gisder et al., 2009). ; Мартин и др., 2012). Клещи Варроа и связанные с ними вирусы считаются основными антагонистами здоровья медоносных пчел, и из-за их сильного воздействия на выживаемость медоносных пчел управляемые семьи часто обрабатывают химическими акарицидами несколько раз в год для уменьшения численности клещей.Если не лечить, большинство пчелиных семей погибает в течение первого года (Kraus and Page, 1995; LeConte et al., 2010). Тем не менее, было документально подтверждено, что колонии одичавших медоносных пчел долгое время выживали в дикой природе в отсутствие пчеловодства, где клещей и вирусы Varroa не контролируются искусственно и, следовательно, могут оказывать сильное селективное давление на семьи (Локк, 2016) .

Предыдущие исследования показали, что колонии одичавших медоносных пчел могут проявлять более высокий иммунный ответ, чем управляемые колонии (Youngsteadt et al., 2015, но см. Lowe et al., 2011). Однако неясно, как экспрессия различных иммунных фенотипов в управляемых и диких условиях связана с выживанием колоний и устойчивостью к паразитам или толерантностью к ним. Медоносные пчелы полагаются как на индивидуальные, так и на социальные механизмы иммунитета для защиты колонии от вредителей и патогенов, и управление, вероятно, влияет на оба типа защиты (Neumann and Blacquière, 2017; Taric et al., 2020). В то время как поведенческие реакции, такие как гигиеническое поведение, играют ключевую роль в защите от патогенов (Simone-Finstrom, 2017), гуморальные иммунные ответы у отдельных пчел также имеют решающее значение для защиты от патогенов и контроля инфекций (Di Prisco et al., 2016; McMenamin et al., 2018). В иммунный ответ против вирусов, бактерий и грибков вовлечены несколько иммунных путей. Например, антимикробные пептиды (AMP), продуцируемые несколькими иммунными путями (например, Toll и Imd), играют ключевую роль в иммунной системе насекомых (Yi et al., 2014; Brutscher et al., 2015). Путь РНК-интерференции (RNAi) — это путь противовирусной защиты у насекомых, нацеленный на специфичную для последовательности двухцепочечную РНК, образующуюся во время репликации РНК-вируса (Gammon and Mello, 2015).

Здесь мы исследуем роль патогенных инфекций и экспрессии иммунных генов в выживании одичавших и выращиваемых медоносных пчел, чтобы ответить на следующие вопросы: (1) являются ли дикие колонии резервуарами патогенов с повышенным уровнем патогенов по сравнению с управляемыми колониями ?; (2) приводит ли повышенный уровень патогенов к более высокой экспрессии иммунных генов в одичавших колониях, чем в управляемых колониях ?; (3) коррелирует ли экспрессия иммунного гена с выживаемостью семей медоносных пчел? В течение двухлетнего периода мы собирали образцы одичавших и управляемых колоний в одних и тех же ландшафтах с участием пчеловодов, сообщивших о местонахождении колоний.Весной и осенью 2017 и 2018 годов мы собрали особей из 44 колоний, чтобы сравнить экоиммунологию и выживаемость колоний на пасеках и в дикой природе. Вирус, наиболее непосредственно связанный с заражением клещами Varroa (DWV), был обнаружен на значительно более высоких уровнях в одичавших, чем в управляемых колониях, а экспрессия большинства иммунных генов также была выше в одичавших колониях. Мы также идентифицировали два иммунных гена, которые связаны с выживанием колоний и потенциально могут использоваться в качестве биомаркеров здоровья в колониях медоносных пчел.

Материалы и методы

Сбор проб

Мы создали совместный научный проект сообщества по поиску колоний одичавших медоносных пчел в штате Пенсильвания, США. Участники сообщили о местонахождении одичавших колоний, отправив данные о местоположении колоний с помощью GPS на веб-портал или по электронной почте. Для включения в исследование все одичавшие колонии должны были пережить хотя бы одну зиму в диких, неконтролируемых условиях. Мы проверили каждую зарегистрированную колонию ранней весной, чтобы подтвердить активность и записать продолжительность перезимовки (рис. 1).Мы объединили каждую дикую колонию с одной управляемой колонией, расположенной в радиусе семи миль, чтобы контролировать различия между колониями, расположенными в географических областях с разными ландшафтами и климатами. Всего в лабораторные анализы были включены восемь пар диких и управляемых колоний ( n = 16 колоний) в 2017 г. и 17 пар ( n = 34) в 2018 г. (Рисунок 2). В случае, когда из управляемой колонии не удавалось отобрать пробу второй раз из-за смерти или по другим причинам, одичавшая колония была объединена с другой управляемой колонией в том же месте (между 2017 и 2018 годами n = 3; между весна и осень 2018 г., n = 1).Это привело к отбору образцов 20 уникальных диких колоний и 24 уникальных управляемых колоний (дополнительный лист данных 1). Кроме того, нам не удалось получить данные о статусе перезимовки одной управляемой колонии в 2018 г., поэтому они не были включены в анализ выживаемости при перезимовании. Из-за гибели либо управляемой, либо одичавшей колонии в паре, в 2017 и 2018 годах были отобраны только две пары колоний.

Рис. 1. Полости, используемые колониями одичавших медоносных пчел, включенных в исследование. (A) Колония, обитающая в дупле дерева с обильным прополисом у входа в гнездо в Саксонбурге (Пенсильвания, США). (B) Колония диких животных, гнездящаяся внутри стены дома в Нью-Вифлееме (Пенсильвания, США) (C) Вход в гнездовье колонии диких животных в заброшенном сарае в долине Харрисон (Пенсильвания, США).

Рис. 2. Географическое расположение диких и управляемых колоний, отобранных в данном исследовании. (A) Карта Северной Америки с указанием местоположения Пенсильвании на северо-востоке Соединенных Штатов. (B) Расположение одичавших (кружки) и управляемых (квадраты) колоний, отобранных в 2017 г. (C) Расположение одичавших (кружки) и управляемых (квадраты) колоний, отобранных в 2018 г. Цвет каждой формы соответствует относительному Уровни DWV (2 ^{–ΔΔ CT} значений), зарегистрированные осенью для этой колонии. Расположение колоний приблизительное и было немного скорректировано из-за пересечения точек. GPS-координаты каждой колонии можно найти в дополнительном листе данных 1.

