Джи си мед: Работа передвижных медицинских комплексов

Maintenant mon amour , allons manger.

Levez-vous et regardez-moi, mon amour .

Levez-vous et regardez-moi, mon amour .

Дезоле, mon amour . Pardonne-moi.

Ne vous inquiétez pas, mon amour .

Alors Oakland a tout mon amour .

Vous demeurerez ici, mon amour .

Je vais lui avouer mon amour .

Tes enfants veulent naître, mon amour .

Donne-moi le poisson chantant mon amour .

Je voudrais partager mon amour de Deventer.

Entendant je suis avec toi et mon amour t’enveloppe.

Je vous redis à tous tout mon amour .

Par l’Esprit Saint, je répandrai mon amour dans votre cœur.

Je suis aussi végétarienne à cause de mon amour pour les animaux.

Heureux celui qui orne sa tête du diadème из mon amour .

Je voudrais guérir tes Plaies от до .

J’ai exprimé tout mon amour pour toute l’humanité.

Валидация количественных эталонных генов ПЦР в реальном времени для определения сезонных профилей и профилей экспрессии генов в голове западной медоносной пчелы Apis mellifera

Abstract

Медоносная пчела не только считается важным опылителем в сельском хозяйстве, но также широко используется в качестве модельного насекомого в биологических науках благодаря своей высокоразвитой социальности, специализации разделения труда и гибкости управления колонией.Для интенсивного исследования сезонных и зависимых от рабочей силы моделей экспрессии его генов, точное количественное определение уровня транскрипции целевого гена является фундаментальным шагом. На сегодняшний день количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) широко используется для быстрой количественной оценки транскриптов генов с использованием надежных эталонных генов для нормализации. С этой целью в попытке поиска надежных референсных генов была определена эффективность амплификации шести кандидатов референсных генов ( rp49 , rpL32 , rpS18 , tbp , tub и gapdh ). .Впоследствии четыре гена ( rpL32 , rpS18 , tbp и gapdh ) с эффективностью ПЦР от 90% до 110% были оценены на стабильность их экспрессии с помощью трех программ (geNorm, NormFinder и BestKeeper) и использованы для нормализации сезонных паттернов экспрессии генов-мишеней в головах фуражиров и кормильцев. Хотя три программы показали несколько разные результаты, два гена, rpS18 и gapdh , были предложены в качестве оптимальных эталонных генов для определения сезонных профилей экспрессии генов и профилей экспрессии генов на основе qRT-PCR.Кроме того, совместное использование этих двух генов дало более точную нормализацию по сравнению с использованием одного гена в голове медоносной пчелы. Проверенные эталонные гены могут широко использоваться для количественной оценки экспрессии целевого гена в голове медоносной пчелы, хотя еще предстоит выяснить уровни экспрессии выбранных эталонных генов в конкретных тканях головы.

Образец цитирования: Moon K, Lee SH, Kim YH (2018) Проверка количественных эталонных генов ПЦР в реальном времени для определения сезонных и специфичных для рабочей силы профилей экспрессии генов в голове западной медоносной пчелы, Apis mellifera .PLoS ONE 13 (7): e0200369. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200369

Редактор: Wolfgang Blenau, Philipps-Universitat Marburg Fachbereich Biologie, ГЕРМАНИЯ

Поступила: 23 марта 2018 г .; Одобрена: 25 июня 2018 г .; Опубликован: 9 июля 2018 г.

Авторские права: © 2018 Moon et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемым Министерством науки, ИКТ и планирования будущего (2015R1D1A1A049 и 2017R1C1B2008699). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Западная медоносная пчела, Apis mellifera L., является основным опылителем как в природных, так и в сельскохозяйственных экосистемах. В Соединенных Штатах денежная стоимость медоносных пчел как коммерческих опылителей оценивается в более чем 15 миллиардов долларов в год: они опыляют почти 80% сельскохозяйственных фруктов и овощей. Медоносные пчелы также производят мед и другие продукты [1].В дополнение к своему коммерческому значению, медоносная пчела широко изучалась как модельный вид насекомых из-за ее высокоразвитой социальности, специализации разделения труда и гибкости управления колонией [2]. Многие задачи, связанные с поддержанием и ростом колонии, такие как расчистка ульев, выращивание расплода и добыча пищи, распределяются между рабочими пчелами в зависимости от возраста, явление, известное как полиэтиизм [3, 4]. После выхода из куколок отдельные пчелы выполняют различные поведенческие задачи в определенной последовательности [5].Самые молодые пчелы в первую очередь очищают клетки в течение 3 дней, после чего они кормят и ухаживают за личинками и маткой в ​​центральной части гнезда в течение нескольких дней (до 12 дней). С 13 по 20 день пчелы среднего возраста занимаются обслуживанием ульев и хранением пищи в периферийной области. На 20-й день пчелы защищают колонию у входа в улей в качестве сторожа, а через несколько дней они собирают нектар и пыльцу вне гнезда, пока не погибнут [6, 7].

Динамика численности пчелиных семей в регионах с умеренным климатом также имеет характерный сезонный характер.Популяция колонии состоит из нескольких тысяч пчел зимой, но летом увеличивается до десятков тысяч взрослых пчел [8]. Согласно недавнему исследованию [9], ранней весной, когда естественная деятельность по выращиванию расплода не была инициирована, искусственное добавление пыльцевого рациона ускоряло индукцию деятельности по выращиванию расплода. Зимующие ульи, демонстрирующие полное прекращение выращивания расплода, возобновили деятельность по выращиванию расплода, когда их поместили в клубничные теплицы с пыльцевой диетой.Кроме того, в сезон кормодобывания, когда высокоактивные ульи помещали в сетчатую палатку, деятельность по выращиванию расплода резко подавлялась; однако выращивание расплода было восстановлено после снятия сетчатой ​​палатки. Эти результаты убедительно подтверждают мнение о том, что пчелиные семьи быстро распознают изменения окружающей среды и активно реагируют на них. Как показано в предыдущих исследованиях [9–11], сезонные изменения в статусе эндокринной системы и экспрессии генов являются важными факторами, которые позволяют медоносным пчелам гибко управлять колониями посредством пассивного регулирования их популяции и разделения труда.

