Единая мед справочная: Аптеки Оренбурга-Купить лекарства-Поликлиники-Медицинские центры — Единая медицинская справочная

Baylor белая с зелеными вставками.»Бэйлор» отображается на груди сплошным зеленым цветом. Номер игрока и «Бейлор» имеют современный дизайн, напоминающий дизайн вашего стандартного блока, но с отступом в некоторых частях текста, например, в цифре «2» на фотографии выше.

На футболке также есть две широкие зеленые полосы с золотой полосой посередине, которые начинаются под рукой игрока и доходят до середины длины футболки.

Их шорты украшены логотипом «BU» на правом бедре и таким же скошенным рисунком на джерси: две широкие полосы зеленого цвета с более тонкой золотой полосой между ними.

Мне нравится эта форма, у нее чистый вид, а современный блочный дизайн текста — это долгожданный отход от стандартного блочного дизайна. Полоски на майке и шортах — это долгожданный отход от стандартной полоски, которая идет по всей длине униформы.

Оценка домашней формы:

Работаем

Гостевая форма:

Бэйлора темно-зеленого цвета с золотой текстовой версией домашней формы, остающейся униформой, с надписью «Бэйлор» на груди.Полосы на домашней униформе также присутствуют, но с двумя более светлыми зелеными полосами и золотой полосой посередине.

Поскольку эта форма имеет более темно-зеленый цвет, я думаю, что было бы лучше использовать две более широкие золотые полосы с тем же темно-зеленым цветом, что и форма, посередине. Я чувствую, что это был бы лучший контраст, чем зеленый на зеленом.

Несмотря на то, что зеленый цвет на зеленом дизайне, я все равно считаю, что это сплошная униформа. Обычно мне нравится видеть какой-то контур текста на униформе, но и домашняя, и гостевая версии этого дизайна работают лучше, без какой-либо границы вокруг текста.

Оценка гостевой формы:

Работаем

Альтернативная форма:

Первая из альтернативных ниток Бейлора — это черная версия их основной формы. Имея «Бэйлор» и номер игрока в золоте, они действительно выделяются на черном фоне.

В отличие от домашней и выездной формы, где воротник резко контрастировал с униформой, черная униформа имеет зеленый воротник, который немного труднее увидеть.

В полосах по бокам униформы используются те же две зеленые полосы с золотой полосой посередине, что и на домашней и выездной форме.

Я думаю, что Бэйлору было бы лучше, если бы все акценты на этой униформе были золотыми. Это, безусловно, сделало бы акценты более заметными, вместо того, чтобы иметь тонкий дизайн. Я всегда думал, что если вы создадите альтернативную униформу на основе вашего основного дизайна униформы, она должна быть больше бросаться в глаза и слегка бросаться в глаза.

Вторая из альтернативной униформы Бэйлор — единственная в их гардеробе, которая отличается от основного дизайна. Униформа серая с зелеными и золотыми вставками. «Baylor» выделен зеленым цветом с золотым контуром и имеет тот же шрифт, что и другая форма. Номер игрока также имеет тот же зеленый цвет с золотым контуром.

На воротнике униформы две полосы зеленого цвета с золотой внутренней полосой.Пока нет дизайна с наклонной полосой. Тот же узор из трех полосок, что и на воротнике, появляется в нижней части шорт, охватывая всю ногу и наклоняясь вверх и доходя до точки сбоку на каждой штанине, указывающей вверх на логотип «BU».

Мне нравится, что эта форма выглядит как намек на более классический дизайн с сохранением более современного дизайна текста.

Лучшее напоследок …

Baylor — это золотая версия основного дизайна.Однако вместо названия школы на груди сплошным зеленым узором появляется «Медведи». Используется зеленый воротник, как и в домашней униформе, а полосы на боку униформы имеют легкое чередование.

Наклонная полоса состоит из двух широких зеленых полос с более тонкой белой полосой между ними. Мне нравится, как они решили использовать белую полосу, а не золотую, чтобы сделать дизайн немного более контрастным.

В целом, эта форма — абсолютный огонь.Использование прозвища школы вместо названия школы идеально, и то, как вся форма просто выпрыгивает с экрана, — это именно то, что должна делать альтернативная форма.

Оценка за альтернативную форму:

Черный: Ewww

Серый: Werk it

Золото: КОРОЛЕВА ЯАСС

Мед из красного дерева: от «Drag Race РуПола» до создателя истории | Наша Америка

«Это мед. Слаще, чем даже кленовый сироп. Слаще, чем шоколад европейского производства. Слаще, чем леденцы красного и зеленого цветов. Самая сладкая вещь, которую вы когда-либо видели».

Это второй раз, когда она вошла в политическую историю: в 2020 году Махогани была избрана вице-председателем Центрального комитета Демократического округа Сан-Франциско, что сделало ее первым чернокожим трансгендером, избранным в штате Калифорния.

Красное дерево — которое использует местоимения она / они и идентифицирует себя как недвоичное и странное — выросло в Сан-Франциско. После учебы в Университете Калифорнии в Лос-Анджелесе она вернулась в Сан-Франциско, чтобы получить степень магистра социальной работы в Калифорнийском университете в Беркли. Именно во время учебы в университете Махогани впервые попробовала перетащить для студенческого фильма и обнаружила, что перетаскивание представляет собой нечто большее, чем представление, а, скорее, неотъемлемую часть того, кем она была.

«Я начал принимать это. Перетаскивание для меня всегда было праздником того, что было женским во мне.Но я понял, что мне не нужно быть в тупике, чтобы отметить это в себе и признать весь спектр своего пола », — сказал Махогани.« По сей день я не обязательно полностью идентифицирую себя как женщину. Я думаю, что пол изменчив, и что он может меняться, и что иногда он меняется со временем ».

Mahogany был занят работой над расширением прав и возможностей трансгендеров и сохранением культуры, характера и истории сообщества ЛГБТК + в Сан-Франциско. Наряду с Ария Саид и Джанетта Джонсон, она стала соучредителем первого в мире официально признанного трансгендерного района — Трансгендерного культурного района Комптона, который включает шесть кварталов в районе Тендерлойн.

«Мы не просто район. Мы не просто район. Я думаю, что мы культурный центр, который также подталкивает, подталкивает и подталкивает к созданию все большей и большей политической власти трансгендеров, а также к экономическому и социальному развитию некоторых из них. наши самые маргинализованные группы населения », — сказал Саид.

Mahogany также является совладельцем The Stud, старейшего и любимого квир-бара в Сан-Франциско. В 2017 году она и другие сформировали коллектив, который взял на себя управление баром, сделав его первым в стране ночным клубом, принадлежащим работникам. Из-за пандемии COVID-19 Stud закрылся в 2020 году, но владельцы надеются снова открыть его.

«С закрытием множества квир-баров, многих заведений, на которые мы так долго полагались, я думаю, что это то, что я также очень опасаюсь, что мы можем проиграть», — сказал Махогани.

Несмотря на то, что трансгендерное сообщество сталкивается с постоянными проблемами и препятствиями, которые Махогани пытается изменить своей работой, она также хотела, чтобы люди понимали красоту и радость транссексуальности.

В конечном счете, Махогани сказала, что она борется за будущее, в котором разнообразие ценится и ценится, и делает это, создавая пространства, которые подтверждают и сохраняют красоту и силу квир- и транс-жизни.

«Я хочу видеть мир, в котором мы все можем быть успешными и оказывать поддержку, где мы все удовлетворяем наши основные потребности, и где мы ценим разнообразие и не рассматриваем его как угрозу», — сказала она.

Посмотрите видео, чтобы узнать больше о путешествии Honey Mahogany и его исторической работе.

В этот месяц гордости мы чествуем членов трансгендерного сообщества в рамках специальной серии под названием «Наша Америка: кем я должен быть». Щелкните здесь, чтобы увидеть больше историй из вашего города и других стран.

Copyright © 2021 KABC-TV. Все права защищены.

Сейчас идеальное время, чтобы начать наслаждаться медом

Наслаждайтесь натуральным подсластителем

Через одну короткую неделю нас ждет Хэллоуин вместе с конфетами и другими сладкими угощениями.Мы любим баловаться на праздники, но чаще всего после того, как Хэллоуин подходит к концу, наша тяга к сладкому не проходит. К счастью, у Anna’s Honey есть вкусный и полезный способ удовлетворить сладкоежек.

Часто мед не считается заменителем сахара. Промышленно обработанный мед нагревают при высоких температурах, убивая естественные ферменты и питательные вещества и изменяя вкус и аромат меда. Вот почему мед в продуктовых магазинах придает такой же однородный медовый вкус.На первый взгляд может показаться, что мед не может удовлетворить потребности в сахаре, но Анна производит мед по-другому.

Причина, по которой Anna’s Honey может предложить семнадцать различных вкусов, заключается в наших специальных системах контроля температуры. Путем фильтрации на уровне 200 микрон мы сохраняем натуральный вкус меда. Для улучшения вкуса в мед можно добавить и другие натуральные ингредиенты. В нашем сливочном меде есть мед, смешанный с настоящей корицей, ежевикой, абрикосами и лимонами, для получения множества восхитительных вкусов.

Надеюсь, после экспериментов с несколькими вкусами другие сладкие лакомства начнут казаться менее привлекательными, и это хорошо. Мед может обеспечить лучший и чистый вкус, чем обработанный сахар, а также содержит жизненно важные питательные вещества. Мед содержит антиоксиданты, укрепляющие иммунную систему, и не содержит жиров, которые помогают людям сохранять хорошее самочувствие.

Мед можно улучшить даже при выпечке. Anna’s Honey примерно в два раза слабее тростникового сахара, поэтому замена половины сахара может дать конечный продукт с еще лучшим вкусом.

Тем, кто никогда раньше не пробовал «Мед Анны», мы надеемся, что каждый найдет свой любимый среди наших различных вкусов меда. В наших бутылках с медведями, каменных банках, подарочных банках, медовых палочках и банках со сливочным медом есть что-то уникальное. Мы надеемся, что вам понравятся наши здоровые альтернативы сладкому.