Мы отобрали около 75 пчел-собирателей у входа в каждую колонию весной (март – июнь) и осенью (август – октябрь) (даты в дополнительном листе данных 1).У индивидуумов отбирали пробы с помощью воздушных сеток от насекомых и переносили в конические пробирки объемом 50 мл, которые помещали на сухой лед для сохранения качества РНК перед долгосрочным хранением при -80 ° C. Все участки отбора проб находились в частной собственности, и было получено разрешение от землевладельцев. Конкретное местонахождение и контактная информация участников не разглашались. В этих исследованиях не участвовали охраняемые или находящиеся под угрозой исчезновения виды.

Выбор патогенов и иммунных генов

Чтобы охарактеризовать динамику болезни в семьях медоносных пчел, мы количественно определили три патогена, которые обычно заражают медоносных пчел и негативно влияют на здоровье пчел. Вирус деформированного крыла (DWV) — это РНК-вирус, который считается наиболее опасным патогеном медоносных пчел из-за его повсеместности, глобального распространения и роли в потерях медоносных пчел за зиму (Martin et al., 2012; Brutscher et al., 2016 ). Он может передаваться горизонтально и вертикально в пределах колонии, но также эффективно передается клещами Varroa , которые могут увеличивать титр этого вируса, приводя к явным клинически симптоматическим инфекциям (Gisder et al., 2009; Möckel et al., 2011). Мы также количественно определили вируса черной маточников (BQCV), еще одного РНК-вируса, который широко распространен среди взрослых медоносных пчел во всем мире, но преимущественно влияет на стадии незрелых пчел (предкуколки и куколки) (Mondet et al., 2014). BQCV передается вертикально и горизонтально между взрослыми особями и от взрослых пчел развивающимся пчелам, но не было показано, что он передается клещами Varroa (Chen et al., 2006). BQCV может также иметь синергетическое взаимодействие с другими патогенами из-за его корреляции с вирусами и грибковым паразитом Nosema ceranae Fries (D’Alvise et al., 2019). Nosema ceranae является распространенным кишечным паразитом медоносных пчел, вызывающим сокращение продолжительности жизни инфицированных пчел (Higes et al., 2008; Goblirsch, 2018). Мы количественно определили этот патоген во всех колониях, взятых в 2018 г.

Чтобы охарактеризовать экспрессию иммунных генов в диких и управляемых колониях, мы количественно оценили экспрессию транскриптов шести генов ( argonaute — 2, vago, pgrp-s2, pgrp-lc, дефенсин-1 и hymenoptaecin ) от нескольких иммунных путей. .Было показано, что гены argonaute — 2 ( ago2 ) и vago из пути РНКи активируются после вирусной инфекции (Brutscher et al., 2015). Ген pgrp-s2 кодирует расположенный выше рецептор распознавания, участвующий в активации Toll-иммунного пути, а pgrp-lc кодирует трансмембранный белковый активатор Imd (иммунодефицитного) пути. Оба эти гена активируются у инфицированных патогенами медоносных пчел (Evans et al., 2006; Brutscher et al., 2017). Кроме того, мы количественно оценили гены, соответствующие двум антимикробным пептидам (AMP), дефенсину-1 (Def1) и гименоптецину (Hym), продуцируемым путями Toll и Imd. Эти AMP играют ключевую роль в иммунном ответе медоносных пчел на вирусы, бактериальные и грибковые патогены (Yi et al., 2014; Brutscher et al., 2015).

Экстракция РНК и количественная ПЦР

Для экстракции тотальной РНК мы вырезали брюшко у тридцати пчел на каждую колонию, удаляя жала, заднюю и среднюю кишки.Десять абдоменов на образец (по три образца на колонию) объединяли в пробирки на 2,0 мл с пробирками для лизиса BashingBead диаметром 2,0 мм (Zymo Research, Ирвин, Калифорния, США) и гомогенизировали с использованием BeadBlaster ^TM 24 (Benchmark Scientific, Эдисон, Нью-Джерси, США). США) со скоростью 6,0 м / с в течение трех 30-секундных интервалов. Мы экстрагировали РНК из гомогената с использованием спин-колонок RNeasy (QIAGEN, Hilden, Германия) в соответствии с протоколом производителя и элюировали водой, свободной от нуклеаз. Мы оценили количество и качество РНК с помощью многорежимного микропланшетного ридера SpectraMax iD3 (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Мы количественно оценили три патогена и экспрессию шести иммунных генов с помощью количественной ПЦР с обратной транскриптазой (qRT-PCR) с использованием ранее разработанных последовательностей праймеров (Таблица 1). Три экстракта РНК от объединенных особей на колонию индивидуально использовали в качестве матриц для получения кДНК с использованием случайных праймеров и MultiScribe RT в соответствии с протоколом производителя (Applied Biosystems, Foster City, CA, США). Для синтеза каждой кДНК использовали всего 2 мкг РНК. Для каждой реакции кПЦР использовали всего 40 нг кДНК.Мы проводили реакции в 384-луночных планшетах с использованием системы ПЦР в реальном времени QuantStudio 5 (Applied Biosystems). Каждая лунка содержала 5 мкл Luna Universal qPCR Master Mix (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США), 0,25 мкл каждого из прямого и обратного праймеров (10 мкМ), 2,5 мкл не содержащего нуклеаз H ₂ O и 2 мкл матрицы кДНК. Были использованы следующие условия реакции: 60 с при 95 ° C для начальной денатурации, затем 40 циклов по 15 с при 95 ° C для денатурации и 30 с при 60 ° C для отжига, удлинения и сбора данных с последующей кривой плавления. анализ 15 с при 95 ° C, 60 с при 60 ° C и 1 с при 95 ° C для определения специфичности продуктов амплификации.В каждом планшете мы провели все реакции в трех экземплярах и включили отрицательные контроли воды, свободной от нуклеаз, для каждого набора праймеров. После изучения трех референсных генов ( ef1-alpha, eIFS8 и GAPDh2 ) мы определили, что фактор элонгации 1-альфа ( ef1-alpha ) был подходящим референсным геном из-за его аналогичного уровня экспрессии в все образцы, и мы использовали его в качестве эталонного гена для этих экспериментов (Таблица 1).