В этом контексте идентификация генов, участвующих в регуляции физиологии колоний и их сезонных моделей экспрессии, имеет важное значение для понимания сезонных изменений на молекулярном уровне, которые обеспечивают гибкость в управлении колониями медоносных пчел. Поскольку количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) является быстрым, чувствительным, воспроизводимым и точным методом, который широко используется для количественной оценки уровня экспрессии генов [12, 13], его можно использовать для анализа сезонных паттернов экспрессии гены, предположительно связанные с пластичностью в физиологии рабочих пчел.Для анализа различий в экспрессии целевых генов в разные сезоны требуется нормализация с использованием эталонных генов, чтобы компенсировать различия в количестве РНК в собранных сезонных образцах медоносных пчел. Следовательно, эталонные гены в идеале должны иметь постоянный уровень транскрипции как у пчел-кормилиц, так и у пчел-собирателей в течение годичного цикла и не должны изменяться по численности в ответ на факторы окружающей среды [14]. Как резюмировали Reim et al. (2013) идентификация и проверка референсных генов для qRT-PCR были выполнены на различных видах насекомых.У медоносных пчел эталонные гены были исследованы на разных стадиях развития [14], в мозге рабочих после бактериального заражения [15] и в мозге пчел разного возраста и социальных ролей [16]. Однако контрольные гены-кандидаты не прошли валидацию между пчелами-медсестрами и пчелами-фуражирами, собранными в течение годичного цикла. В настоящем исследовании, чтобы найти наиболее подходящие эталонные гены для количественной оценки экспрессии целевых генов с помощью qRT-PCR у рабочих с разными задачами в разные сезоны, мы ежемесячно собирали медсестер и собирателей в течение годичного цикла.Затем мы извлекли РНК из головы этих пчел и проверили шесть возможных эталонных генов, включая три рибосомных белка ( rp49 , rpL32 и rpS18 ), связывающий белок TATA-бокса ( tbp ), тубулин α -1 цепь ( tub ) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа ( gapdh ). Пригодность генов в качестве эталонов впоследствии была проанализирована с использованием трех программ (geNorm, NormFinder и BestKeeper) для нормализованного анализа.Кроме того, после выбора стабильно экспрессируемых референсных генов мы подтвердили эффект нормализации выбранных референсных генов на паттерны экспрессии ace2 , который кодирует ацетилхолинэстеразу 2 (AChE2).

Материалы и методы

Насекомые и подготовка проб

Поле пасеки в экспериментальном лесу Сеульского национального университета выдало разрешение на это исследование. Колонии А . mellifera (итальянский гибрид) содержали в основном на пасеке экспериментального леса Сеульского национального университета в Кванджу, Кёнгидо, Корея (37 ° 18 ‘43.2 ″ с.ш., 127 ° 18 ′ 40,8 ″ в.д.) во время сезона кормодобывания, а зимовали они в Гохыне, Чолла-Намдо, Корея (34 ° 30 ′ 38,0 ″ с.ш., 127 ° 19 ′ 00,8 ″ в.д.) [9]. С весны до осени медсестер и собирателей собирали в соответствии с их возрастом и поведением. Однако зимой молодые пчелы в центральном районе и старые пчелы в периферийной части гнезда были собраны в качестве нянек и собирателей, соответственно, в соответствии с нашим предыдущим исследованием [9]. Собранные образцы медоносных пчел из 10 выбранных колоний немедленно замораживали на сухом льду и хранили при -70 ° C до экстракции РНК.Среди этих 10 колоний, хранящихся при -70 ° C, три колонии (колонии 6, 8 и 10) были случайным образом выбраны и использованы для этого исследования.

Голов отделили от пяти собирателей и пяти медсестер и полностью гомогенизировали с помощью TRI Reagent ^® (MRC, Цинциннати, Огайо) с помощью блендера (Bertin Technologies, Монтиньи-ле-Бретонне, Франция). Полную РНК экстрагировали с помощью Direct-Zol ^™ RNA MiniPrep Plus (Zymo Research, Irvine, CA) из голов, а ДНКазу I обрабатывали во время процедуры экстракции РНК.Для проверки успешной деградации контаминантной ДНК после предыдущего исследования [14] были разработаны праймеры rp49 и для охвата интрона, что позволило выявить контаминацию геномной ДНК на основе размера ампликона (442 п.н. в случае контаминации геномной ДНК, в отличие от 150 п.н. в состоянии отсутствия геномной ДНК). Точно так же праймеры для rpS32 и tbp были разработаны для амплификации 152 и 99 пар оснований соответственно из кДНК, тогда как продукты ПЦР длиной 446 и 177 пар оснований должны быть обнаружены при загрязнении геномной ДНК (таблица S1 и таблица 1).Концентрацию и чистоту РНК измеряли в трех экземплярах с помощью спектрофотометра QuickDrop (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Экстрагированную РНК хранили при -70 ° C до использования.

Дизайн и клонирование грунтовки

Шесть референсных генов были отобраны на основе предыдущих исследований с некоторыми модификациями [14–16] (таблица S1). Чтобы обеспечить одинаковые свойства для каждого праймера и ампликона шести кандидатов и ace2 , праймеры были точно сконструированы с помощью программного обеспечения Oligo Calc (http: // biotools.nubic.northwestern.edu/OligoCalc.html) на основе информации о последовательностях выбранных генов, полученной из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для субклонирования возможных референсных генов суммарную РНК, экстрагированную из целых тел пяти случайно выбранных медоносных пчел, использовали в качестве матрицы для реакции ПЦР с обратной транскрипцией с помощью набора DiaStar ^™ OneStep RT-PCR (SolGent, Тэджон, Корея). Условия реакции: 50 ° C в течение 30 минут, затем 15 минут при 95 ° C (20 секунд при 95 ° C, 40 секунд при 55 ° C, 30 секунд при 72 ° C) × 35 циклов и 5 минут при 72 ° C, с ген-специфическими праймерами для каждой амплификации гена (таблица S1).Продукты ПЦР визуализировали в 1% агарозных гелях для обеспечения специфичности амплификации, очищали с помощью набора для очистки ПЦР QIAqick (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) и субклонировали в вектор pGEM ^® -T easy (Promega, Мэдисон, Мюнхен, США). ). Плазмиды трансформировали в химически компетентный DH5α , Escherichia coli (Zymo Research). Положительные клоны идентифицировали с помощью ПЦР колоний с использованием наборов универсальных праймеров M13 прямого и обратного M13. По крайней мере, три клонированных плазмиды секвенировали с использованием универсальных праймеров M13 с помощью анализатора ABI PRISM 3730XL (Macrogen, Сеул, Корея).После подтверждения последовательностей генов положительный E . Клоны coli инкубировали в жидкой среде LB при 37 ° C в течение 16 ч, и плазмиды выделяли с помощью набора Zyppy ^™ Plasmid Miniprep (Zymo Research) и использовали в качестве матриц ПЦР для расчета значений эффективности ПЦР.