LA Galaxy объявляет о партнерстве с Honey

ЛОС-АНДЖЕЛЕС (понедельник, 22 февраля 2021 г.) — Пятикратные чемпионы MLS Cup, LA Galaxy, подписали новое партнерство с Honey, технологической компанией из Лос-Анджелеса, которая занимается созданием инструментов, помогающих людям экономить время и деньги. деньги при покупках в Интернете.Многолетнее соглашение, заключенное при посредничестве AEG Global Partnerships, делает Honey официальным партнером по рукавам для майки LA Galaxy, а также официальным партнером команды по онлайн-сделкам с эксклюзивным маркетингом в коммерческой категории. В рамках соглашения логотип Хани будет отображаться на правом рукаве новых футболок LA Galaxy для домашних и выездных игр, начиная с сезона MLS 2021 года, который должен начаться в субботу, 17 апреля 2021 года. jersey, запуск которого запланирован на среду, 24 февраля, также будет отображать новую нашивку Honey для правого рукава.Это новое партнерство подчеркивает постоянную приверженность Хани Лос-Анджелесу, а также развитию спорта в Южной Калифорнии.

«Мы очень рады, что Хани будет представлена ​​на майке LA Galaxy в качестве нашего официального партнера», — сказал президент LA Galaxy Крис Кляйн. «Мы представляем наше сообщество в Лос-Анджелесе и гордимся тем, что компания из Лос-Анджелеса, стремящаяся улучшить качество обслуживания клиентов, теперь станет частью легендарной майки, которую носят наши игроки и болельщики. Мы надеемся на это захватывающее партнерство и на долгие годы работы с этой единственной в своем роде онлайн-платформой.”

Honey начиналось как расширение для браузера и превратилось в набор бесплатных инструментов, которые помогают покупателям делать покупки с уверенностью. От уведомления пользователей о снижении цены до помощи покупателям в поиске выгодных предложений и сбережений — Honey дает возможность миллионам участников принимать более обоснованные решения с их деньгами.

«Как компания из Лос-Анджелеса, мы всегда ценили и строили отношения с нашим местным сообществом и поддерживали организации, которые помогают сделать наш город великим», — сказал соучредитель Honey Джордж Руан.Компания LA Galaxy, имеющая глубокие корни в истории и культуре Лос-Анджелеса, имеет одну из самых ярых фан-баз в MLS, и, как результат, это партнерство является захватывающим способом достичь этой страстной группы ангеленосов ».

В дополнение к размещению логотипа на рукаве джерси LA Galaxy, Honey будет еще больше интегрирован в ткань культуры LA Galaxy. Пользовательский контент, созданный обеими сторонами, подчеркнет функциональность и преимущества Honey, демонстрируя страсть и разнообразие LA Galaxy и ее фанатов.В течение сезона фанаты увидят, что мед будет включен во множество маркетинговых активов, и могут рассчитывать на дополнительные преимущества с обеих сторон. Вместе Хани и Лос-Анджелес Гэлакси предоставят фанатам разнообразные возможности для умных покупок в Интернете, чтобы сэкономить на повседневных покупках и товарах для команды.

«Это партнерство между LA Galaxy и Honey, культивируемое Кала Полман-Туин из команды Global Partnerships, представляет собой синергию миссий, и мы гордимся тем, что сотрудничаем с инновационным лидером в технологическом пространстве, который ценит все сообщество Лос-Анджелеса. так же, как и мы », — сказал Роберт Вартан, вице-президент AEG Global Partnerships.«Поскольку мы приближаемся к сезону MLS 2021 года и начинаем видеть возвращение прямых спортивных мероприятий, мы с нетерпением ждем процветания этого партнерства и возможности поделиться передовой платформой Honey на благо всех наших фанатов».

В связи с выпуском футболки LA Galaxy в среду, 24 февраля, и началом нового партнерства по футболу, LA Galaxy предложит первым 100 фанатам приобрести новую аутентичную вторичную футболку LA Galaxy со скидкой 15% в TEAM LA. Магазин, используя код скидки: LAGHONEY15.Первые 100 подлинных вторичных трикотажных изделий будут поставляться с нашивкой на рукавах Honey и доступны для доставки или самовывоза в магазине.

Для получения дополнительной информации о Honey посетите www.joinhoney.com

О галактике Лос-Анджелес

«Лос-Анджелес Гэлакси» — самый успешный клуб Высшей футбольной лиги. Базирующаяся в Карсоне, штат Калифорния, в спортивном парке Dignity Health Sports Park, компания Galaxy выиграла чемпионат MLS рекордные пять раз (2002, 2005, 2011, 2012, 2014), а также чемпионат MLS Supporters ‘Shield четыре раза (1998, 2002, 2010, 2011). ) и Ламар Хант У.S. Open Cup дважды (2001, 2005) с момента их создания в 1996 году. Под руководством главного тренера LA Galaxy Грега Ванни, генерального директора Денниса Те Клезе и президента Криса Кляйна, Galaxy — главный клуб в MLS, с такими звездами, как Лэндон Донован, Дэвид Бекхэм, Робби Кин, Стивен Джеррард, Джовани душ Сантуш, Златан Ибрагимович, Хавьер Эрнандес и Коби Джонс представляли Лос-Анджелес на протяжении 26 лет в MLS. Для получения дополнительной информации о LA Galaxy посетите www.lagalaxy.com.

О компании AEG

AEG со штаб-квартирой в Лос-Анджелесе, Калифорния, является ведущей мировой компанией в области спорта и развлечений.Компания работает в следующих бизнес-сегментах: Объекты, которые через свою аффилированность с ASM Global владеют, управляют или консультируют более чем 300 выдающихся арен, стадионов, конференц-центров и площадок для исполнительских искусств по всему миру; Музыка через AEG Presents, посвященная всем аспектам живых выступлений современной музыки, включая создание и продвижение глобальных и региональных концертных туров, музыкальных и специальных мероприятий, а также всемирно известных фестивалей, таких как фестиваль музыки и искусств Coachella Valley; Real Estate, которая развивает объекты мирового класса, а также крупные спортивные и развлекательные районы, такие как STAPLES Center и L.A. LIVE, Mercedes Platz в Берлине и O2 в Лондоне; Sports, как крупнейший в мире оператор громких спортивных мероприятий и спортивных франшиз, включая LA Kings, LA Galaxy и Eisbären Berlin; и Global Partnerships, которая контролирует продажи и спонсорство по всему миру, включая права на присвоение имен, размещение премиум-класса и другие стратегические партнерства. Благодаря своей всемирной сети заведений, портфолио влиятельных спортивных и музыкальных брендов и интегрированным развлекательным районам AEG ежегодно принимает более 160 миллионов гостей.Более подробную информацию об AEG можно найти на сайте www.aegworldwide.com.

Мед медицинского класса для интраинцизии снижает распространенность послеоперационной инфекции у лошадей, перенесших операцию по коликам: проспективное рандомизированное контролируемое исследование

Фон: Мед медицинского качества ранее описывался как профилактическое средство для лечения ран. Местное профилактическое лечение может быть полезным для предотвращения послеоперационных послеоперационных инфекций у лошадей, перенесших операцию по поводу колик, но не оценивалось.

Цели: Установить, снижает ли медицинский гель, нанесенный на белую линию во время операции, частоту послеоперационных инфекций у лошадей, перенесших операцию по коликам, без побочных эффектов.

Дизайн исследования: Проспективное слепое рандомизированное контролируемое клиническое исследование.

Методы: В исследование были включены лошади старше 4 месяцев, перенесшие операцию по удалению колик в период с мая 2017 года по декабрь 2018 года и прожившие более 2 недель. Лошадей распределяли 1: 1 для лечения или контроля путем блочной рандомизации. В группе лечения после закрытия белой линии в разрез был помещен медовый гель медицинского качества (L-Mesitran Soft ^® ) с последующим наложением подкожной ткани и кожи.Информация о разрезах и послеоперационных осложнениях была получена в пяти временных точках (24 часа, 48 часов, 5 дней, 14 дней и 3 месяца).

Полученные результаты: В исследование были включены восемьдесят девять лошадей. Побочных эффектов, связанных с лечением, не наблюдалось. Лошади в экспериментальной группе имели более низкий уровень послеоперационной инфекции по сравнению с контрольной группой (8.2% против 32,5%, P = 0,02). Защитный эффект MGH имел рассчитанное скорректированное отношение шансов (OR) 0,2 (95% ДИ: 0,07-0,8, P = 0,03). Количество пациентов, которым необходимо было пройти курс лечения для предотвращения одного случая послеоперационной инфекции (NNEB), составило 4,7. Факторы риска, связанные с инфекцией, включали: более молодой возраст (OR = 27, 95% CI: от 2,3 до 306, P = 0,008) и диарею через 48 часов после операции (OR = 20, 95% CI: от 1,5 до 277, P =. 02).

Основные ограничения: Последующее наблюдение проводилось разными ветеринарными хирургами, поэтому оно не было полностью однородным.

Заключение: Местное профилактическое лечение с использованием медового геля медицинского класса в разрезе брюшной полости во время операции безопасно и может значительно снизить распространенность послеоперационных инфекций у лошадей, перенесших операцию по коликам.

Ключевые слова: SSI; колики; медовый; лошадь; профилактика; операция.

Границы | Медоносные пчелы в тропиках демонстрируют зимнее пчелиное долголетие в ответ на сезонный голод и сокращение расплода

Введение

В настоящее время распространение медоносных пчел охватывает все континенты, кроме Антарктиды. Однако этот вид произошел из более низких широт и вряд ли переживал умеренный климат до значительного распространения в более высокие широты (Cridland et al., 2017). Умеренные зимы характеризуются низкими температурами и недостатком цветочных ресурсов.Хотя экстремально низкие температуры не являются частью тропического климата, сезонное сокращение цветочных ресурсов является общей чертой этих двух регионов (Little et al., 1977). Медоносные пчелы отличаются практически от всех других насекомых своей стратегией перезимовки. Вместо того, чтобы находиться в состоянии покоя, медоносные пчелы переживают зиму в метаболически и физически активном состоянии, используя корм, накопленный ранее весной и летом, и генерируя тепло внутри терморегулирующего кластера (Stabentheiner et al., 2003, обзор в Döke et al., 2015). Начиная с конца лета и начала осени, рабочие пчелы с повышенной продолжительностью жизни (до четырех раз больше, чем в весенние месяцы) постепенно появляются в семьях (Fluri et al., 1982). К середине осени долгожители составляют большую часть популяции улья (Fukuda and Sekiguchi, 1966; Mattila et al., 2001). Помимо большей продолжительности жизни, зимние пчелы отличаются от своих сестер, рожденных весной, размером гипофарингеальной железы, уровнем ювенильного гормона и вителлогенина, а также содержанием белка гемолимфы (Fluri et al., 1982). В рамках этой стратегии колонии сокращают производство расплода в зимние месяцы, что создает потребность в существующих рабочих (произведенных осенью) для поддержания популяции колонии до следующей весны (McLellan, 1978). Существуют две возможные истории эволюции адаптивных к зиме признаков: (1) произошел отбор, когда популяции излучались в умеренный климат, отдавая предпочтение новым вариантам с зимними адаптивными чертами (т.е. адаптивная эволюция) или (2) существующие черты использовались для справляться с экологическими стрессорами в тропиках были согласованы (т.е., эксаптация). Изучение гибкой продолжительности жизни у интродуцированных популяций тропических медоносных пчел в Северной и Южной Америке может предоставить доказательства в поддержку одного или обоих сценариев.