Таблица 1. Последовательности прямого и обратного праймеров, используемых для количественной оценки патогенов и иммунных генов с помощью количественной ПЦР.

Мы определили значение Ct для каждого образца, взяв среднее значение трех технических повторов. Мы использовали значение Ct для контрольного гена и вычитали его из значения Ct для мишени, чтобы получить значения ΔCt для каждого образца. Затем эти значения ΔCt были нормализованы для управляемой колонии с самой низкой относительной численностью (наивысшим ΔCt) цели за этот период отбора проб (весна или осень года, в котором были взяты пробы), с получением значений ΔΔCt.Затем мы рассчитали относительные количества транскриптов, используя метод 2 ^{–ΔΔ CT} (Livak and Schmittgen, 2001). Поскольку в каждой колонии было три образца по десять пчел в каждой, мы взяли среднее значение 2 ^{–ΔΔ CT} для трех биологических повторностей и использовали его для последующих анализов.

Для абсолютного количественного определения количества копий DWV в образцах, собранных осенью каждого года, мы использовали синтетическую ДНК, соответствующую последовательности DWV, амплифицированной нашими праймерами, в виде фрагментов гена gBlocks (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA, United States), производя десятикратные разведения (10 ¹ –10 ⁷ копий синтетической ДНК), запускаемые в каждом планшете кПЦР.Мы рассчитали количество копий по формуле: количество копий = концентрация ДНК (нг / мл) × 6,02 × 10 ²³ (копий / моль) / длина (140 п.н.) × 6,6 × 10 ¹¹ (Wu et al., 2017). Затем были нанесены логарифмические числа копий ДНК со значениями Ct, что позволило получить линейные стандартные кривые для каждого планшета кПЦР, что позволило оценить количество копий DWV в каждом образце.

Статистический анализ

Из-за ненормальности 2 значения ^{–ΔΔ CT} были преобразованы логарифмически и проанализированы с помощью обобщенных линейных моделей (GLM) с распределением Гаусса с использованием функции glm в пакете R ‘stats’ (R Core Team, 2019) .Относительное выражение каждой цели анализировалось отдельно с использованием управления (дикое или управляемое), времени выборки (весна или осень 2017 или 2018) и их взаимодействия как фиксированных эффектов. Двусторонний дисперсионный анализ ANOVA использовался для проверки общих эффектов управления и времени выборки на целевое выражение. Затем расчетные маржинальные средние были рассчитаны с помощью функции emmeans в R-пакете emmeans (Lenth, 2020). Эти значения затем использовались для апостериорных тестов с поправкой Тьюки для множественных сравнений для определения различий в относительной целевой численности между дикими и управляемыми колониями в каждый момент времени.Чтобы оценить связь между уровнями патогенов и экспрессией иммунных генов среди всех образцов, мы рассчитали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена, используя функцию cor.test в пакете R «stats».

Для оценки роли экспрессии иммунных генов, уровней патогенов и управления в выживаемости при перезимовании мы использовали лог-линейную обобщенную линейную смешанную модель (GLMM) с биномиальным распределением с использованием функции glmer в R-пакете lme4 (Bates et al. , 2015). Первоначальная полная модель включала данные по осеннему периоду обоих лет с выживаемостью после перезимовки в качестве переменной ответа, а также относительные уровни DWV и BQCV, относительную экспрессию всех шести иммунных генов и управление в качестве фиксированных эффектов, а также год выборки в качестве случайной эффект.Мы использовали обратный выбор модели, чтобы определить фиксированные эффекты, которые существенно повлияли на модель. Мы рассчитали коэффициенты инфляции дисперсии (VIF) для модели, используя функцию vif в R-пакете «автомобиль» (Fox and Weisberg, 2019). Все значения VIF были меньше 3, и, таким образом, все фиксированные эффекты были сохранены в окончательной модели. В конечном итоге была выбрана модель с наименьшим значением AIC. Все анализы проводились в R версии 3.6.2.

Результаты

Уровни патогенов

Наши результаты показывают, что средние уровни DWV были значительно выше в одичавших колониях по сравнению с управляемыми колониями осенью 2017 года ( P <0.05, z = −2,470), но не в другие моменты времени ( P > 0,05) (таблица 2 и рисунок 3). Уровни BQCV и N. ceranae не различались между группами ( P > 0,05). Все 44 колонии дали положительный результат на присутствие DWV и BQCV во все моменты времени, в то время как присутствие N. ceranae было более изменчивым во времени (дополнительный рисунок 1). Из 34 протестированных колоний N. ceranae было обнаружено в восьми диких и 11 управляемых колониях весной (47.1% и 65% соответственно), а осенью 12 одичавших и 10 управляемых колоний (76% и 59% соответственно).

Таблица 2. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа на обобщенных линейных моделях (GLM), оценивающих влияние времени, управления и их взаимодействия на уровни патогенов и экспрессию иммунных генов.

Рис. 3. Коробчатые диаграммы , показывающие относительную численность патогенов в одичавших (синий) и управляемых (красный) семьях медоносных пчел для каждого периода отбора проб.Относительная численность = 2 ^{–ΔΔ CT} значений для каждой колонии (расчеты описаны в основном тексте). В 2017 г. n = 8 пар колоний. В 2018 г. n = 17 пар колоний. Горизонтальная линия каждого прямоугольника представляет собой медианное значение, а круги — выбросы. Звездочка обозначает статистическую значимость (* P <0,05).

Экспрессия иммунного гена

Весной 2017 г. в одичавших колониях наблюдалась более высокая средняя экспрессия пяти из шести протестированных иммунных генов ( дефенсин-1 , гименоптецин , pgrp-lc , pgrp-s2 и ago2 ). , хотя уровни патогенов существенно не различались между управляемыми и одичавшими колониями (Таблица 2 и Рисунок 4).Осенью 2017 года экспрессия дефенсина-1 , гименоптацина , pgrp-s2 оставалась более высокой в ​​одичавших колониях, в то время как гена vago имела более высокую среднюю экспрессию в управляемых колониях. В 2018 году экспрессия иммунных генов была сходной в одичавших и управляемых колониях, но в одичавших колониях средняя экспрессия гименоптацина и pgrp-s2 была выше весной, независимо от аналогичных уровней патогенов в одичавших и управляемых колониях.Осенью 2018 г. не наблюдалось значительных различий в средней экспрессии генов между одичавшими и управляемыми колониями. Интересно, что в этот момент давление патогенов также было схожим.