Количественная ПЦР в реальном времени

Все реакции qRT-PCR были выполнены на системе обнаружения ПЦР в реальном времени CFX Connect ^™ (Bio-Rad, Hercules, CA) с использованием методологии CYBR ^® GREEN.Для определения эффективности ПЦР для построения стандартной кривой использовали три точки из серии 15-кратных разведений плазмидных ДНК (от 1 × 10 ^-2 мкг), содержащих каждый ген в качестве вставки. Каждый образец анализировали в трех экземплярах (технические повторы) в общем реакционном объеме 20 мкл, содержащем 5 мкмоль каждого праймера, 10 мкл 2 × Thunderbird CYBR qPCR Master Mix (Toyobo, Осака, Япония) и 2 мкл разбавленной плазмиды. . Реакции проводили при 95 ° C в течение 1 мин, затем (95 ° C в течение 15 секунд, 55 ° C в течение 15 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд) × 40 циклов.Специфичность продуктов ПЦР подтверждали анализом кривой плавления и гель-электрофорезом. Значения цикла количественной оценки (C _q ) определяли на той же линии порога флуоресценции. C _q для каждого гена получали путем расчета среднего арифметического трех повторов. Значения эффективности ПЦР для каждого гена рассчитывали по заданному наклону после построения стандартных кривых по следующей формуле: E = 15 ^{-1 / наклон} .

Для анализа паттернов экспрессии выбранного эталонного гена общая РНК была извлечена из головных проб трех колоний (колонии 6, 8 и 10), собираемых каждый месяц в течение года.КДНК первой цепи синтезировали из 1 мкг общей РНК с помощью обратной транскриптазы ReverTra Ace ^® (Toyobo) путем праймирования олиго (dT) в общем реакционном объеме 10 мкл. Для qRT-PCR каждый образец анализировали в двух экземплярах (технический повтор) в общем объеме реакции 20 мкл, содержащем 5 мкмоль каждого праймера, 10 мкл 2 × Thunderbird CYBR qPCR Master Mix (Toyobo) и 0,5 мкл кДНК. Реакции проводили при 95 ° C в течение 15 минут, затем (95 ° C в течение 15 секунд, 55 ° C в течение 15 секунд и 72 ° C в течение 30 секунд) × 40 циклов.Специфичность продуктов ПЦР подтверждали анализом кривой плавления. Значения C _q определяли на одной и той же пороговой линии флуоресценции (0,1) для каждого гена. Среднее значение и стандартная ошибка (SE) значения C _q были рассчитаны для трех разных колоний (т.е. трех биологических повторов), в которых среднее значение C _q каждой колонии было получено из двух технических повторов.

Проверка эталонного гена

После выбора стабильно экспрессируемых генов мы выбрали ace2 , кодирующий AChE2, в качестве целевого гена для проверки выбранных эталонных генов.Известно, что AChE2 медоносной пчелы обладает высокой ферментативной активностью в нервных тканях [17], и уровни экспрессии этого фермента значительно выше у медсестер, чем у собирателей [7], что указывает на то, что нейротрансмиссия, регулируемая AChE2, может участвовать в обонятельное и зрительное обучение и память. Для количественной оценки относительных уровней экспрессии ace2 , C _q значения ace2 и контрольных генов ( rps18, и gapdh ) были получены из одного и того же образца каждого месяца, а затем нормализованы методом относительной количественной оценки, модифицированным из исходная концепция 2 ^-ΔΔCq [18].Когда для нормализации использовались два контрольных гена, применялось среднее значение их значений C _q .

Анализ данных

SPSS для Windows версии 23.0 (IBM, Armond, NY, USA) использовался для всех статистических анализов в этом исследовании. Сезонные тенденции экспрессии четырех кандидатных эталонных генов (рис. 1A – 1D) и ace2, в качестве целевого гена, нормализованные с выбранными эталонными генами (рис. 2A и 2B), были статистически сопоставлены с помощью дисперсионного анализа ANOVA с повторными измерениями.Между собирателями и медсестрами, интегрированные уровни экспрессии четырех кандидатов референсных генов (рис. 1E) и нормализованного ace2 (рис. 2C) были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента. Кроме того, средний уровень экспрессии ace2 , нормализованный с различными эталонными генами в головах фуражиров и медсестер, был рассчитан по данным трех колоний за 12 месяцев и статистически сравнен с односторонним дисперсионным анализом ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки (рис. 2С).

Рис. 1. Паттерны экспрессии четырех кандидатов референсных генов в образцах голов собирателей и медсестер.

Сезонные паттерны экспрессии, обозначенные значениями цикла количественной оценки (C _q ) четырех кандидатов референсных генов в течение годичного цикла, представлены для собирателей и медсестер закрытым черным кружком и открытым белым кружком, соответственно (A-D). Значения C _q каждого гена в течение года у собирателей и медсестер были статистически проанализированы с помощью дисперсионного анализа с повторными измерениями (A-D). Среднее значение и стандартная ошибка значений C _q для каждого гена для головы фуражира (For) и головы кормилицы (Nur) были рассчитаны по данным трех колоний за 12 месяцев (E).Интегрированный уровень экспрессии каждого гена между собирателями и медсестрами был статистически проанализирован с помощью t-критерия Стьюдента (E).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200369.g001

Рис. 2. Паттерны экспрессии ace2 , нормализованные с каждым из двух эталонных генов и комбинацией двух генов в головах фуражиров и кормильцев.