Популяции AHB в Западном полушарии были первоначально введены в Бразилию в 1956 году и впоследствии гибридизировались с EHB, ранее привезенным из Европы в 1600-х годах (Pinto et al., 2007; Rivera-Marchand et al., 2008; Kono et al. , 2015; Lin et al., 2018). В более раннем исследовании сообщалось, что AHB в Венесуэле продемонстрировали изменение продуктивности расплода в течение тропических сезонных циклов, что свидетельствует о том, что тропические пчелы демонстрируют некоторую степень сезонной реакции (Winston et al., 2016). Здесь мы исследовали еще одну тропическую популяцию медоносных пчел на острове Пуэрто-Рико (PR). Пчелы в PR получены от африканизированных медоносных пчел, вероятно завезенных из Техаса ок. 1994 (Galindo-Cardona et al., 2013; Acevedo et al., 2019) и назвал нежных африканизированных медоносных пчел (gAHB) с учетом вторичного резкого снижения защитной реакции колонии (Rivera-Marchand et al., 2012; Avalos et al. ., 2017). В этом исследовании мы проверили способность gAHB изменять свою продолжительность жизни в соответствии с различными сезонами и репродуктивным состоянием колонии в наблюдательных и экспериментальных исследованиях.

В PR пчелы не испытывают такой степени холодового стресса, как пчелы в регионах с умеренным климатом. Температура окружающей среды в PR колеблется минимально как ежедневно (максимальное изменение на 8 ° C в течение дня), так и сезонно (максимальное изменение на 3,5 ° C между среднемесячными температурами). Однако, несмотря на относительно стабильные и более высокие температуры, PR имеет сильные сезонные различия, основанные на фенологии цветков (рис. 1). Эти различия в фенологии цветков создают аналогичный стрессор, как и в регионах с умеренным климатом, где кормовые ресурсы изобилуют в одно время года и сильно сокращаются в другое.Разделение доступности ресурсов и холодового стресса в сочетании с эволюционной историей медоносных пчел на острове делает PR отличным местом для проверки того, является ли увеличение продолжительности жизни рабочих адаптацией к зиме или более общей реакцией на сезонную нехватку ресурсов.

Рисунок 1. Фенология цветов в PR. (A) Скорость цветения 61 дерева в PR, которое регулярно посещают медоносные пчелы в течение года. (B) В PR количество цветущих видов больше всего в июне и меньше всего в декабре.В течение 4 месяцев (октябрь – январь) цветочные ресурсы ограничены: в среднем цветут десять видов, по сравнению с другими 8 месяцами (февраль – сентябрь), когда в среднем цветут 29 видов. Данные Little et al. (1977).

Хотя долгоживущие пчелы появляются естественным образом осенью, их продуктивность также может быть вызвана летом, если матка заперта в клетке внутри улья и, таким образом, предотвращено производство расплода (Маурицио, 1950; Фукуда и Секигучи, 1966; Флури и др., 1982). В манипулятивных исследованиях сокращение расплода или открытого расплода (т.например, личинки в возрасте менее 5 дней, которым требуется кормление пчелами-кормилицами) приводит к увеличению продолжительности жизни (Маурицио, 1950, 1954; Eishchen et al., 1982; Omholt, 1988; Harbo, 1993; Amdam et al., 2009; Смедал и др., 2009; Дёке и др., 2015). Тем не менее, исследования, демонстрирующие, что ограничение производства выводков приводит к появлению рабочих, проявляющих зимнюю физиологию, были проведены с колониями из популяций EHB, которые, как известно, успешно зимуют в регионах с умеренным климатом. Изменения продолжительности жизни тропических пчел, сезонные или вызванные манипуляциями с расплодом, ранее не изучались.

В этом исследовании мы проследили, чтобы нарисовать отмеченные группы рабочих медоносных пчел в колониях на нашей полевой станции в PR, чтобы установить базовый уровень сезонного изменения продолжительности жизни в тропических условиях. Затем мы проверили эффект экспериментально вызванного снижения доступности расплода и его влияние на признаки, которые обычно считаются специфическими для зимы. Мы предполагаем, что наличие изменений в характерных для зимы чертах в популяции, исторически освобожденной от бремени перезимовки, предполагает, что это общие адаптации, вызванные факторами окружающей среды.С другой стороны, если никаких изменений в gAHB не наблюдается, значит, во время облучения в регионах с умеренным климатом должны развиться адаптации, которые поддерживаются селективным давлением, характерным для зимних условий.

Материалы и методы

Источники пчел

Все экспериментальные колонии gAHB содержались в соответствии со стандартными методами (Kevan, 2007) на пасеке, расположенной на сельскохозяйственной экспериментальной станции Университета PR Mayaguez в Гурабо, PR (N 18.257294, W 65.987871).

Сезонное изменение продолжительности жизни работников

В октябре 2018 года мы создали две здоровые колонии, в каждой по 10 рамок рабочих пчел (∼20 тыс. Пчел), пыльцу, мед, расплод и спарившуюся матку-несушку. Одна из колоний была выбрана в качестве донора для всех появляющихся взрослых пчел, которые должны были быть помечены и введены в обе семьи. Использование одного источника для представленных рабочих обеспечивает единый генетический фон для субъектов и, таким образом, ограничивает упрощение экспериментального дизайна по сравнению с наличием двух отдельных генетических фонов, включенных в качестве независимой переменной.В начале октября из каждой колонии отбирали рамки с закрытым расплодом, готовым к появлению, и помещали в инкубатор при 34 ° C и относительной влажности 60% примерно на 24 часа. Одну когорту из 1000 однодневных пчел наносили краской на грудную клетку (Testors Paint, Рокфорд, Иллинойс), и 500 однодневных пчел выпускали в каждую колонию. Число помеченных выживших в каждой колонии регистрировали каждые 12 дней до тех пор, пока в ноябре не перестали наблюдаться помеченные пчелы. Подсчет производился путем наблюдения за отмеченными рабочими на рамах и внутренних поверхностях корпуса улья рано утром, чтобы избежать неправильного подсчета из-за повышенной активности полетов в конце дня (Mattila et al., 2001).

Другой набор данных о продолжительности жизни, собранных в колониях, созданных в марте 2018 года, используется для сравнения продолжительности жизни рабочих между сезонами (подробности см. Ниже). Мы использовали данные из контрольных колоний, которые не подвергались манипуляции (т. Е. Спаривались, матки-несушки вместо маток в клетках). Эти же колонии были контрольными в эксперименте по проверке влияния удаления открытого расплода на продолжительность жизни рабочих. Обратите внимание, что мы решили сообщать о наших результатах не в хронологическом порядке, а, скорее, на основе логического порядка, чтобы более эффективно передавать результаты по отдельности и их взаимосвязь друг с другом.

В октябре 2018 года средняя температура за месяц составила 27,7 ° C, максимальная — 32,8 ° C, а минимальная — 23,9 ° C; тогда как средняя температура в марте 2018 года составляла 25,9 ° C с максимальным значением 32,2 ° C и минимальным значением 21,1 ° C.

Продолжительность жизни рабочих в колониях с ограниченным открытым выводком

В середине марта 2018 г. из существующих полноразмерных колоний на нашей исследовательской пасеке было создано 10 колоний с 5 глубокими рамками каждая. Контрольные колонии ( N = 5), состоящие из 1 пустой рамки с основанием, 1 рамки меда, 1 рамки пыльцы и 2 рамок открытых колоний расплода и обработки ( N = 5), состоящих из 1 пустой рамки с основанием. , 1 кадр с медом, 1 кадр с пыльцой и 2 кадра с закрытым расплодом для обработки колоний (см. Рисунок 2, Шаг 1).В контрольных колониях были матки-несушки, в то время как в обрабатываемых колониях матку отделяли от рабочих с помощью толкающей клетки (Maurizio, 1954; Fluri et al., 1982). Клетка для содержания маток была сделана с использованием проволочной сетки, как в Le Conte et al. (2001), и это разделение рабочего и матки нарушает производство расплода, поскольку небольшое количество яиц, отложенных маткой, не может быть обработано пчелами-кормилицами. В момент создания все пять рамок в каждой колонии были полностью покрыты рабочими пчелами, в результате чего численность колонии составила примерно 15000 рабочих (Jeffree, 1951).После создания колоний ядра из нескольких полноразмерных колоний на одной и той же пасеке собирали рамки закрытого расплода, готового к появлению, и помещали в инкубатор при 34 ° C и относительной влажности 60% примерно на 24 часа (см. Рисунок 2. , Шаг 2). В течение следующих 2 дней 4000 однодневных пчел были нанесены краской на грудную клетку (Testors Paint, Рокфорд, Иллинойс), а затем 400 пчел были введены в каждую из 10 семей, чтобы создать одну когорту пчел известного возраста в каждой. колония (Mattila et al., 2001, см. Рисунок 2, шаг 3). За обработанными колониями регулярно наблюдали, чтобы убедиться, что матки живы в клетке (Smedal et al., 2009). Колонии, оставшиеся без маток (4 из 10), были удалены из исследования и не включены в анализ, даже если данные были собраны до их удаления. Периодические проверки выживаемости проводились каждые 2 недели с апреля до тех пор, пока в колониях не осталось отмеченных выживших (см. Рис. 2, этап 4). Подсчет производился рано утром, чтобы избежать неправильного подсчета из-за повышенной активности полетов в конце дня (Mattila et al., 2001).