Рис. 4. Коробчатые диаграммы , показывающие экспрессию иммунных генов одичавших (синий) и управляемых (красный) семей медоносных пчел для 2017 г. ( n = 8 пар колоний) и 2018 ( n = 17 пар колоний). Относительная численность = 2 ^{–ΔΔ CT} значений для каждой колонии (расчеты описаны в основном тексте).Горизонтальная линия каждого прямоугольника представляет собой медианное значение, а круги — выбросы. Звездочки обозначают статистическую значимость (* P <0,05, *** P <0,001).

Корреляция Спирмена (ρ) показала, что уровни DWV положительно коррелировали с экспрессией гименоптецина весной (ρ = 0,32), но не коррелировали в значительной степени с уровнями каких-либо других патогенов или иммунных генов, в то время как уровни BQCV положительно коррелировали с N. ceranae уровней весной (ρ = 0.48). Уровни Nosema ceranae также положительно коррелировали с экспрессией дефенсина-1 и pgrp-s2 осенью (ρ = 0,39; ρ = 0,35, соответственно). Тем не менее, все коэффициенты корреляции между уровнями патогенов и экспрессией иммунных генов были низкими (р <0,4) (Mukaka, 2012), что позволяет предположить, что факторы, отличные от уровней патогенов, вероятно, способствуют экспрессии иммунных генов (дополнительная таблица 1).

Выживание при зимовке

Общая выживаемость колоний за зиму 2017–2018 гг. Составила 63% как для одичавших, так и для управляемых колоний.Зимой 2018–2019 гг. Выживаемость составила 47% и 38% для одичавших и управляемых колоний соответственно. Из пяти диких колоний, переживших зиму 2017–2018 гг., Две также пережили зиму 2018–2019 гг. В оба года были отобраны две управляемые колонии, одна из которых также пережила зиму 2018–2019 гг. Несмотря на схожую общую выживаемость между управляемыми и одичавшими колониями, более одичавшие, чем управляемые колонии выжили с высоким числом копий DWV (> 10 ⁷ ) (дополнительный рисунок 2).

Лучшая прогностическая модель выживаемости при перезимовании включала контроль, уровни DWV и экспрессию гименоптацина , vago и pgrp-s2 в качестве фиксированных эффектов (AIC = 65.5). Уровень DWV в колонии отрицательно коррелировал с выживаемостью после перезимовки (DWV: P <0,05, стандартная ошибка оценки коэффициента = 0,06). Управление и экспрессия pgrp-s2 также отрицательно коррелировали с выживаемостью после перезимовки, хотя ни один из них не был значимым предиктором (Управление: P = 0,105, se = 0,877; pgrp-s2 : P = 0,062, se = 0,51) (Рисунок 5). Экспрессия hymenoptaecin и vago достоверно положительно коррелировала с выживаемостью ( hymenoptaecin : P <0.05, п.э. = 0,265; vago : P <0,05, н.э. = 0,757) (рисунок 5).

Рис. 5. Размеры эффекта обобщенной линейной смешанной модели (GLMM), показывающей оценки каждой переменной вместе с 95% доверительными интервалами. Звездочки обозначают переменные, которые были статистически значимыми предикторами выживаемости при перезимовании (* P <0,05). Оценки фиксированных эффектов: Управление = –1,422; Лог ( pgrp-s2 ) = –0,953; Log ( гименоптецин ) = 0.641; Лог ( ваго ) = 1,845; Журнал (DWV) = –0,124.

Обсуждение

В этом исследовании мы изучили экоиммунологию одичавших и управляемых пчел в течение двухлетнего периода. Наши результаты показывают, что в целом семьи одичавших медоносных пчел имеют более высокие уровни DWV, несмотря на годовые и сезонные колебания. С другой стороны, BQCV и N. ceranae , которые были постоянными в разные сезоны, не различались в зависимости от лечения и не были связаны с уменьшением выживаемости в этом исследовании. Хотя мы не исследовали эффективность передачи патогенов от одичавших медоносных пчелам, полученные нами, наши результаты подтверждают способность одичавших колоний служить резервуарами DWV.Мы также обнаружили доказательства более высокой экспрессии иммунных генов в одичавших колониях, даже в моменты времени, когда уровни DWV были одинаковыми в управляемых и одичавших колониях. Дальнейший анализ всех колоний показал, что уровни заражения DWV положительно коррелировали с экспрессией гименоптецина весной, а уровней N. ceranae коррелировали с дефенсин-1 и pgrp-s2 осенью. Сила корреляции была низкой, что указывает на то, что дополнительные факторы, такие как генетический фон и условия окружающей среды, играют важную роль в иммунных фенотипах.Наконец, мы обнаружили значительную связь между экспрессией двух иммунных генов ( гименоптецин и vago ) и выживаемостью как в одичавших, так и в управляемых колониях. Ранее было идентифицировано, что эти гены дифференциально экспрессируются у инфицированных вирусом медоносных пчел, но это первое сообщение о том, что экспрессия коррелирует со снижением смертности хозяев (Kuster et al., 2014; Ryabov et al., 2014). Дикие и управляемые колонии также имели схожую вероятность выживания, несмотря на более высокие титры DWV в одичавших колониях, чем в управляемых.