Тенденции транскрипции ace2 в образцах голов собирателей (A) и медсестер (B) определяли с помощью qRT-PCR с использованием gapdh , rpS18 и нормализации с двумя эталонными генами.Тенденции экспрессии ace2 в течение годичного цикла, рассчитанные на ежемесячной основе для различных эталонных генов, были статистически проанализированы (ANOVA с повторными измерениями; Post-hoc: тест множественного сравнения Тьюки, P <0,05) (A и B). Средняя и стандартная ошибка уровней экспрессии ace2 , нормализованных с одним геном ( rpS18, или gapdh ) и комбинацией (два гена), были рассчитаны по данным трех колоний за 12 месяцев (C).Значения P между образцами фуражиров и медсестер были проанализированы с помощью t-критерия Стьюдента, в то время как интегрированные уровни экспрессии ace2 для собирателей и медсестер, проанализированные с различными эталонными генами (всего 6 образцов сравнения), сравнивались с односторонним дисперсионным анализом ANOVA с тестом множественного сравнения Тьюки. . Разные буквы указывают на существенно разные значения (P = 0,01).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200369.g002

Для расчета стабильности экспрессии гена-кандидата три программы geNorm (версия 3.1) [19], NormFinder (версия 0.953) [20] и BestKeeper (версия 1) [21]. GeNorm автоматически вычисляет значение стабильности экспрессии (M) для каждого референсного гена-кандидата и определяет среднюю попарную вариацию (V) гена с другими, чтобы оценить оптимальное количество референсных генов для точной нормализации. Ген с наименьшим значением M является наиболее стабильно экспрессируемым геном в анализе geNorm. NormFinder оценивает общую вариацию в кандидате референсного гена и вычисляет значение стабильности его экспрессии, при этом более низкие значения представляют более стабильные гены.BestKeeper определяет среднее геометрическое значений C _q генов и стандартное отклонение (SD), поэтому более низкие значения SD указывают на более стабильные гены. Кроме того, он вычисляет корреляцию (R ² ) каждого гена-кандидата с другими генами, после чего высококоррелированные гены-кандидаты объединяются для оценки значений P. Следовательно, в анализе BestKeeper ген-кандидат, обладающий более низкими SD, более низкими значениями P и более высоким R ² , указывает на более стабильный ген.В этом исследовании, чтобы найти оптимальные референсные гены, стабильность экспрессии референсных генов-кандидатов у собирателей и медсестер была отдельно проанализирована для изучения паттернов экспрессии целевых генов у разных пчеловодов, а затем необработанные данные qRT-PCR от фуражиров и медсестер. Медсестры были объединены, и стабильность генов была рассчитана с использованием трех программ для сравнительного исследования экспрессии целевых генов между собирателями и медсестрами (Таблицы 2 и 3 и Рис. 3).

Рис. 3. Оптимальное количество референсных генов для нормализации, рассчитанное с помощью geNorm.

Попарные вариации между коэффициентами нормализации (NF _n и NF _{n + 1} ) были отдельно проанализированы, чтобы определить оптимальное количество референсных генов для нормализации в образцах головы фуражира и головы медсестры (A). Чтобы сравнить экспрессию целевого гена между головами собирателя и кормилицы, оптимальное количество эталонных генов для нормализации было проанализировано с использованием объединенных данных, полученных от собирателя и медсестры (B).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200369.g003

Результаты

Специфичность и эффективность усиления

Перед проведением qRT-PCR мы подтвердили специфичность амплификации. Шесть потенциальных эталонных генов были первоначально амплифицированы с помощью ПЦР с обратной транскрипцией с использованием разработанных наборов праймеров (таблица S1), с общей РНК, экстрагированной из головы медоносных пчел в качестве матрицы, и ампликоны были визуализированы на 2% агарозном геле. Все ампликоны показали единственную полосу (S1 фиг.). Ген-специфическая амплификация генов была также подтверждена одним пиком в анализе температуры плавления в реальном времени.В частности, продукты ПЦР, амплифицированные с наборами праймеров rpL32 , rpS18 и tbp , предназначенные для определения контаминации геномной ДНК, визуализировались в виде единственной полосы на агарозном геле и единственного пика при анализе кривой плавления, что свидетельствует о полном расщепление геномной ДНК после обработки ДНКазой I. При расчете эффективности ПЦР пять кандидатов-референсных генов показали высокие коэффициенты линейной регрессии, превосходящие 0,99, за исключением rpL32 (0.9897; Таблица 1). Значения эффективности амплификации ПЦР, полученные с помощью qRT-PCR генов-кандидатов, варьировались от 82,6% до 107,6% (таблица 1), и мы выбрали четыре контрольных гена ( rpL32 , rpS18 , tbp и gapdh ). ) с эффективностью ПЦР от 90% до 110% для дальнейшей проверки референсного гена в этом исследовании.

Паттерны экспрессии референсных генов

Паттерны экспрессии четырех кандидатов референсных генов в образцах головы собирателей и медсестер исследовали в течение годичного цикла.В разных выборках и в разные сезоны четыре протестированных гена показали переменные значения C _q в диапазоне от 17,15 ± 0,373 ( rpS18, у медсестры в марте) до 29,58 ± 0,026 ( tbp, у медсестры в августе) (рис. ). Интересно, что уровни экспрессии rpL32 , rpS18 и gapdh были относительно ниже зимой (декабрь-январь) и жарким летом (август) как у собирателей, так и у медсестер (рис. 1). В случае tbp , однако, колебания в характере экспрессии были относительно низкими в течение года (рис. 1C).Хотя все гены демонстрировали сходные сезонные тенденции экспрессии между собирателями и медсестрами (рис. 1A – 1D), rpL32 (P = 0,033) (рис. 1A), rpS18, (P = 0,007) (рис. 1B) и gapdh (P = 0,003) (рис. 1D) показали статистически разные уровни экспрессии у двух рабочих. Напротив, наблюдались аналогичные значения C _q tbp (P = 0,152) (рис. 1C) между выборками фуражиров и голов медсестры. Когда средние уровни экспрессии четырех генов в головах, рассчитанные по значениям C _q за 12 месяцев, сравнивались между собирателями и медсестрами, общие уровни транскрипции не различались статистически ни для одного из генов (P> 0.05) (Рис. 1E).

Стабильность сезонной экспрессии референсных генов

Средние значения стабильности экспрессии (значения M) для каждого референсного гена были рассчитаны с помощью программы geNorm. Как показали предыдущие исследования, значение M ниже 1,5 (M <1,5) является приемлемым критерием для выбора эталонных генов qRT-PCR [13], трех генов-кандидатов со значениями M ниже 1,5 во всех анализах (собиратель, медсестра и собиратель + медсестра). ) были указаны как надежные эталонные гены для мониторинга сезонных моделей экспрессии целевого гена (таблица 2).Среди них rpS18 был наиболее стабильно экспрессирован у собирателей (M = 0,843), медсестер (M = 0,866) и комбинации двух рабочих (M = 0,840), за ним следовали gapdh и rpL32 , которые заняли первое место в рейтинге. как второй и третий по стабильности гены соответственно. С другой стороны, tbp показал наиболее нестабильную экспрессию во всех образцах (таблица 2). Кроме того, с помощью geNorm было рассчитано оптимальное количество референсных генов для точной нормализации (рис. 3).Анализ парных вариаций показал, что V _2/3 было ниже, чем V _3/4 как у собирателей, так и у медсестер (рис. 3A). В интегрированных данных от собирателя и кормилицы V _2/3 также был ниже, чем V _3/4 (рис. 3B). Таким образом, исходя из средних значений M четырех кандидатов (таблица 2), комбинация rpS18, и gapdh считается эталонным геном выбора для нормализации, чтобы определить паттерны экспрессии целевого гена у двух разных пчел. задач или в сравнении собирателей и медсестер в течение годичного цикла с помощью qRT-PCR.