Рис. 2. Обзор общей стратегии, материалов и методов увеличения продолжительности жизни рабочих с сокращенным выращиванием расплода. Контрольные колонии (CC) были созданы, чтобы приблизиться к типичным условиям колонии весной. Хотя в обрабатываемых колониях (TC) не было расплода без крышки, общее количество расплода было уравновешено между CC и TC путем введения закрытого расплода из CC в TC по мере необходимости.

Сбор проб

рабочих медоносных пчел было собрано как в контрольных, так и в обрабатывающих (урезанный выводок) семьях, созданных в марте 2018 года.Через двенадцать дней после введения помеченных рабочих пчел медсестры были собраны путем поведенческих наблюдений за расплодом, в то время как пчелы кормили молодой расплод (как у Vannette et al., 2015). Спустя 21 день после введения помеченных рабочих пчел собирателей собирали, временно блокируя вход в улей с помощью проволочной сетки и индивидуально отбирая рабочих, возвращающихся с кормовых полетов с видимым грузом пыльцы (как у Гирей и др., 1999). ; Vannette et al., 2015). Позднее образцы были собраны внутри основных колоний только на основании отмеченного рабочего возраста (45, 65 и 70 дней).Все пробы были собраны в жидкий азот в полевых условиях, доставлены в лабораторию на сухом льду в изолированном контейнере и выдержаны при -80 ° C до обработки (Grozinger et al., 2003).

Расслоения и измерения гипофарингеальных желез

Были вскрыты четыре пчелы на семью (возраст и обработка). Замороженные образцы хранились на сухом льду на протяжении всего времени работы с ними, а гипофарингеальная железа (HPG) удалялась под диссекционным микроскопом (Nikon C-LEDS, производства Nikon Instruments Inc., Нью-Йорк, США). Вскрытые HPG хранились в RNA , позже ICE Frozen Tissue Transition Solution (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США) до измерения диаметра ацинусов как оценки размера HPG (Renzi et al., 2016). Диаметр одной ацинуса на образец измеряли цифровым способом в мкм (микроскоп Nikon Eclipse E200, подключенный к камере Nikon DS-Fi2, Nikon Instruments Inc., Нью-Йорк, США), затем рассчитывали средний размер ацинусов для каждой группы. Хотя обычной практикой является использование нескольких измерений ацинусов у каждого человека, коэффициент вариации внутри человека был достаточно мал (0.09–0.21), чтобы с уверенностью использовать отдельные данные по ацинусу на одного рабочего для сравнения групп рабочих (Shechtman, 2013).

Статистический анализ

Анализ выживаемости Каплана-Мейера (Goel et al., 2009) был использован для сравнения продолжительности жизни обеих когорт рабочих пчел в разное время года и когорт из управляемой и контрольной семей. ANOVA использовался для сравнения размера ацинусов рабочих пчел разного возраста, которые были собраны из экспериментальных семей. Все статистические анализы были выполнены с использованием JMP (JMP ^® , версия 14.SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина, 1989–2019), а графики построены с помощью Prism (GraphPad Prism версии 6.00 для Mac OS X, GraphPad Software, Ла-Холла, Калифорния, США). Кроме того, при подготовке изображений использовались Microsoft ^® PowerPoint ^® 2016 и программа для векторной графики с открытым доступом INKSCAPE (версия 0.92).

Результаты

Сезонное изменение продолжительности жизни работников

Среднее и стандартное отклонение продолжительности жизни рабочих пчел в октябрьской когорте (1000 особей из 2 семей) составило 26.8 ± 22,1 дня, что значительно дольше, чем 23,6 ± 12,9 дня для мартовской когорты (2000 особей из 5 колоний) (анализ выживаемости Каплана-Мейера, лог-ранг p 0,05). Ни один из рабочих, завезенных в колонии в марте, не выжил более 56 дней, в то время как рабочие, завезенные в октябре, выжили до 88 дней (Рисунок 3). Обратите внимание, что данные, представленные как «мартовская когорта», совпадают с данными для контрольных колоний (то есть со спарившимися матками-несушками) в манипулятивном эксперименте, где половина колоний свернула открытый выводок.Мы решили использовать эти данные для обоих сравнений, потому что контрольные колонии не подвергались манипуляциям и, таким образом, представляют собой хорошее представление о естественной продолжительности жизни для сезона, в котором они наблюдались.

Рисунок 3. Мониторинг продолжительности жизни рабочих пчел в разные месяцы в ПР. Когорта однодневных пчел, завезенных в октябре, имела значительно большую продолжительность жизни, чем пчелы, введенные в марте (26,8 ± 0,7 дня против 23,6 ± 0,3 дня, лог-рейтинг анализа выживаемости Каплана-Мейера p 0.05).

Продолжительность жизни рабочих в колониях с ограниченным производством выводка

Максимальная продолжительность жизни в экспериментальных семьях составила 154 дня, в то время как пчелы из контрольных семей выжили до 56 дней. Среднее и стандартное отклонение продолжительности жизни рабочих пчел, выпущенных в семьи без открытого расплода, составило 35,2 ± 24,5 дня, что значительно больше, чем 23,6 ± 12,9 дня для рабочих в контрольных семьях (журнал анализа выживаемости Каплана-Мейера, рейтинг p 0,05, Рисунок 4). Мы также исследовали влияние идентичности колоний на продолжительность жизни путем сравнения колоний в контрольной и экспериментальной группах и обнаружили значительный эффект колоний в каждом случае (лог-рейтинг анализа выживаемости Каплана-Мейера, рейтинг , стр. 0.05). Тем не менее, диапазон, в котором варьировалось среднее время выживания в контрольных колониях (19,7–26,9), находился за пределами диапазона среднего выживания в колониях с урезанным выводком (31,0–39,3).

Рисунок 4. Продолжительность жизни рабочих значительно выше в колониях без открытого расплода по сравнению с контрольными колониями (лог-рейтинг анализа выживаемости по Каплану-Мейеру p 0,05).

Как в управляемых, так и в естественных семьях мы наблюдали большое количество ранних потерь помеченных пчел.Согласно нашим наблюдениям, ранняя смерть (отмеченная при первой переписи) происходит из-за стресса обращения и отказа со стороны пожилых рабочих в принимающих колониях. По нашим данным, ранняя гибель пчел соответствует тому, что наблюдалось в когортах интродуцированных пчел у европейских медоносных пчел в регионах с умеренным климатом (Mattila et al., 2001).

Acini Размер HPG у разных типов пчел

В качестве надежной оценки общего размера HPG (Deseyn and Billen, 2005) диаметр ацинусов был измерен у рабочих медоносных пчел разного возраста из контрольных и экспериментальных семей.Диаметр ацинусов значительно различается у пчел разного возраста, где у 12-дневных медсестер были самые большие (129,5 ± 8,1 мкм), а у 21-дневных фуражиров самые маленькие ацинусы (88,7 ± 5,9 мкм) (ANOVA, , стр. ). 0,05, рисунок 5). Пчелы из экспериментальных семей, показывающих крайнюю продолжительность жизни (65–75 дней), имели промежуточный размер ацинусов (100,8 ± 6,2 мкм).

Рисунок 5. Размер Acini разных пчел, собранных в разное время из экспериментальных и контрольных семей.Размеры ацинусов гипофарингеальной железы значительно различались между группами; самый большой у медсестер, самый маленький у собирателей и промежуточный у долгоживущих зимоподобных пчел (ANOVA, p 0,05). Разные буквы обозначают значительные различия в размере ацинусов между группами ( t -тест Стьюдента, p <0,05).

В то время как размер ацинусов у 12-дневных медсестер не отличался между экспериментальными и контрольными колониями, была небольшая, но значимая разница между размером ацинусов рабочих, собранных в возрасте 21 и 45 дней из обработанных и необработанных колоний.Обратите внимание, что нет проб из контрольных колоний после 45-дневной временной точки, потому что ни один рабочий день не дожил до следующего дня отбора проб (65) в контрольных колониях.

Мы исследовали влияние среды колонии на размер ацинусов с помощью вложенного дисперсионного анализа, в котором колонии были вложены в возрастные группы, и обнаружили, что среда колонии составляет 14% от общей наблюдаемой вариации, а остальные 86% можно отнести к статусу расплода.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем повышенную продолжительность жизни в типичных сезонных условиях и при манипуляциях с расплодом медоносной пчелы, адаптированной к тропическим условиям.Рабочие медоносные пчелы в регионах с умеренным климатом живут до 60 дней в сезон кормодобывания, в то время как субпопуляция рабочих, произведенных в конце лета, обычно выживает более 200 дней в течение зимы (Fukuda and Sekiguchi, 1966; Southwick, 1991; Mattila et al., 2001). В этом исследовании средняя продолжительность жизни рабочего была значительно выше в сезон нехватки ресурсов по сравнению с тем временем, когда ресурсов достаточно. Направление изменения продолжительности жизни рабочих было таким же, как и у медоносных пчел в регионах с умеренным климатом, хотя и менее выраженным.Путем устранения открытого расплода и молодых личинок, которых кормят пчелы-кормилицы, и в ячейках, не запечатанных шелком и воском, рабочие gAHB были «подготовлены к зиме» и прожили до 5 месяцев в весенние и летние месяцы.

Одно из замечаний нашего исследования состоит в том, что данные о продолжительности жизни, собранные в октябре, были получены от рабочих пчел, собранных из одной колонии и помещенных в две колонии после их маркировки. Таким образом, все вовлеченные лица — дочери одной королевы. Однако естественным образом спариваемые матки медоносных пчел обеспечивают большой уровень генетической изменчивости, потому что каждая матка спаривается с несколькими трутнями (Kraus et al., 2005; Витроу и Тарпи, 2018). Не устраняя влияния генетики на продолжительность жизни, этот подход обеспечивает единообразную генетическую основу вместо того, чтобы вводить различные генетические изменения в экспериментальный план в качестве дополнительной переменной. Наши результаты по двум независимым колониям, где открытый выводок был уничтожен путем содержания матки в клетке, и результаты более ранних исследований в регионах с умеренным климатом предполагают, что увеличение продолжительности жизни рабочих в ответ на сокращение расплода является общей реакцией медоносных пчел.В будущем эксперименты, сравнивающие различные генетические фоны в условиях манипулирования расплодом, а также в разные сезоны, могли бы должным образом изучить взаимодействие генов с сигналами сезонного изменения продолжительности жизни рабочих.