Выживание одичавших колоний в присутствии высоких вирусных титров предполагает, что одичание может способствовать проявлению признаков, которые придают толерантность к вирусу. Устойчивость к вирусу DWV ранее наблюдалась у устойчивых к клещам медоносных пчел в нескольких местах на протяжении многих лет, что позволяет предположить, что это передается по наследству (Locke et al., 2014; Russo et al., 2020). Кроме того, даже без митицидного лечения несколько одичавших колоний имели низкие уровни DWV, что позволяет предположить, что эти колонии могут проявлять дополнительные черты, такие как гигиеническое поведение для уменьшения количества клещей Varroa и, следовательно, присутствующих вирусов (дополнительный рисунок 2) (Wagoner et al. ., 2019). Естественный отбор является основным двигателем эволюции в динамике патоген-хозяин и позволяет организмам потенциально реагировать на многие стрессоры (Papkou et al., 2019). Методы управления одомашненными организмами меняют ландшафт приспособленности и могут изменить их эволюционные траектории (Wilkins et al., 2014; Nygren et al., 2015; Milla et al., 2018). Управляемые медоносные пчелы обычно находятся в разных условиях окружающей среды по сравнению с их дикими собратьями, и хотя методы пчеловодства часто направлены на ограничение численности патогенов, эти методы могут ослабить избирательное давление, которое патогены оказывают на управляемые семьи, потенциально задерживая коэволюцию паразита и хозяина (Neumann and Blacquière , 2017).В то время как управление пчеловодством с низким уровнем затрат снижает бремя патогенов и окислительный стресс по сравнению с коммерчески управляемыми семьями, высокоинвазивные методы пчеловодства могут вызвать дополнительный стресс (Taric et al., 2019). Несмотря на то, что степень борьбы с болезнями у пчеловодов сильно различается (Underwood et al., 2019), борьба с клещами Varroa может препятствовать адаптации для повышения устойчивости к клещам и вирусам в управляемых семьях медоносных пчел (Blacquière et al., 2019). В дополнение к толерантности к вирусу, другие черты, такие как небольшие размеры колоний, частое скопление людей, а также повышенное гигиеническое поведение и уход, по-видимому, имеют решающее значение для выживания одичавших колоний в присутствии высокого давления патогенов (Gramacho and Spivak, 2003; Seeley, 2007 ; Локк, 2016; Лофтус и др., 2016; Руссо и др., 2020). Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на предоставлении информации о молекулярных механизмах толерантности к болезням в этих одичавших колониях, чтобы непосредственно проверить роль одичания в изменении селективного давления и приводить к различным иммунным фенотипам у медоносных пчел.

Хотя механизмы толерантности к вирусу для насекомых все еще неизвестны, одним из возможных объяснений является способность сильно инфицированных пчел ограничивать чрезмерную реакцию иммунных ответов. Иммунные эффекторы, такие как про-фенолоксидаза, продуцируемые насекомыми, могут иметь цитотоксические эффекты, которые ограничивают распространение инфекций, но также вызывают повреждение тканей хозяина (Sadd and Siva-Jothy, 2006; Hillyer, 2016).Это самоповреждение может привести к старению и более высокой смертности в результате усиления воспаления (Alaux et al., 2010; Khan et al., 2017). Таким образом, устойчивые к вирусам колонии могут иметь механизмы, ограничивающие повреждение, вызванное воспалением. Второй возможный механизм включает трансгендерное иммунное праймирование, развитие иммунной памяти посредством вертикальной передачи иммунологического опыта, и его эффекты были продемонстрированы на нескольких беспозвоночных (Tetreau et al., 2019). Вертикальная передача DWV и тот факт, что королевы могут руководить колонией в течение нескольких лет, будут способствовать появлению иммунного потомства в одичавших колониях, в отличие от операций пчеловодства, где маток часто заменяют.Другой потенциальный механизм включает изменения вирулентности клещей DWV и Varroa в одичавших колониях. Известно, что генотипы DWV различаются по вирулентности, и передача клещом Varroa может способствовать определенным штаммам вируса (Рябов и др., 2019). В то время как наше исследование не оценивало уровни клещей Varroa или генетическое разнообразие DWV, предыдущая работа показала, что клещей Varroa из управляемых колоний имели более высокий прирост популяции по сравнению с клещами из одичавших колоний (Dynes et al., 2020), что свидетельствует о роли менеджмента в отборе клещей с более высокой репродуктивной способностью. Хотя конкретные механизмы неясны, отсутствие управления со стороны человека и процесс одичания могут привести к изменению вирулентности вируса и толерантности хозяина у медоносных пчел.

Помимо различного давления отбора, испытываемого одичавшими и управляемыми колониями, одичавшие колонии также могут иметь различный генетический фон, что способствует различиям в иммунных фенотипах и исходах болезней.Ранее López-Uribe et al. (2017) показали, что одичавшие и управляемые медоносные пчелы обнаруживают некоторую генетическую дифференциацию даже в небольших географических масштабах. Хотя мы приводим доказательства дифференциальной экспрессии иммунных генов между дикими и управляемыми колониями, роль происхождения и генетического разнообразия в этом различии остается неясной. Экспрессия иммунных генов является наследственной у медоносных пчел, и толерантность к вирусам также может иметь наследственную основу, что делает правдоподобным, что различный генетический фон играет важную роль в различных иммунных фенотипах, наблюдаемых между дикими и управляемыми колониями (Decanini et al., 2007; Тадури и др., 2019). Основополагающая изменчивость и наследуемость иммунологических признаков в сочетании с различными режимами отбора может привести к различным эволюционным траекториям одичавших и управляемых медоносных пчел.