Согласно анализу NormFinder, gapdh показал наиболее стабильный ген экспрессии, тогда как tbp был наименее стабильным геном во всех выборках (Таблица 2). Рейтинг стабильности от наиболее стабильного (наименьшее значение стабильности) до наименее стабильного (наибольшее значение стабильности) гена составлял: gapdh> rpS18 > tbp > rpL32 во всех образцах (таблица 2).

На основе стандартного отклонения (SD) значений C _q , значения стабильности для экспрессии четырех возможных эталонных генов были рассчитаны с использованием BestKeeper.Наиболее стабильные гены были определены по самому низкому стандартному отклонению. Анализ BestKeeper показал, что tbp был наиболее стабильным геном у головы фуражира (SD = 1,53), у головы медсестры (0,77) и для комбинации двух задач (0,86) (таблица 3). По оценке SD, rpL32 оказался наименее стабильным геном во всех выборках. Однако при перекрестном сравнении, когда индекс BestKeeper рассчитывался на основе парной корреляции между генами, tbp не коррелировали в значительной степени с другими генами, на что указывает относительно низкий коэффициент детерминации (R ² ) и высокий P значение (P> 0.001) (таблица 3). В голове собирателя четыре кандидата ( tbp , rpS18 , gapdh и rpL32 ) значимо коррелировали с индексом BestKeeper, рассчитанным как среднее геометрическое значений C _q других генов, тогда как три гена ( gapdh , rpS18 и rpL32 ) показали значительную корреляцию с индексом BestKeeper у главы медсестры (R ² > 0,95 и P ≤ 0,001) (Таблица 3). Кроме того, в комплексном анализе фуражиров и медсестер rpL32 продемонстрировал самый высокий коэффициент детерминации (R ² > 0.95) и самое низкое значение P (P ≤ 0,001), тогда как gapdh и rpS18 также показали относительно высокие значения CD (R ² > 0,93) и высокие значения P (P ≤ 0,001) (Таблица 3). Эти результаты свидетельствуют о том, что три гена ( gapdh , rpS18 и rpL32 ) значительно коррелируют друг с другом, и два гена ( gapdh и rpS18 ) среди них также были оценены как наиболее стабильные. экспрессируемый ген в анализах geNorm и NormFinder (таблица 2).

Проверка референсных генов

Согласно анализу с помощью NormFinder, для исследования сезонных и зависимых от труда паттернов экспрессии генов-мишеней в голове медоносной пчелы, gapdh был предложен как наиболее стабильный ген в качестве эталонного гена qRT-PCR (таблица 2). Кроме того, анализ geNorm показал, что для точной нормализации может потребоваться комбинация двух референсных генов (рис.3), и что два гена ( rpS18 и gapdh ) наиболее подходят для определения обоих, сезонных паттернов экспрессии в руководитель (независимо от разделения труда) и иждивенец (т.е., медсестра против собирателя) паттерны экспрессии (таблица 2). Таким образом, однократное ( rpS18, или gapdh, ) или комбинированное использование этих двух генов для нормализации было подтверждено сравнением сезонных паттернов экспрессии ace2 в качестве целевого гена (рис. 2). В образцах голов собирателей экспрессия ace2 нормализовалась с помощью одного гена ( rpS18 или gapdh ), и комбинация этих двух генов привела к сходным сезонным тенденциям экспрессии, но статистически разным сезонным уровням (P = 0.00) (рис. 2А), что указывает на то, что выбор эталонного гена может повлиять на количественную оценку уровня экспрессии целевого гена в голове собирателя. Напротив, между разными методами нормализации не наблюдалось значительных различий в сезонных паттернах транскрипции и уровнях ace2 у медсестры (рис. 2B). При сравнительном анализе средних уровней экспрессии ace2 между головами сборщика и кормилицы в течение 12 месяцев уровень экспрессии ace2 , нормализованный с помощью gapdh в голове сборщика, был значительно выше, чем рассчитанный с rpS18 у сборщика и кормилицы. , и с комбинацией двух генов в голове медсестры (P <0.05) (рис. 2С). Однако при сравнении уровней транскрипции ace2 , нормализованных с тем же эталонным геном, между собирателями и медсестрами, не было получено никаких существенных различий (P> 0,05) (рис. 2C). Проверка выбранного эталонного гена показывает, что на анализ экспрессии целевого гена могут влиять разные эталонные гены, и нормализация с двумя эталонными генами может дать более надежные результаты по сравнению с одним геном.

Обсуждение

Медоносная пчела — хорошо известное социальное насекомое, которое демонстрирует возрастное разделение труда, и является хорошей моделью насекомого для изучения молекулярной физиологии мозга с точки зрения социального развития насекомых.Кроме того, физиологический статус медоносной пчелы может быть разным в зависимости от сезона кормления и зимовки, во время которой наблюдается индукция и снижение социальной активности семьи, соответственно. Таким образом, в этом исследовании мы исследуем уровни транскрипции четырех кандидатов-референсных генов и оцениваем стабильность их экспрессии с использованием трех различных алгоритмов (geNorm, NormFinder и Best Keeper) в голове собирателей и медсестер, собранных в течение годичного цикла ежемесячно. основание. Мы находим наиболее оптимальные эталонные гены и сравниваем их между собирателем и кормилицей, прежде чем исследовать сезонные тенденции экспрессии целевого гена в двух группах медоносных пчел.