Мы также исследовали HPG gAHB. Размер HPG изменяется с возрастом и задачами пчелы в улье, отражая поведенческий статус пчелы (Smodiš Škerl and Gregorc, 2015). Феромон выводка (BP) действует как феромон праймера и способствует синтезу белка в HPG рабочих (Brouwers, 1983; Huang and Otis, 1989; DeGrandi-Hoffman et al., 2010), что объясняет самый большой размер HPG пчел-кормилиц. Интересно, что у рабочих зимой ГПГ больше, чем у летних собирателей, несмотря на отсутствие открытого расплода (Moritz and Crailsheim, 1987; Hrassnigg and Crailsheim, 1998; Smodiš Škerl and Gregorc, 2015), что предполагает более сложное влияние BP и взаимодействия с расплодом на рабочий размер HPG. Средний размер HPG долгоживущих рабочих в колониях gAHB без открытого расплода был больше, чем у собирателей, и меньше, чем у медсестер, как было ранее показано для долгоживущих европейских медоносных пчел в регионах с умеренным климатом (Fluri et al., 1982).

Вместе взятые, изменение продолжительности жизни и размера HPG у рабочих в колониях без открытого расплода во время обилия цветков, как в мартовском эксперименте, позволяет предположить, что внешние сезонные условия косвенно передаются членам через изменение способности выращивания расплода. колония. Следовательно, сокращение расплода является сигналом для существующих рабочих изменить свою биологию адаптивным образом, чтобы выжить дольше, чем обычно, в течение сезона голода.Предыдущие исследования в умеренном климате показывают постепенное увеличение доли озимых пчел в общей популяции колонии, что соответствует постепенному сокращению выращивания расплода (Mattila et al., 2001; Mattila and Otis, 2007). Это постепенное изменение доли долгоживущих пчел предполагает наличие порогового эффекта, когда некоторые рабочие реагируют на сигнал расплода раньше, чем другие. Мы не изучали систематически изменение продуктивности расплода в семьях медоносных пчел PR за год.Тем не менее, предварительную поддержку могут оказать записи колоний о количестве расплода, измеренные как соты с расплодом, внесенные в каталог во время регулярного осмотра ульев нашим полевым техником. В Приложении A с дополнительными материалами мы приводим записи об 11 ульях с февраля 2015 г. по январь 2016 г. (количество ульев определялось непрерывностью). Наблюдалось значительное влияние месяца года на количество рамок расплода [ F (17,179) = 1,78, p <0,05], с самыми низкими уровнями расплода в период с августа по январь (4.45 ± 0,12 кадра), а самый высокий - в период с февраля по июль (5,47 ± 0,19 кадра. Эти периоды соответствуют, соответственно, наличию дефицитного корма по сравнению с обильным (Little et al., 1977 и рис. 1). такие сигналы, как суточные циклы температуры, света и влажности, могут функционировать как прогностические zeitgebers наряду с сигналом расплода (Frisch and Aschoff, 1987; Giannoni-Guzman et al., 2014; Moore, 2016). Удаление открытого расплода в колониях gAHB в PR весной влияет на продолжительность жизни рабочих пчел, показывает, что наличие расплода является ключевым компонентом сигнала для сезонных изменений физиологии рабочих.

В gAHB PR изменение продолжительности жизни рабочих в ответ на уменьшение открытого расплода аналогично тому, что наблюдалось в зимующих колониях EHB в регионах с умеренным климатом. GAHB — это интродукция африканизированной популяции, которая, вероятно, родом из Техаса ок. 1994 (Асеведо и др., 2019). В целом, AHB, как сообщается, менее успешны в перезимовании, чем EHB (Villa and Rinderer, 1993). Основная гипотеза этого различия заключается в том, что африканизированным медоносным пчелам может не хватать гибкости для производства более долгоживущих зимних рабочих, что имеет решающее значение для поддержания жизни популяции колонии при сокращении расплода (Саутвик, 1991).Однако африканские медоносные пчелы обычно выживают в условиях отсутствия расплода как часть своего жизненного цикла (McNally and Schneider, 1992). В то время как европейские медоносные пчелы прекращают или серьезно ограничивают выращивание расплода, по крайней мере, на часть зимы, африканские медоносные пчелы лишаются расплода на 4–6 недель во время миграции (Grozinger et al., 2014). Тем не менее, AHB продемонстрировали ограниченный успех в распространении в умеренный климат, несмотря на их удивительно быстрое распространение в других местах (Kono et al., 2015; Lin et al., 2018), предполагая, что гибкость в продолжительности жизни рабочих необходима, но, безусловно, недостаточна для медоносных пчел. колонии, чтобы пережить умеренную зиму.Успешные колонии также должны действовать проактивно, чтобы воспринимать смену сезонов и накапливать цветочные ресурсы, которые будут поддерживать их в течение всего периода нехватки (Seeley and Visscher, 1985; Döke et al., 2015, 2018), в отличие от их тропических собратьев, у которых все еще есть доступ к значительно сокращенным растениям. но все еще присутствует ряд цветковых растений (Little et al., 1977). Более того, колонии в регионах с умеренным климатом должны успешно регулировать температуру, чтобы поддерживать поверхность зимнего скопления выше порога холодового паралича 10–12 ° C против экстремальных температур окружающей среды (Seeley, 1989; Southwick, 1991; Döke et al., 2015). В случае gAHB в PR есть свидетельства того, что эта популяция находилась в процессе отбора, что, вероятно, увеличит накопление за счет защиты колонии (Rivera-Marchand et al., 2012; Avalos et al., 2017). Это может дать популяции gAHB преимущество перед другими AHB на материке для дальнейшего распространения в умеренные зоны.

Отсутствие открытого расплода, являющееся надежным сигналом для изменения продолжительности жизни рабочих как в умеренных, так и в тропических условиях как у европейских, так и у африканизированных медоносных пчел, предполагает существование законсервированных биохимических и неврологических механизмов для оценки и реагирования на сезонные изменения.Эти механизмы могли быть приобретены на более раннем этапе эволюционной истории медоносных пчел, до того, как они стали излучать в более холодные части земного шара. Возможно, проводился дальнейший отбор по каждому из этих признаков на разных уровнях в разных популяциях, где колонии сталкиваются со специфическими стрессовыми факторами умеренной зимы по сравнению с тропической нехваткой. Геномные сравнения между стадами пчел в тропиках и регионах с умеренным климатом могут дать ценную информацию о тех частях генома, которые подвергаются отбору для определенных стрессоров.

Необработанные данные, подтверждающие выводы этой статьи, будут предоставлены авторами без излишних оговорок.

Авторские взносы

MD, CG и TG разработали и спланировали исследование. MD, S-FC и JA проводили эксперименты. MD, S-FC и JLA-R завершили статистический анализ. MD, S-FC, JLA-R, CG и TG подготовили рукопись к публикации. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Мы выражаем признательность за финансирование от Пуэрто-Рико науки, технологий и исследований Trust (CRG 2020-0139), NSF (DEB 1940621, HRD 1736019), USDA-APHIS (APP-8159 и APP-11783) для TG и NSF (IIS 1633184) для JLA-R.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Dr.Ариану Авалосу за конструктивный отзыв об этой рукописи и нашему полевому технику Тилдену Апонте за работу по управлению колониями медоносных пчел. Мы особенно благодарны технику-генетику Норме Родригес за предоставленные материалы для сбора медоносных пчел. Мы также хотели бы поблагодарить Хосе Фонтанеса за доступ к микроскопу, который использовался для измерений HPG, и необходимое обучение для его использования. Луз А. Санчес Лопес и Майкл де Хесус Сото помогли с рассечением HPG. Наконец, мы хотим поблагодарить Исаду Клаудио Форд и Клаудию Софию Кордеро за помощь в нанесении краски на однодневных пчел.

Сноски

Список литературы

Асеведо, Дж. П., Альберто, Г., Кардона, Г., Уитфилд, К. У., Родригес, Д. М., Урибе, Дж. Л. и др. (2019). История колонизации и дифференциация популяций медоносных пчел ( Apis mellifera L.) в Пуэрто-Рико. Ecol. Evol . 9, 10895–10902. DOI: 10.1002 / ece3.5330

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Амдам, Г. В., Рюппелл, О., Фондрк, М.К., Пейдж, Р. Э., и Нельсон, К. М. (2009). Нагрузка медсестры: воздействие выращивания расплода в раннем возрасте влияет на поведение и продолжительность жизни медоносных пчел ( Apis mellifera ). Exp. Геронтол. 44, 467–471. DOI: 10.1016 / j.exger.2009.02.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Avalos, A., Pan, H., Li, C., Acevedo-Gonzalez, J.P., Rendon, G., Fields, C.J., et al. (2017). Мягкий выборочный взмах во время быстрой эволюции мягкого поведения африканизированной пчелы. Nat. Commun. 8: 1550. DOI: 10.1038 / s41467-017-01800-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брауэрс, Э. В. М. (1983). Активация гипофарингеальных желез медоносных пчел зимой. J. Apic. Res. 22, 137–141. DOI: 10.1080 / 00218839.1983.11100576

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кридланд, Дж. М., Цуцуи, Н. Д., и Рамирес, С. Р. (2017). Сложная демографическая история и эволюционное происхождение западной медоносной пчелы, Apis Mellifera . Genome Biol. Evol . 9, 457–472. DOI: 10.1093 / GBE / evx009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ДеГранди-Хоффман, Г., Чен, Ю., Хуанг, Э., и Хуанг, М. Х. (2010). Влияние диеты на концентрацию белка, развитие гипофарингеальной железы и вирусную нагрузку у рабочих медоносных пчел ( Apis mellifera L.). J. Insect Physiol. 56, 1184–1191. DOI: 10.1016 / j.jinsphys.2010.03.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Десейн, Дж.и Биллен Дж. (2005). Возрастная морфология и ультраструктура гипофарингеальной железы рабочих Apis mellifera (Hymenoptera, Apidae). Apidologie 36, 49–57. DOI: 10.1051 / apido: 2004068

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Доке, М.А., Макгрейди, К.М., Отиено, М., Грозингер, К.М., и Фрейзер, М. (2018). Успех перезимовки медоносных пчел (Hymenoptera: Apidae) на северо-востоке США определяется размером колонии, а не географическим происхождением стада. J. Econ. Энтомол. 112, 525–533. DOI: 10.1093 / jee / toy377

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Eishchen, F. A., Rothenbuhler, W. C., and Kulinčević, J. M. (1982). Продолжительность жизни и сухой вес рабочих пчел, выращенных в колониях с различным соотношением рабочих и личинок. J. Apic. Res. 21, 19–25. DOI: 10.1080 / 00218839.1982.11100511

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флури, П., Люшер, М., Вилле, Х., и Гериг, Л. (1982). Изменение массы глотки и титров гемолимфы ювенильного гормона, белка и вителлогенина у рабочих медоносных пчел. J. Insect Physiol. 28, 61–68. DOI: 10.1016 / 0022-1910 (82)

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Frisch, B., and Aschoff, J. (1987). Циркадные ритмы у медоносных пчел: увлечение циклами кормления. Physiol. Энтомол. 12, 41–49. DOI: 10.1111 / j.1365-3032.1987.tb00722.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фукуда, Х.и Секигучи К. (1966). Сезонное изменение продолжительности жизни рабочих пчел в Саппоро, Северная Япония, с указанием некоторых факторов, влияющих на продолжительность жизни. Jpn. J. Ecol. 16, 206–212.