Мы обнаружили более высокую экспрессию нескольких иммунных генов в одичавших колониях по сравнению с управляемыми колониями, что позволяет предположить, что одичание привело к усилению защиты от патогенов, хотя это не относится ко всем генам и различается в зависимости от времени отбора проб. В частности, мы обнаружили, что экспрессия hymenoptaecin была выше в одичавших колониях, тогда как экспрессия vago была выше в управляемых колониях.Однако оба гена были связаны с увеличением выживаемости колоний. Гименоптецин представляет собой общий АМП, участвующий в ответах на многие патогены, включая клещей DWV и Varroa (Evans et al., 2006; Kuster et al., 2014; Brutscher et al., 2015; Wu et al., 2020). Другие исследования показали, что этот ген постоянно активируется в ответ на патогены и во время травм у медоносных пчел и может быть потенциальным биомаркером для количественной оценки здоровья медоносных пчел (Galbraith et al., 2015; Brutscher et al., 2017; Дублет и др., 2017; Zanni et al., 2017). Мы также определили, что экспрессия vago важна для общего выживания колоний. Этот транскрипт экспрессируется при активации пути РНКи, который распознает дцРНК вирусов и приводит к повышенной экспрессии vago или его ортологов у комаров, плодовых мух, шмелей и медоносных пчел (Deddouche et al., 2008; Парадкар и др., 2012; Рябов и др., 2014; Ниу и др., 2016). Было показано, что у медоносных пчел, инфицированных DWV, экспрессия vago значительно повышена, что свидетельствует о его роли в противовирусном ответе (Ryabov et al., 2014). Насколько нам известно, это первое сообщение о том, что экспрессия vago напрямую связана с увеличением выживаемости медоносных пчел. Эти два гена можно рассматривать как биомаркеры здоровья медоносных пчел, которые можно использовать для прогнозирования способности колонии пережить зиму (López-Uribe et al., 2020). Кроме того, исследования на уровне генома, направленные на выявление признаков отбора в регуляторных областях иммунитета у медоносных пчел, также могут предоставить важную информацию о механизмах устойчивости к патогенам.

Одичавшие организмы представляют собой ценные системы для изучения потенциальных негативных последствий одомашнивания и антропогенного воздействия путем изучения взаимодействий между хозяином и патогеном организмов, которые недавно избежали управляемых условий (Burdon and Thrall, 2008; Gering et al., 2019b). Предыдущие исследования одичавших медоносных пчел изучали уровни заражения клещами, давление патогенов или комбинацию давления патогенов и экспрессии иммунных генов, но связь динамики патогена и хозяина с выживаемостью колонии ранее не исследовалась (Seeley, 2007; Thompson et al. ., 2014; Youngsteadt et al., 2015). Здесь мы количественно определили уровни патогенов, экспрессию иммунных генов и связали это с выживаемостью при перезимовании в управляемых и одичавших семьях медоносных пчел. Это позволило идентифицировать специфические гены, связанные с перезимованием медоносных пчел, и доказательства устойчивости к вирусу в одичавших колониях, связывая иммунитет, инфекцию и выживаемость в естественных условиях. Дальнейшее выявление генетических механизмов устойчивости к вирусам и биомаркеров здоровья пчел может помочь селекционным усилиям сосредоточить усилия на повышении этих характеристик в отобранных стадах медоносных пчел (например,g., Robertson et al., 2020), что снижает общие потери колоний для пчеловодства. В будущих исследованиях следует оценить роль одичания в динамике патогенов и экоиммунологии у других одомашненных видов.

Необработанные данные и сценарий R для воспроизведения статистического анализа этого исследования можно найти в Интернете в репозитории ScholarSphere: https://doi.org/10.26207/w2wv-ax07.

Авторские взносы

CH и MML-U разработали исследование.Сбор данных возглавил CH и KCE. KCE отвечал за переписку с членами сообщества и поиск семей медоносных пчел. CH провела анализ данных при поддержке CR и MML-U. CH и MML-U подготовили рукопись. Все авторы критически отредактировали рукопись и дали окончательное одобрение к публикации.

Финансирование

CH был поддержан Программой повышения квалификации выпускников Университета штата Пенсильвания в области комплексной экологии опылителей, финансируемой Программой стратегических сетевых инициатив Колледжа сельскохозяйственных наук Пенсильвании.CR был профинансирован за счет ассигнований на вывод NIFA Министерства сельского хозяйства США в рамках проекта PEN04652 и инвентарного номера 1016243. MML-U финансировался за счет ассигнований USDA NIFA в рамках проектов PEN04716, инвентарный номер 1020527 и PEN04620, инвентарный номер 1011873.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Джона Олбрайта, Росс и Пегги Белл, Кена Боумена, Чарльза Брудовски, Кэролайн Бург, Лу Капуцаль, Фрэн и Боба Кули, Лори Эмерсон, Стивена Финке, Билла Фишера, Марди Фрай, Дэрилн Хоффстот, Роберта Хоппе, Риту. и Ропер Хьюстон, Джастин Джейкобин, Бонни Кошик, Джеки Киммел, Томас Кретчик, Боб Лэндис, Дэрил Мартин, Хэнк и Патти Джо МакКленахан, Чарльз МакГи, Джош Неархуф, Стивен Репаски, Брюс Родригес, Эми Шарп, Ави Соммервилль, Джошуа Тайрон Урбану, Чарли Воришеку, Джону Венцеля и пчеловодам Пенсильвании (США) за участие в этом исследовании, а также Ассоциации пчеловодов штата Пенсильвания за их поддержку на протяжении всего проекта.Мы также благодарны Райану Форду за помощь с лабораторными анализами, Кристен Брошу за помощь в статистическом анализе, Каталине Мехиа за помощь с дизайном фигуры, Ромине Руссо за обсуждения экспериментального дизайна и Броку Харпуру, лаборатории Лопеса-Урибе и рецензентам за комментарии к предыдущим версиям рукописи.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fevo.2020.594263 / полный # дополнительный-материал

Дополнительный рисунок 1 | Распространенность патогенов в одичавших и управляемых колониях. Вирус деформированного крыла (DWV) и вирус черных маточников (BQCV) были обнаружены во всех колониях на всех этапах отбора проб. Присутствие Nosema ceranae было протестировано только в колониях, отобранных в 2018 году. Nosema ceranae было обнаружено в 47,1% и 76,47% одичавших колоний весной и осенью, соответственно, в то время как 64,7% и 58,8% управляемых колоний дали положительный результат на . Н.ceranae весной и осенью соответственно.

Дополнительный рисунок 2 | Номер копии DWV в одичавших и управляемых семьях медоносных пчел, которые умерли (Нет) и выжили (Да). Эффекты управления, выживаемость при перезимовании и их взаимодействие были проанализированы с использованием GLM с последующим анализом дисперсионного анализа для оценки их влияния на количество копий DWV (управление: df = 1, F = 2,895, P = 0,096; выживаемость при перезимовании: df = 1, F -значение = 4,281, P = 0.045).