Все протестированные гены показали колебания значений C _q в разные сезоны. Все гены считаются генами домашнего хозяйства, так как они участвуют либо в экспрессии белка ( rpL32 , rpS18 и tbp ) [22, 23], либо в метаболизме, включая гликолиз ( gapdh ) [24]. Таким образом, это открытие предполагает, что на физиологическое состояние головы медоносной пчелы могут значительно влиять сезонные факторы. Фактически, общие уровни экспрессии этих генов были относительно ниже зимой и летом (сезон дождей), когда активность колоний медоносных пчел обычно снижена по сравнению с основным сезоном кормодобывания [8–11].Кроме того, деятельность по выращиванию расплода значительно снижается зимой [8], а гипофарингеальные железы производят высокий уровень белка для выращивания расплода [25], что объясняет высокие значения C _q , составляющие rpL32 , rpS18 и gapdh в образцы с головы, содержащие гипофарингеальные железы, в бесплодный сезон. Напротив, метаболическая активность зимней медоносной пчелы, как предполагается, остается высокой для сохранения долговременной памяти [26] или выработки тепла за счет дрожащего термогенеза [27] зимой.Следовательно, следует выяснить причину различных значений C _q , составляющих rpL32 , rpS18 и gapdh между зимовкой и сезоном кормодобывания. Эти широкие вариации значений C _q для генов также приводят к высоким значениям SD в анализе BestKeeper (таблица 3). Кроме того, сезонные уровни экспрессии rpL32 , rpS18 и gapdh значительно различались у собирателей и медсестер (P <0.05) (рис.1). В предыдущем исследовании уровень продукции белка у пчел-кормилиц был значительно выше, чем у фуражиров в гипофарингеальных железах [25]. Учитывая, что образцы головы содержат гипофарингеальные железы в этом исследовании, более высокие значения C _q rpL32 , rpS18 и gapdh наблюдались у собирателей, чем у медсестер (см. Период с марта по июль на рис. 1A, 1B и 1D. ) может зависеть от их различных уровней экспрессии между собирателем и кормушкой в ​​сезоны кормления подноглоточных желез.Хотя значения Cq tbp существенно не различались между пчелами-медсестрами и пчелами-сборщиками (P = 0,152), в отличие от других эталонных генов, самая низкая стабильность экспрессии tbp препятствовала его использованию в качестве эталонного гена. Однако, когда средние значения C _q каждого гена сравнивались от фальсификаторов и медсестер, каждый ген демонстрировал статистически похожие значения C _q в течение года для собирателей и медсестер (рис. 1E).

Хотя значения C _q кандидатов варьировались в зависимости от сезона и различных задач в настоящем исследовании, в соответствии с другими исследованиями [14–16], мы также измерили стабильность экспрессии генов и нашли наиболее подходящий ген для qRT-PCR с использованием трех программ (geNorm, NormFiner и BestKeeper).Согласно анализу geNorm, три гена ( rpS18 , gapdh и rpL32 ) продемонстрировали средние значения M ниже 1,5, что указывает на их пригодность в качестве эталонных генов (Таблица 2), и было предложено выбрать два наиболее стабильных гена. оптимально для точной нормализации (рис. 3А). Эти два гена, rpS18 и gapdh , также были отнесены ко второму и первому наиболее стабильным генам соответственно по результатам анализа NormFinder (Таблица 2). Кроме того, хотя значения SD для rpS18, и gapdh были приблизительно равны 2.7, они показали высокие коэффициенты детерминации (R ² > 0,98) и низкие значения P (P = 0,001), на что указывает индекс BestKeeper, тем самым показывая значительную корреляцию с другими генами (таблица 3). Когда ежемесячно собранные данные за год использовались для сравнения целевого гена, rpS18, и gapdh были последовательно идентифицированы как наиболее стабильные гены согласно geNorm и NormFinder (таблица 2), а анализ коэффициентов нормализации показал, что комбинация из этих двух генов улучшит результат (рис. 3B).Однако анализ BestKeeper все же показал, что gapdh и rpS18 обычно обладают высокими значениями CD и низкими значениями P (таблица 3). Можно интерпретировать, что, поскольку BestKeeper проверяет стабильность гена на основе значений C _q и значений SD, gapdh и rpsS18 , вероятно, не были оценены как высокостабильные гены из-за их сильно колеблющихся уровней экспрессии в течение года (рис. 1B). и 1D). Хотя три программы, geNorm, NormFinder и Best Keeper, показали немного разную чувствительность к совместно регулируемым референсным генам [28], rpS18 и gapdh , следовательно, настоятельно рекомендуются в качестве подходящих референсных генов для надежного определения сезонных колебаний. и зависящие от труда (медсестра vs.forager) нацелены на паттерны экспрессии генов в течение годичного цикла, но эти два гена по-прежнему предлагается использовать в качестве эталонных генов с тщательным рассмотрением из-за их флуктуирующих уровней экспрессии в течение года (рис. 1B и 1D). Эти два гена также ранее были обнаружены в качестве подходящих эталонных генов у медоносных пчел. Reim et al. (2013) выявили, что gapdh постоянно экспрессируется в мозге взрослой медоносной пчелы с 0 по 12 день после появления всходов, а также в собирателях пыльцы и нектара.Кроме того, rpS18, и gapdh были идентифицированы как оптимальные контрольные гены в голове медоносной пчелы в контексте бактериальной инфекции [15]. Когда один ген ( rpS18 или gapdh ) и комбинация этих двух генов сравнивали для оценки уровней экспрессии ace2 , на количественную оценку транскрипта ace2 значительно влиял ген, который был выбран в качестве эталонного гена в фуражиры, но не медсестры (рис. 2A и 2B), что указывает на то, что целевой уровень экспрессии гена должен быть рассчитан путем нормализации с двумя генами ( rpS18 и gapdh ), по крайней мере, у собирателей.

В заключение мы проверили два эталонных гена для анализа головы медоносной пчелы с помощью qRT-PCR. Хотя еще предстоит выяснить стабильность экспрессии референсных генов в конкретных тканях головы, включая мозг, гипофарингеальные железы и другие ткани, на основе результатов, полученных с помощью трех программ, rpS18 и gapdh были определены как наиболее подходящие в качестве эталонных генов, и было предложено, чтобы комбинация этих двух генов была лучшим методом точной нормализации для исследований общих тенденций экспрессии целевого гена в течение годичного цикла и сравнения собирателей и медсестер в цельной ткани головы медоносной пчелы.

Вспомогательная информация

S1 Рис. ПЦР-амплификация возможных референсных генов.