Google Scholar

Галиндо-Кардона, А., Асеведо-Гонсалес, Дж. П., Ривера-Маршан, Б., и Гирей, Т. (2013). Генетическая структура нежной африканизированной популяции медоносных пчел (gAHB) в Пуэрто-Рико. BMC Genet. 14:65. DOI: 10.1186 / 1471-2156-14-65

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джаннони-Гусман, М.А., Авалос, А., Перес, Дж. М., Лоперена, Э. Дж. О., Кайым, М., Медина, Дж. А. и др. (2014). Измерение индивидуальных двигательных ритмов у медоносных пчел, бумажных ос и других насекомых аналогичного размера. J. Exp. Биол. 217, 1307–1315. DOI: 10.1242 / jeb.096180

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гирей, Т., Хуанг, З. Ю., Гусман-Новоа, Э., и Робинсон, Г. Э. (1999). Физиологические корреляты генетической изменчивости скорости поведенческого развития медоносной пчелы, Apis mellifera . Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 17–28. DOI: 10.1007 / s002650050645

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гоэль Н., Бэнкс С., Миньо Э. и Динджес Д. Ф. (2009). Полиморфизм PER3 предсказывает кумулятивные гомеостатические, но не нейроповеденческие изменения в отношении хронической частичной депривации сна. PLoS One 4: e5874. DOI: 10.1371 / journal.pone.0005874

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грозингер, К. М., Ричардс, Дж., и Маттила, Х. Р. (2014). От молекул к обществу: механизмы, регулирующие роение медоносных пчел (Apis spp.). Apidologie 45, 327–346. DOI: 10.1007 / s13592-013-0253-2

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Грозингер, К. М., Шарабаш, Н. М., Уитфилд, К. В., и Робинсон, Г. Э. (2003). Экспрессия гена, опосредованная феромонами, в мозге медоносной пчелы. Proc. Natl. Акад. Sci. США 100, 14519–14525. DOI: 10.1073 / pnas.2335884100

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Харбо, Дж.Р. (1993). Влияние выращивания расплода на потребление меда и выживаемость рабочих медоносных пчел. J. Apic. Res. 32, 11–17. DOI: 10.1080 / 00218839.1993.11101282

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hrassnigg, N., and Crailsheim, K. (1998). Адаптация развития гипофарингеальной железы к статусу расплода пчелиных семей ( Apis mellifera L.). J. Insect Physiol. 44, 929–939. DOI: 10.1016 / S0022-1910 (98) 00058-4

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуанг, З.Ю., и Отис, Г. В. (1989). Факторы, определяющие активность гипофарингеальной железы рабочих медоносных пчел ( Apis mellifera L.). Insectes Sociaux 36, 264–276. DOI: 10.1007 / BF02224880

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Джеффри, Э. П. (1951). Фотопрезентация предполагаемого количества медоносных пчел ( Apis Mellifera L.) на сотах в рамках 14 × 81/2 дюйма. Bee World 32, 89–91. DOI: 10.1080 / 0005772x.1951.11094703

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кеван, П.Г. (2007). Пчелы: биология и менеджмент. Enviroquest.

Google Scholar

Краус Ф. Б., Нойман П. и Мориц Р. Ф. А. (2005). Генетическая изменчивость частоты спариваний медоносной пчелы ( Apis mellifera L.). Insectes Sociaux 52, 1–5. DOI: 10.1007 / s00040-004-0766-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ле Конте, Ю., Мохаммеди, А., и Робинсон, Г. Э. (2001). Основные эффекты феромона расплода на поведенческое развитие пчел. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 268, 163–168. DOI: 10.1098 / rspb.2000.1345

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маттила, Х. Р., Харрис, Дж. Л., и Отис, Г. У. (2001). Сроки производства озимых пчел в пчелиных семьях ( Apis mellifera ). Insectes Sociaux 48, 88–93. DOI: 10.1007 / PL00001764

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маттила, Х. Р., и Отис, Г. У. (2007). Истощение ресурсов пыльцы вызывает переход к бесплодным популяциям долгоживущих пчел каждую осень. Ecol. Энтомол. 32, 496–505. DOI: 10.1111 / j.1365-2311.2007.00904.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Маурицио А. (1950). Влияние кормления пыльцой и выращивания расплода на продолжительность жизни и физиологическое состояние медоносной пчелы. Bee World 31, 9–12.

Google Scholar

Маурицио А. (1954). Pollenernahrung und ILcbrnsvorgange bei der Honigbiene. Landw. Jb. Schweiz. 68, 115–182.

Google Scholar

Маклеллан, А.(1978). Рост и уменьшение пчелиных семей и взаимоотношений взрослых пчел, расплода, меда и пыльцы. J. Appl. Ecol. 15, 155–161.

Google Scholar

МакНелли, Л.С., и Шнайдер, С.С. (1992). Сезонные циклы роста, развития и передвижения африканской медоносной пчелы Apis mellifera scutettata в Африке. Insectes Sociaux 39, 167–179. DOI: 10.1007 / BF01249292

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мур, Д.(2016). Циркадные часы медоносных пчел: поведенческий контроль от отдельных рабочих до ритмов всей семьи. J. Insect Physiol.? 47, 843–857. DOI: 10.1016 / S0022-1910 (01) 00057-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мориц, Б., и Крейлсхайм, К. (1987). Физиология переваривания белков в средней кишке медоносной пчелы ( Apis mellifera L.). J. Insect Physiol. 33, 923–931. DOI: 10.1016 / 0022-1910 (87)

-7

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Омхольт, С.W. (1988). Связь между продолжительностью жизни рабочих и внутриколониальной динамикой популяции медоносных пчел. J. Theor. Биол. 130, 275–284. DOI: 10.1016 / S0022-5193 (88) 80030-4

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пинто, М. А., Шеппард, В. С., Джонстон, Дж. С., Рубинк, В. Л., Колсон, Р. Н., Шифф, Н. М. и др. (2007). Медоносные пчелы (Hymenoptera: Apidae) африканского происхождения существуют в не африканизированных районах юга Соединенных Штатов: данные митохондриальной ДНК. Ann. Энтомол. Soc. Являюсь. 100, 289–295.

Google Scholar

Ренци, М. Т., Родригес-Газоль, Н., Меджицки, П., Поррини, К., Мартини, А., Берджио, Г., и др. (2016). Совместное влияние качества пыльцы и тиаметоксама на развитие гипофарингеальной железы и содержание белка в Apis mellifera . Apidologie 47, 779–788. DOI: 10.1007 / s13592-016-0435-9

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ривера-Маршан, Б., Гирей, Т., и Гусман-Новоа, Э. (2008). Стоимость защиты от социальных насекомых: выводы из медоносной пчелы. Энтомол. Exp. Прил. 129, 1–10.

Google Scholar

Сили Т. Д. (1989). Колония медоносных пчел как суперорганизм. Am. Sci . 77, 546–553.

Google Scholar

Сили, Т. Д., и Вишер, П. К. (1985). Выживание пчел в холодном климате: критические сроки роста и размножения колоний. Ecol. Энтомол. 10, 81–88.DOI: 10.1111 / j.1365-2311.1985.tb00537.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шехтман О. (2013). «Коэффициент вариации как показатель надежности измерения», в Методы клинической эпидемиологии , редакторы С. А. Р. Дои и Г. М. Уильямс (Берлин: Springer), 39–49. DOI: 10.1007 / 978-3-642-37131-8_4

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смедал Б., Брюнем М., Крейбич К. Д. и Амдам Г. В. (2009). Феромон расплода подавляет физиологию крайнего долголетия у медоносных пчел ( Apis mellifera ). J. Exp. Биол. 212 (Pt 23), 3795–3801. DOI: 10.1242 / jeb.035063

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Смодиш Шкерл, М. И., и Грегорц, А. (2015). Характеристики гипофарингеальных желез медоносных пчел ( Apis mellifera carnica) из колонии медсестер. Slov. Вет. Res. 52, 67–74.

Google Scholar

Саутвик, Э. Э. (1991). «Зимовка медоносных пчел: значение для пчеловодства», в Насекомые при низкой температуре , ред.Э. Ли и Д. Л. Денлингер (Бостон, Массачусетс: Springer).