Дополнительная таблица 1 | Корреляции патогенов и иммунных генов Спирмена для объединенных данных по диким и управляемым колониям, отобранным в 2017 и 2018 годах, с разбивкой по сезонам отбора проб. Звездочки обозначают статистическую значимость ( ^∗ P <0,1, ^∗∗ P <0,05, ^∗∗∗ P <0,001).

Дополнительный лист данных 1 | Сводка данных по колониям медоносных пчел, включая: дату отбора проб, рассчитанные 2 ^{–ΔΔ CT} значения экспрессии гена и патогена, продолжительность перезимовки, сокращенные координаты GPS и расстояние от спаренной колонии.

Список литературы

Араки Х., Купер Б. и Блуин М. С. (2009). Эффект переноса от разведения в неволе снижает репродуктивную способность потомков, рожденных в дикой природе. Biol. Lett. 5, 621–624. DOI: 10.1098 / RSBL.2009.0315

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баскетт, М. Л. и Ваплс, Р. С. (2013). Оценка альтернативных стратегий для минимизации непредвиденных последствий приспособленности культурных особей к диким популяциям. Консерв. Биол. 27, 83–94. DOI: 10.1111 / j.1523-1739.2012.01949.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейтс Д., Мехлер М., Болкер Б. М. и Уокер С. С. (2015). Подгонка линейных моделей смешанных эффектов с использованием lme4. J. Stat. Софтв. 67, 1–48. DOI: 10.18637 / jss.v067.i01

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Беллард, К., Рисман, Дж. Ф., Лерой, Б., Клод, К., и Мейс, Г. М. (2017). Глобальная картина угрозы биологического вторжения на острова. Нат. Ecol. Evol. 1, 1862–1869. DOI: 10.1038 / s41559-017-0365-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бевинс, С. Н., Педерсен, К., Лутман, М. В., Гидлевски, Т., и Делиберто, Т. Дж. (2014). Последствия, связанные с недавним расширением ареала неместных одичавших свиней. Bioscience 64, 291–299. DOI: 10.1093 / biosci / biu015

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Блакьер, Т., Бут, В., Калис, Дж., Моро, А., Нойман, П., и Панцира, Д. (2019). Дарвиновский отбор по «черному ящику» для устойчивости к оседающим инвазивным паразитам Varroa destructor у медоносных пчел. Biol. Вторжения 21, 2519–2528. DOI: 10.1007 / s10530-019-020010

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бручер, Л. М., Даугенбо, К. Ф., и Фленникен, М. Л. (2017). Транскрипционные реакции, запускаемые вирусами и дцРНК, выявляют ключевые компоненты противовирусной защиты медоносных пчел. Sci. Отчет 7: 6448.DOI: 10.1038 / s41598-017-06623-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бурдон, Дж. Дж., И Тралл, П. Х. (2008). Эволюция патогенов через агроэкологический интерфейс: значение для управления болезнями. Evol. Прил. 1, 57–65. DOI: 10.1111 / j.1752-4571.2007.00005.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кальдероне, Н. У. (2012). Культуры, опыляемые насекомыми, насекомые-опылители и сельское хозяйство США: анализ тенденций совокупных данных за период 1992–2009 гг. PLoS One 7: e37235. DOI: 10.1371 / journal.pone.0037235

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чен, Ю. П., Петтис, Дж. С., Коллинз, А., и Фельдлауфер, М. Ф. (2006). Распространенность и передача вирусов пчел. Заявл. Environ. Microbiol. 72, 606–611. DOI: 10.1128 / AEM.72.1.606-611.2006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Цветник, З., Митак, М., Очепек, М., Лойкич, М., Терзич, С., Jemersic, L., et al. (2003). Кабаны ( Sus scrofa ) как резервуары биовара 2 Brucella suis 2 в Хорватии. Acta Vet. Висела. 51, 465–473. DOI: 10.1556 / AVet.51.2003.4.4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Д’Алвиз П., Сибургер В., Гиринг К., Кибум М. и Хассельманн М. (2019). Сезонная динамика и закономерности совместной встречаемости патогенов медоносных пчел, выявленные с помощью высокопроизводительного анализа RT-qPCR. Ecol. Evol. 9, 10241–10252. DOI: 10.1002 / ece3.5544

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Деканини, Л. И., Коллинз, А. М., и Эванс, Дж. Д. (2007). Вариабельность и наследственность экспрессии иммунных генов больными пчелами. J. Hered. 98, 195–201. DOI: 10.1093 / JHERED

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Deddouche, S., Matt, N., Budd, A., Mueller, S., Kemp, C., Galiana-Arnoux, D., et al. (2008). DExD / H-бокс-геликаза Dicer-2 опосредует индукцию противовирусной активности у дрозофилы. Нат. Иммунол. 9, 1425–1432. DOI: 10.1038 / ni.1664

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ди Приско, Г., Анносиа, Д., Марджотта, М., Феррара, Р., Варриккио, П., Занни, В., и др. (2016). Мутуалистический симбиоз между паразитическим клещом и патогенным вирусом подрывает иммунитет и здоровье медоносных пчел. Proc. Natl. Акад. Sci. США 113, 3203–3208. DOI: 10.1073 / pnas.1523515113

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дублет, В., Poeschl, Y., Gogol-Döring, A., Alaux, C., Annoscia, D., Aurori, C., et al. (2017). Единство в защите: рабочие медоносных пчел демонстрируют консервативные молекулярные ответы на различные патогены. BMC Genomics 18: 207. DOI: 10.1186 / s12864-017-3597-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дайнс, Т. Л., Берри, Дж. А., Делаплан, К. С., де Руд, Дж. К., и Брози, Б. Дж. (2020). Оценка вирулентности клещей Varroa destructor при различных режимах содержания медоносных пчел. Apidologie 51, 276–289. DOI: 10.1007 / s13592-019-00716-6

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Evans, J. D., Aronstein, K., Chen, Y. P., Hetru, C., Imler, J.-L., Jiang, H., et al. (2006). Иммунные пути и защитные механизмы у медоносных пчел Apis mellifera . Insect Mol. Биол. 15, 645–656. DOI: 10.1111 / j.1365-2583.2006.00682.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фокс, Дж., И Вайсберг, С.(2019). Справочник по прикладной регрессии , 3-е изд. Таузенд-Окс, Калифорния: Сейдж.