Шесть потенциальных эталонных генов амплифицировали с помощью ПЦР с обратной транскрипцией из общей РНК, экстрагированной из головы медоносной пчелы. Каждый ампликон визуализировали на 2% агарозном геле.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0200369.s002

(TIF)

Список литературы

1. 1. Сасс Дж. Зачем нам нужны пчелы: крошечные работники природы кладут еду на наши столы.Совет по защите природных ресурсов. Март 2011 г. https://www.nrdc.org/sites/default/files/bees.pdf Цитировано 11 мая 2018 г.
2. 2. Ли Ш., Ким Й. Сравнительный протеомный анализ рабочих медоносных пчел в период между зимовкой и выращиванием расплода. J Asia-Pac Entomol. 2017; 20: 984–995.
3. 3. Бесплатная JB. Распределение обязанностей между рабочими медоносными пчелами. Symp Zool Soc London. 1965; 14: 39–59.
4. 4. Сили Т.Д. Экология пчел: исследование адаптации в социальной жизни.Издательство Принстонского университета; 1985.
5. 5. Winston ML. Биология медоносной пчелы. Издательство Гарвардского университета; 1987.
6. 6. Сили Т.Д. Адаптивное значение графика возрастного полиэтиизма в пчелиных семьях. Behav Ecol Sociobiol. 1982; 11: 287–293.
7. 7. Шапира М., Томпсон К.К., Сорек Х., Робинсон Г.Е. Изменения экспрессии нейронального гена ацетилхолинэстеразы и разделение труда в колониях медоносных пчел. J Mol Neurosci. 2001; 17: 1–12. pmid: 11665858
8. 8.Боденхаймер Ф.С. Исследования в популяциях животных. II. Сезонные тенденции популяции медоносной пчелы. Quart Rev Biol. 1937; 12: 406–425.
9. 9. Ким Й., Ким Дж., Ким К., Ли Ш. Экспрессия ацетилхолинэстеразы 1 связана со статусом выращивания расплода у медоносной пчелы, Apis mellifera . Sci Rep.2017; 7: 39864. pmid: 28045085
10. 10. Хуан З.Й., Робинсон Г.Е. Сезонные изменения титров ювенильных гормонов и скорости биосинтеза у медоносных пчел.J. Comp Physiol B. 1995; 165: 18–28. pmid: 7601956
11. 11. Флури П., Люшер М., Вилле Х., Гериг Л. Изменения веса глоточной железы и титров гемолимфы ювенильного гормона, белка и вителлогенина у рабочих медоносных пчел. J. Insect Physiol. 1982; 28: 61–68.
12. 12. Чжай Ю., Линь Q, Чжоу X, Чжан X, Лю Т., Ю. Ю. Идентификация и проверка эталонных генов для количественной ПЦР в реальном времени в Drosophila suzukii (Diptera: Drosophilidae). PLoS One.2014; 9: e106800. pmid: 25198611
13. 13. Линг Д., Сальватерра ПМ. Надежная нормализация данных RT-qPCR: проверка и выбор внутренних эталонных генов во время постэкспериментального анализа данных. PLoS One. 2011; 6: e17762. pmid: 21423626
14. 14. Лоренко А.П., Маккерт А., Кристино А.Д., Симоэс ЗЛП. Проверка эталонных генов для исследований экспрессии генов у медоносной пчелы, Apis mellifera , с помощью количественной ОТ-ПЦР в реальном времени. Apidologie. 2008. 39: 372–385.
15. 15. Шарлакен Б., де Грааф, округ Колумбия, Гуссенс К., Брунайн М., Пилман Л.Дж., Джейкобс Ф.Дж. Выбор контрольного гена для исследований экспрессии насекомых с использованием количественной ПЦР в реальном времени: голова медоносной пчелы, Apis mellifera , после бактериального заражения. J Insect Sci. 2008; 8: 1–10.
16. 16. Рейм Т., Тамм М., Ролке Д., Бленау В., Шайнер Р. Пригодность трех общих эталонных генов для количественной ПЦР в реальном времени у медоносных пчел. Apidologie. 2013; 44: 342–350.
17. 17. Kim YH, Cha DJ, Jung JW, Kwon HW, Lee SH. Молекулярные и кинетические свойства двух ацетилхолинэстераз западной медоносной пчелы, Apis mellifera . PLoS One. 2012; 7: e48838. pmid: 23144990
18. 18. Pfaffl MW. Новая математическая модель для относительной количественной оценки в RT-PCR в реальном времени. Nucleic Acids Res. 2001; 29: e45. pmid: 11328886
19. 19. Вандесомпеле Дж., Де Претер К., Паттин Ф., Поппе Б., Ван Рой Н., Де Паэпе А. и др.Точная нормализация количественных данных ОТ-ПЦР в реальном времени путем геометрического усреднения нескольких генов внутреннего контроля. Genome Biol. 2002; 3: ИССЛЕДОВАНИЕ0034.
20. 20. Андерсен К.Л., Дженсен Дж.Л., Орнтофт Т.Ф. Нормализация количественных данных ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени: основанный на модели подход к оценке дисперсии для идентификации генов, подходящих для нормализации, применяемый к наборам данных рака мочевого пузыря и толстой кишки. Cancer Res. 2004. 64: 5245–5250. pmid: 15289330
21. 21. Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP.Определение стабильных генов домашнего хозяйства, дифференциально регулируемых генов-мишеней и целостности образцов: BestKeeper — инструмент на основе Excel с использованием парных корреляций. Biotechnol Lett. 2004. 26: 509–515. pmid: 15127793
22. 22. Чжоу X, Liao WJ, Liao JM, Liao P, Lu H. Рибосомные белки: функции за пределами рибосомы. J Mol Cell Biol. 2015; 7: 92–104. pmid: 25735597
23. 23. Ким Дж., Айер В.Р. Глобальная роль рекрутирования белков, связывающих ТАТА-бокс, на промоторы в опосредовании профилей экспрессии генов.Mol Cell Biol. 2004; 24: 8104–8112. pmid: 15340072
24. 24. Тунио С.А., Олдфилд, штат Нью-Джерси, Ала’Алдин Д.А., Вулдридж К.Г., Тернер Д.П. Роль глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GapA-1) в прикреплении Neisseria meningitidis к клеткам человека. BMC Microbiol. 2010; 10: 280. pmid: 21062461
25. 25. Лю З.Г., Цзи Т., Инь Л., Шен Дж., Шен Ф., Чен Г.Х. Анализ секвенирования транскриптома выявляет регуляцию гипофарингеальных желез у медоносной пчелы, Apis mellifera carnica Pollmann.Plos One. 2013; 8:
26. 26. Берендс А., Шайнер Р. Обучение в старости: исследование зимних пчел. Front Behav Neurosci. 2010; 4:
27. 27. Stabentheiner A, Pressl H, Papst T., Hrassnigg N, Crailsheim K. Эндотермическое производство тепла в зимних скоплениях медоносных пчел. J Exp Biol. 2003. 206: 353–358. pmid: 12477904
28. 28. Ponton F, Chapuis MP, Pernice M, Sword GA, Simpson SJ. Оценка потенциальных референсных генов для исследований физиологических ответов с обратной транскрипцией-КПЦР у Drosophila melanogaster .J. Insect Physiol. 2011; 57: 840–850. pmid: 21435341