Google Scholar

Stabentheiner, A., Pressl, H., Papst, T., Hrassnigg, N., and Crailsheim, K. (2003). Производство эндотермического тепла в зимних скоплениях медоносных пчел. J. Exp. Биол. 206, 353–358. DOI: 10.1242 / jeb.00082

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ваннетт Р. Л., Мохамед А. и Джонсон Б. Р. (2015). Пчелы-собиратели ( Apis mellifera ) высоко экспрессируют гены иммунитета и детоксикации в тканях, связанные с переработкой нектара. Sci. Отчет 5: 1622. DOI: 10.1038 / srep16224

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вилла, Дж. Д., и Риндерер, Т. Э. (1993). Терморегуляция в холодильной камере, потребление в хранилище и выживаемость африканизированных и европейских медоносных пчел ( Apis mellifera L). Apidologie 24, 411–423. DOI: 10.1051 / apido: 19930408 ​​

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уинстон, М. Л., Тейлор, О. Р., Отис, Г. У., Уинстон, М.Л., Тейлор, О. Р., Отис, Г. В. и др. (2016). Некоторые различия между умеренными европейскими пчелами и тропическими африканскими и южноамериканскими пчелами. Bee World 64, 12–21. DOI: 10.1080 / 0005772X.1983.11097902

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Характеристика активных микробиот, связанных с медоносными пчелами, выявляет более здоровые и более широкие сообщества, когда колонии генетически разнообразны

Abstract

Недавние потери семей медоносных пчел привели к повышенному интересу к микробным сообществам, связанным с этими важными опылителями.Важнейшая функция, которую бактерии выполняют для своих хозяев — медоносных пчел, но которая плохо изучена, — это преобразование пыльцы, собранной рабочими, в пчелиный хлеб, питательный пищевой продукт, который можно долго хранить в семьях. Мы использовали пиросеквенирование 16S рРНК, чтобы всесторонне охарактеризовать в генетически разнообразных и генетически однородных колониях активные бактериальные сообщества, которые обнаруживаются у медоносных пчел, в их пищеварительном тракте и в пергах. Этот метод позволил получить представление о содержании и преимуществах микробных сообществ, связанных с медоносными пчелами, которые не были выявлены в ходе прошлых исследований.Микробиоты колоний существенно различались в разных средах отбора проб и среди них преобладали несколько родов анаэробных бактерий, никогда ранее не связанных с медоносными пчелами, но известных тем, что люди использовали их для ферментации пищи. Колонии с генетически разнообразным населением рабочих, в результате очень беспорядочного спаривания маток, выиграли от большего микробного разнообразия, снижения нагрузки патогенов и увеличения численности предположительно полезных бактерий, особенно видов потенциально пробиотического рода Bifidobacterium .Во всех колониях активность Bifidobacterium отрицательно коррелировала с активностью родов, которые включают патогенные микробы; эта взаимосвязь предлагает возможную цель для понимания того, обеспечивают ли микробы защитные свойства медоносных пчел. Разнообразие внутри колонии формирует микробиоту, связанную с медоносными пчелами, таким образом, что это может иметь важные последствия для функции и здоровья колонии. Наши результаты подчеркивают важность симбиоза медоносных пчел и бактерий и изучают их взаимосвязь с питанием, патогенами и генетическим разнообразием — факторами, которые считаются ключевыми для понимания сокращения численности медоносных пчел.

Образец цитирования: Mattila HR, Rios D, Walker-Sperling VE, Roeselers G, Newton ILG (2012) Характеристика активных микробиот, связанных с медоносными пчелами, выявляет более здоровые и широкие сообщества, когда колонии генетически разнообразны. PLoS ONE 7 (3): e32962. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962

Редактор: Гро В. Амдам, Университет штата Аризона, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 17 июня 2011 г .; Одобрена в печать: 7 февраля 2012 г .; Опубликовано: 12 марта 2012 г.

Авторские права: © 2012 Mattila et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Финансирование было предоставлено программой Brachman-Hoffman Awards для HRM и ILGN (колледж Уэлсли), а также грантом Ассоциации пчеловодов округа Эссекс (Массачусетс). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Недавние проблемы со здоровьем медоносных пчел, включая резкие потери колоний, связанные с расстройством разрушения колоний (CCD) и занос вредителей и патогенов в управляемые колонии, привели к опустошению запасов медоносных пчел во всем мире [1], [2]. Тем не менее, возбудитель еще не идентифицирован [3] — [5], и новые идеи о факторах, которые могут объяснить ухудшение здоровья семей медоносных пчел, все еще возникают [6].В настоящее время исследователи медоносных пчел рассматривают эти тревожные потери как вероятный продукт воздействия множества патогенов медоносных пчел на хронические стрессоры, включая плохое питание, повышенную нагрузку патогенов и отсутствие генетического разнообразия среди рабочей силы семей [2], [7] — [15]. Одним из факторов, который, вероятно, определяется генотипом колонии и имеет решающее значение для ослабления пищевого стресса — но еще не полностью охарактеризован — это состав и функция микробиоты медоносных пчел. Широта бактериальной флоры (и других микробов), которая содержится в семьях медоносных пчел, может играть роль в здоровье и жизнеспособности этих организмов, так же как и в нашем собственном организме [16].Микроорганизмы, ассоциированные с хозяином, вносят огромный вклад в развитие иммунной системы, пищеварения и общего благополучия своего хозяина [17] — [19].

Многие животные сосуществуют с бактериальными симбионтами, которые предоставляют своим хозяевам питательные вещества, которые либо отсутствуют в рационе их хозяина, либо иным образом недоступны им в пище, которую они потребляют [20], [21]. Симбиозы такой природы особенно важны для животных с растительной диетой, потому что большинство из них не вырабатывают ферменты, которые переваривают растительный клеточный материал (включая лигнин и сложные полисахариды), в то время как многие виды бактерий делают это [22] — [25].Медоносные пчелы ( Apis mellifera ) питаются исключительно растительными продуктами: нектаром и пыльцой. Пчелы перерабатывают нектар в мед, который обеспечивает колонию основным источником углеводов и содержит лишь следовые количества аминокислот и витаминов [26] — [29]. Пыльца обеспечивает медоносных пчел практически всеми оставшимися питательными веществами, включая аминокислоты, липиды, витамины и минералы [30], [31]. Однако цитоплазматические питательные вещества в пыльце недоступны пчелам, потому что каждое пыльцевое зерно имеет клеточную стенку, которую химически трудно разложить (например,g., чрезвычайно устойчивый внешний слой спорополленина, под которым находится слой целлюлозы). Медоносные пчелы — одно из немногих насекомых, у которых известны гены, кодирующие целлюлазы [32], но их постоянные трудности с перевариванием пыльцы подтверждаются значительной долей пыльцевых зерен, которые не полностью расщепляются в кишечнике рабочих [33]. Кроме того, большинство источников пыльцы не обеспечивают полный набор питательных веществ, которые требуются медоносным пчелам, или могут содержать только следовые количества некоторых незаменимых аминокислот [34] — [36], что означает, что пчелы должны собирать пыльцу разных типов, когда они жестяная банка.

Чтобы облегчить некоторые из этих проблем с питанием, медоносные пчелы обычно не потребляют сырую пыльцу. Вместо этого рабочие обрабатывают собранную пыльцу, упаковывая ее в соты, добавляя к ней железистый секрет и запечатывая каплей меда [37]. Обработанная таким образом пыльца созревает в пчелиный хлеб через несколько недель, предположительно из-за активности микроорганизмов, которые присутствуют в пчелином хлебе, но отсутствуют в необработанной пыльце [38]. Пчелиный хлеб химически отличается от пыльцы: он имеет более высокое содержание витаминов [39], меньшее количество сложных полисахаридов, сдвиг в аминокислотном профиле [40] и более низкий pH [41], [42].Обычно предполагается, что эти изменения в составе питания являются результатом метаболической активности микрофлоры, которая присутствует в хранимой пыльце [37], [38], [41], хотя организмы, которые активно участвуют в этой метаболической трансформации, имеют никогда не были окончательно идентифицированы. Предыдущие исследования охарактеризовали бактерии, которые связаны с пчелами, используя только методы культивирования [40], [43] — [45] или независимые от культуры подходы, такие как клонирование и секвенирование гена 16S рРНК [4], [46] — [48].Исследования на основе культур дают важную перспективу в микробиотическом мире колоний медоносных пчел, но они обязательно исключают подавляющее большинство бактерий, которые не поддаются культивированию. Независимые от культур исследования добавили к этой перспективе, но они были относительно небольшими по объему (как с точки зрения отбора проб пчел, так и с точки зрения секвенирования гена 16S рРНК) и не различали бактерии, которые активно трансформируют пыльцу в пчелиный хлеб по сравнению с бактериями, которые просто присутствовать в нем.Хотя организмы, ответственные за это преобразование, остаются в значительной степени загадкой, ясно, что пчелиный хлеб более питателен для рабочих, чем необработанная пыльца. Медоносные пчелы, которых кормили первым кормом, живут дольше, чем пчелы, которых кормили вторым [49], и они лучше способны компенсировать физиологический ущерб от вредителей, когда пчелиный хлеб в изобилии [50]. Из-за того, как пчелиный хлеб инокулируется, созревает и распределяется, его микробное сообщество действует как расширенный кишечник для колонии, и преимущества его деятельности распределяются между всеми членами колонии.

Одним из способов увеличения масштабов и активности микробиоты колонии является увеличение генетического разнообразия рабочей популяции. В отличие от маток большинства социальных видов перепончатокрылых (пчелы, муравьи и осы), матка медоносных пчел спаривается с большим количеством самцов и поэтому вводит в свою колонию генетически разные семьи рабочих от многих разных отцов. В A. mellifera каждая матка спаривается в среднем с 12 самцами [51], при этом зарегистрировано 44 спаривания [52].Крайняя полиандрия со стороны маток — это в высшей степени производная черта, но она встречается повсеместно у медоносных пчел Apis [53] и в аналогичной степени среди ограниченного числа других социальных таксонов насекомых, включая армейских муравьев [54]. ] и муравьи-листорезы [55]. Медоносные пчелы извлекают выгоду из высокого уровня генетического разнообразия внутри колонии, которое порождает крайняя полиандрия за счет повышенной способности смягчать симптомы патогенной и паразитарной инфекции [56] — [58], а также более высоких уровней стабильности [59] и продуктивности колонии [59]. — [65].Эти исследования показывают, что существует множество причин, по которым крайняя полиандрия и генерируемое ею генетическое разнообразие внутри колонии были повсеместно выбраны у медоносных пчел. Учитывая научный консенсус о том, что генетический фон животного значительно влияет на состав его микробиома [18], [66] — [70], возможно, что генетическое разнообразие в колонии медоносных пчел также может способствовать более разнообразной бактериальной флоре, которая может, в свою очередь, дать всем членам колонии либо защитное, либо питательное преимущество.