Google Scholar

Гэлбрейт, Д. А., Янг, X., Ниньо, Э. Л., Йи, С., и Грозингер, К. (2015). Параллельные эпигеномные и транскриптомные ответы на вирусную инфекцию у медоносных пчел ( Apis mellifera ). PLoS Pathog. 11: e1004713. DOI: 10.1371 / journal.ppat.1004713

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гаммон Д. и Мелло К.(2015). Опосредованная РНК-интерференцией противовирусная защита у насекомых. Curr. Opin. Insect Sci. 8, 111–120. DOI: 10.1016 / j.cois.2015.01.006.RNA

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Геринг, Э., Инкорвайя, Д., Хенриксен, Р., Коннер, Дж., Гетти, Т., и Райт, Д. (2019a). Возвращаясь к природе: одичание животных и растений. Trends Ecol. Evol. 34, 1137–1151. DOI: 10.1016 / j.tree.2019.07.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Геринг, Э., Инкорвайя Д., Хенриксен Р., Райт Д. и Гетти Т. (2019b). Дезадаптация диких и домашних животных. Evol. Прил. 12, 1274–1286. DOI: 10.1111 / eva.12784

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Gisder, S., Aumeier, P., and Genersch, E. (2009). Вирус деформированного крыла: репликация и вирусная нагрузка у клещей ( Varroa destructor ). J. Gen. Virol. 90, 463–467. DOI: 10.1099 / vir.0.005579-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гоблирш, М.(2018). Nosema ceranae Болезнь медоносных пчел ( Apis mellifera ). Apidologie 49, 131–150. DOI: 10.1007 / s13592-017-0535-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грамачо, К. П., Спивак, М. (2003). Различия в обонятельной чувствительности и поведенческих реакциях медоносных пчел, разводимых для гигиенического поведения. Behav. Ecol. Sociobiol. 54, 472–479. DOI: 10.1007 / s00265-003-0643-y

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хигес, М., Мартин-Эрнандес, Р., Ботиас, К., Байлон, Э. Г., Гонсалес-Порто, А. В., Барриос, Л. и др. (2008). Как естественное заражение Nosema ceranae вызывает коллапс пчелиной семьи. Environ. Microbiol. 10, 2659–2669. DOI: 10.1111 / j.1462-2920.2008.01687.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hill, D. E., Dubey, J. P., Baroch, J. A., Swafford, S. R., Fournet, V. F., Hawkins-Cooper, D., et al. (2014). Надзор за дикими свиньями на предмет Trichinella spp.и Toxoplasma gondii в США и факторы, связанные с хозяином, связанные с инфекцией. Вет. Паразитол. 205, 653–665. DOI: 10.1016 / j.vetpar.2014.07.026

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Краус Б. и Пейдж Р. Э. (1995). Влияние Varroa jacobsoni (Mesostigmata: Varroidae) на одичавших Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) в Калифорнии. Environ. Энтомол. 24, 1473–1480. DOI: 10.1093 / EE / 24.6.1473

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кустер, Р.Д., Бонкристиани, Х. Ф., Рюппелл, О. (2014). Динамика иммуногена и вирусного транскрипта при инфицировании паразитарным клещом Varroa destructor развивающихся куколок медоносной пчелы ( Apis mellifera ). J. Exp. Биол. 217, 1710–1718. DOI: 10.1242 / jeb.097766

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ле Потье, М. Ф., Месплед, А., и Ванье, П. (2006). «Классическая чума свиней и другие пестивирусы», в Болезни свиней , 9-е изд., Ред. B.Э. Стро, Дж. Дж. Циммерман, С. Д’Аллер и Д. Дж. Тейлор (Oxford: Blackwell Publishing Ltd), 309–322.

Google Scholar

Lecocq, T. (2018). «Насекомые: игнорируемые истории одомашнивания», в «Одомашнивание животных» , изд. Ф. Телетчеа (Лондон: IntechOpen). DOI: 10.5772 / intechopen.81834

CrossRef Полный текст | Google Scholar

ЛеКонт, Ю., де Воблан, Г., Краузер, Д., Жанна, Ф., Руссель, Ж.-К., и Бекар, Ж.-М. (2007). Выжившие пчелиные семьи Varroa destructor . Apidologie 38, 566–572. DOI: 10.1051 / apido: 2007040

CrossRef Полный текст | Google Scholar

ЛеКонт, Ю., Эллис, М., Риттер, В. (2010). Клещи Варроа и здоровье медоносных пчел: может ли Варроа частично объяснить потери колонии? Apidologie 41, 353–363. DOI: 10.1051 / apido / 2010017

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лейзер, О. П., Корн, Дж. Л., Шмит, Б. С., Кейм, П. С., и Фостер, Дж. Т. (2013). Бруцеллез диких свиней в США и перспективные геномные методы для эпидемиологии болезней. Вет. Microbiol. 166, 1–10. DOI: 10.1016 / j.vetmic.2013.02.025

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лепчик, К. А., Хаман, К. Х., Сиземор, Г. К., и Фармер, К. (2020). Количественная оценка наличия колоний диких кошек и Toxoplasma gondii в отношении птичьих заповедников на Оаху, Гавайи. Консерв. Sci. Практик. 2: e179. DOI: 10.1111 / csp2.179

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Li, W., Эванс, Дж. Д., Хуанг, К., Родригес-Гарсия, К., Лю, Дж., Гамильтон, М., и др. (2016). Подавление молчания медоносной пчелы ( Apis mellifera ) гена голой кутикулы (nkd) улучшает иммунную функцию хозяина и снижает инфекций Nosema ceranae . Заявл. Environ. Microbiol. 82, 6779–6787. DOI: 10.1128 / AEM.02105-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ливак К. Дж. И Шмитген Т. Д. (2001). Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2-ΔΔCT. Методы 25, 402–408. DOI: 10.1006 / meth.2001.1262

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Локк, Б. (2016). Выжившие природные клещи Варроа Apis mellifera популяций медоносных пчел. Apidologie 47, 467–482. DOI: 10.1007 / s13592-015-0412-8

CrossRef Полный текст | Google Scholar