Lia | ITZY Wiki | Фэндом

Lia

Имя при рождении

Цой Джи-су (최지수)

Дата рождения

21 июля 2000 (21 год)

Другие названия

Julia Choi (английский)
リ ア (Ria) (японский)
崔智壽 (Cuī Zhìshòu) (китайский)

Никнеймы

Honey Lia
Cinnamon Lia
Ариана Гранде

Зодиак

Рак
Дракон (китайский)

позиций

Главный вокалист, суб-рэпер

Типичный цвет

Светло-зеленый

Активные годы

2019 – настоящее время

Подпись

Лия (리아), род. Чой Джи-су (최지수) , южнокорейский певец и рэпер компании JYP Entertainment.Она — главная вокалистка и суб-рэпер южнокорейской женской группы ITZY.

История

Ранние годы

Лия жила в Торонто, Канада, три года, когда училась в начальной школе. Позже она училась в Северной Лондонской университетской школе Чеджу в Южной Корее. Находясь в Канаде, Лия прошла прослушивание в SM Entertainment и была принята в компанию, но выбыла из-за неодобрения родителей.

2019: Дебют в ITZY, выпуск

20 января 2019 года Лия была официально объявлена ​​участницей ITZY через Prologue Film.Ее первая фотография-тизер с группой была опубликована 4 дня спустя, а сам человек был выпущен 29-го числа. Лия дебютировала с группой 11 февраля. ^{[1] [2]}

12 февраля 2019 года окончила Школу исполнительских искусств Сеула. ^[3]

Спустя некоторое время в ноябре Лия и Итык из Super Junior были выбраны ведущими на 9-й церемонии вручения наград Gaon Chart Music Awards. Он был объявлен 28 ноября и состоится 8 января в Jamsil Arena. ^[4]

Домашние животные

Видео галерея

Список литературы

Навигация

Джи Ён «Honey Bee» Seo MMA Статистика, фотографии, новости, видео, биография

DMS Si Ji Chun Чай улун Four Seasons

Описание

Чай Four Seasons Oolong из Северного Таиланда

На самом деле, сорт чая Four Seasons происходит из Тайваня.Его развитие восходит к усилиям по диверсификации национального тайваньского портфеля сортов чая в течение 1980-х годов. Сорт Four Seasons отличается тремя особенностями. На этот раз он получил свое название из-за того, что растение собирает «весенний урожай» четыре раза в год. Это отличается от большинства других сортов, качество которых после весеннего сбора ухудшается в следующие сезоны. Во-вторых, сорт Four Seasons относительно безразличен к высоте.Это означает, что он даст качественные результаты как в более низких, так и в высокогорных районах. И, в-третьих, сорт сравнительно устойчив к вредителям, позволяя распределять или, по крайней мере, уменьшать потребность в использовании пестицидов. Это не только сэкономит деньги чайных фермеров, но и принесет пользу здоровью любителей чая.

В терминологии чая улун Four Seasons DMS означает регион выращивания, Дой Мае Салонг. Затем «Си Джи Чун» — это китайские слова, означающие «Времена года, похожие на весну».

С точки зрения вкуса, этот только слегка окисленный чай улун сочетает в себе лучшее из двух миров.Таким образом, он сочетает в себе свежий и терпкий вкус прекрасного зеленого чая с уникальной доминирующей нотой арахисового масла, добавляя сложности «миксу». В качестве дразнилки настоянный ликер показывает чудесный светло-зеленый и желтый цвет в чашке. И насыщенный аромат первого настоя уже довольно неплохо говорит о ожидаемых вкусовых ощущениях. В целом, чай DMS Si Ji Chun Four Seasons Oolong Tea — это недорогая альтернатива в сегменте высшего качества для любителей чая с самыми высокими стандартами.

Doi Mae Salong — Центр выращивания чая в Северном Таиланде

С начала 1990-х годов проект Thai Royal Development Project привел к импорту и выращиванию этого сорта на севере Таиланда.Основная цель инициативы состояла в том, чтобы заменить незаконное культивирование опийного мака на севере Таиланда подходящими и многообещающими законными товарными культурами.

В Doi Mae Salong , центре выращивания чая на севере Таиланда, чай тем временем стал основной товарной культурой местных китайских мигрантов и горных племен. Здесь, на высоте от 1200 до 1600 метров, чайный куст находится в оптимальных условиях. Среди них климат, состоящий из 3 сезонов. Это дождливый период, жаркий и засушливый период и холодный период.В целом, климатические и геологические условия вполне сопоставимы с таковыми в стране происхождения сорта Ruan Zhi Oolong N ° 17.

Результаты говорят сами за себя. Хотя индивидуальные вкусы могут отличаться, чай улун Four Seasons, безусловно, является одним из лучших чаев улун на севере Таиланда. И ему не нужно уклоняться от конкуренции с сопоставимыми сортами чая улун из Тайваня или других стран!

Препарат

Настой DMS Si Ji Chun Four Seasons Oolong Tea с дозировкой 3 грамма чайного жемчуга на 200 мл воды с температурой около 80 ° C.Для первой инфузии мы рекомендуем период настаивания 2-3 минуты. Затем немного меньше для второго заваривания и продолжающиеся периоды инфузии для последующих инфузий. Таким образом (подход в западном стиле) из нашего чая Si Ji Chun Four Seasons Oolong можно приготовить как минимум 4 достойных настоя.

При приготовлении в соответствии с китайским стандартом «Гонг Фу Ча» или «Чайная церемония» из этого чая можно легко приготовить до 7 и более настоев. Тем не менее, ритуальная форма приготовления китайского чая предусматривает значительно более короткие периоды заваривания на заварку, а также более высокие дозировки.