Имея в виду связь между здоровьем, продуктивностью и питанием колонии, мы стремились в этом исследовании описать активных бактериальных микробиот , которые связаны с медоносными пчелами и их пищевыми продуктами, задав два основных вопроса. Во-первых, мы охарактеризовали состав связанных с пчелами бактериальных сообществ, чтобы осветить роль, которую активные микробы играют в превращении пыльцы в пчелиный хлеб, и значимость их активности для питания пчел. Кроме того, мы исследовали, влияет ли увеличение генетического разнообразия в рабочей популяции колонии на изменения в разнообразии и составе микробов, связанных с пчелами и их пищей.Чтобы ответить на эти вопросы, мы использовали пиросеквенирование ампликонов со штрих-кодами — глубокое секвенирование, независимый от культуры подход к анализу микробного разнообразия — для изучения различий в бактериальных сообществах в колониях медоносных пчел, которые имели высокий уровень генетического разнообразия, характерный для встречающихся в природе Apis , или низкий уровень разнообразия внутри колонии, например, производимый предками моноандрозных пчелиных маток [71]. Мы решили опросить активные микробные сообщества в колониях медоносных пчел, начав наш анализ с общей РНК, подход, который никогда раньше не использовался для изучения пчел и их симбиотических микробов.Соответственно, наши результаты существенно отличаются от предыдущих отчетов о микробах, связанных с медоносными пчелами, потому что самая большая часть активных микробов, описанных здесь, не была идентифицирована другими авторами.

Результаты

Активные микробиоты сильно различаются в зависимости от среды в семьях медоносных пчел

После обработки всех данных у нас было в общей сложности 70 562 высококачественных выровненных пиросеквенциях, которые впоследствии были отнесены к бактериальным родам.Большинство этих пиросеквенций (56 556) были получены из пчелиного кишечника, что позволило нам обнаружить «редкую биосферу» в этом сложном сообществе. Баланс пиросеквенций был разделен между целыми пчелами (4471) и пчелиным хлебом (9535), и, хотя и был относительно меньшим, чем пул последовательностей из пчелиного кишечника, наш набор данных был достаточно большим для всех трех сред выборки, чтобы можно было сравнить состав их наиболее активные бактериальные члены. В общей сложности 1019 видов, принадлежащих к пяти типам, были обнаружены во всех образцах пчелиного кишечника, перги и цельной пчелы, причем доминирующим типом, основанным на подсчете во всех выборках, были Firmicutes (Таблица 1).Предполагается, что хранящаяся пыльца заражается пчелиными микробами до созревания в пчелиный хлеб [72], и наши результаты показывают, что и пчелиный хлеб, и пчелиные кишки содержат 207 видов взаимно (рисунки 1, 2). Однако значительный процент видов, обнаруженных в пчелином кишечнике, не был обнаружен в пергаменте, и наоборот (75% и 46% соответственно; Рисунок 1). «Основной» микробиом колонии, состоящий из 103 видов, был идентифицирован во всех средах отбора проб (рис. 1), что означает, что они имеют только 10% общих идентифицированных видов.Когда образцы были исследованы, чтобы определить, как они сгруппированы на основе видового разнообразия и численности (определяемого кластеризацией Unifrac на основе взвешенного обилия видов), образцы пчелиного кишечника сгруппировались, за исключением образцов цельной пчелы и перги (рисунок 2), которые предполагает, что внутренние активные микробиомы (т.е. внутри пищеварительного тракта) характеризовались микробиотой, отличной от окружающей среды, которая включала внешние поверхности колоний (например, пчелиный хлеб и целые пчелы, которые труднее отличить друг от друга).Было обнаружено, что эти результаты не зависят от размера библиотеки; мы получили аналогичный результат, когда все библиотеки были масштабированы до одинакового размера (с использованием функции sub.sample в Mothur) по сравнению с использованием целых библиотек (рисунки S2 и S3). По этой причине в дальнейшем мы обсуждаем только полный набор данных. Мы определили большее количество активных видов бактерий в кишечнике пчел, чем в целых пчелах, что на первый взгляд является парадоксальным открытием (т.е. ожидается, что виды, обнаруженные в кишечнике, будут обнаружены в образцах цельных пчел).Однако это наблюдение, вероятно, является следствием гораздо более глубокого пиросеквенирования пчелиного кишечника по сравнению с целыми образцами пчел, поскольку на редкие виды (например, одиночные и двойные) приходится большая часть дополнительного видового разнообразия, обнаруженного в кишечнике пчел (см. Рисунок S1). Мы предполагаем, что пробы цельной пчелы являются более сложными (включая множество различных ниш и микроокружений), и количество пиросеквенций, необходимых для того, чтобы иметь возможность взять достаточный образец этой среды для обнаружения «редкой биосферы», не было достигнуто.Однако можно было сравнить наиболее активных членов во всех трех средах колоний, и среди них преобладали четыре типа (таблица 1; дальнейшая характеристика в следующем разделе), бактерии которых обнаружены в кишечнике других животных: Proteobacteria, Firmicutes, Actinobacteria и Bacteroidetes [67]. .

Рис. 1. Разнообразие видов и родов, встречающихся в разных средах пчелиного семейства.

(A) Диаграмма Венна, представляющая видовое разнообразие (97% идентичности) активных бактериальных сообществ, которые были обнаружены в трех связанных с пчелами средах отбора проб (пчелиный хлеб, пчелиные кишки и целые пчелы), объединенные по типу колонии.Общее видовое богатство в наборе данных составило 1019 OTU, при этом наиболее богатая видами среда — это пчелиные кишки (всего 824 вида). (B) Основная микробиота среди всех трех сред включала 103 вида, которые охватывали 26 родов, из которых Oenococcus и Succinivibrionaceae составляли наибольшие фракции.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962.g001

Рис. 2. Кластеризация образцов колоний медоносных пчел в зависимости от окружающей среды.

(A) Взвешенная, на основе видов (идентичность 97%) Unifrac кластеризация отобранных сред в каждой исследуемой колонии, с кладами, окрашенными в соответствии с окружающей средой. Кроме того, красным цветом выделены ветви, представляющие микробиоту в генетически однородных колониях; черные ветви — это генетически разнообразные колонии. (B) Каждый столбец под верхушкой дерева Unifrac представляет собой ранжированное количество классов бактерий, обнаруженных в этом образце, представленное в виде тепловой карты; наиболее активными классами были бациллы и γ-протеобактерии.Образцы пчелиного кишечника (в сиреневом цвете) группируются за исключением образцов цельной пчелы (зеленым цветом) и образцов перги (розовым цветом), в основном из-за присутствия Succinovibrionaceae .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962.g002

Роды, которые наиболее активны в семьях медоносных пчел, знакомы по другим средам анаэробной ферментации

Микробы, связанные с ферментацией продуктов питания, произведенных человеком, и ферментацией в других местах обитания, составляют значительную часть микробиоты медоносных пчел, но ранее в колониях не обнаруживались. Succinivibrio (связанное с коровьими рубцами), Oenococcus (важно для ферментации вина), Paralactobacillus (важно для ферментации пищевых продуктов) и Bifidobacterium (связанное с йогуртом) входили в шестерку самых активных родов, обнаруженных в образцы пчелиного кишечника и составили более 67% активного бактериального сообщества в этой среде (Таблица 1). Oenococcus и Paralactobacillus были наиболее активными микробами в пергах и целых пчелах, составляя 52% и 60% бактерий, представленных в этих сообществах, соответственно (Таблица 1).Из 18 видов в образцах перги, каждый из которых составлял не менее 1% активного бактериального сообщества, 17 видов были факультативными или облигатными анаэробами (Таблица S1). Эти виды включали множество молочнокислых бактерий (LAB; Oenoccoccus , Paralactobacillus , Bifidobacterium ), а также кишечные бактерии ( Enterobacter , Escherichia / Shigella , , Klebsiella Подавляющая активность анаэробов, связанных с пчелиным хлебом и пчелиными кишками, предполагает, что их присутствие может иметь решающее значение для преобразования пыльцы в пищевой продукт из пчелиного хлеба, который подходит для длительного хранения в семьях.

Succinivibrionaceae — облигатные анаэробы γ-протеобактерий, о которых ранее не было известно, что они ассоциируются с медоносными пчелами, но мы обнаружили, что они чрезвычайно активны в пчелином кишечнике (хотя они не были обнаружены как в перговом хлебе, так и в образцах цельной пчелы). Изоляты из рода Succinivibrio известны из рубцов коров, где они играют роль в переваривании крахмалов и производстве органических кислот [73]. Активное присутствие в пчелином кишечнике организмов этого рода в значительной степени привело к кластеризации этого микроокружения за счет исключения других сред колоний, которые были взяты (рис. 2).Важность Succinivibrionaceae для отделения микробиоты пчелиного кишечника от микробиоты в других образцах колоний подтверждается значительной и положительной взаимосвязью между относительной активностью Succinivibrionaceae и первым компонентом анализа основных компонентов (PCA), который определяет, насколько среды, связанные с пчелами, сгруппированы на основе разнообразия и уровня активности видов бактерий, которые в них присутствовали (корреляция Пирсона: r = -0,96, n = 64, p <0.0001). Организмы, идентифицированные как Succinivibrionaceae в образцах пчел, на 80–90% идентичны известным изолятам S. dextrinosolvens и S. amylolytica . Интересно, что последовательности из кишечника пчел, которые были классифицированы как Succinivibrionaecae , были чрезвычайно разнообразны и включали 148 различных видов во всех образцах кишечника (Таблица 1).

Oenococcus , другой род, ранее не известный как связанный с колониями медоносных пчел, был вторым по распространенности родом в образцах пчелиного кишечника и наиболее часто встречающимся в образцах перги и цельной пчелы (Таблица 1). Oenococcus также сформировал большую фракцию (21%) основной микробиоты, которая была активна во всех типах образцов (рис. 1B), что позволяет предположить, что она играет значительную роль в микробиоме колоний медоносных пчел в целом. Oenococcus oeni , единственный охарактеризованный представитель этого рода, является факультативно анаэробной молочнокислой бактерией, которая хорошо известна своим участием в яблочно-молочной ферментации вина [74]. Oenococcus использует гексозы и пентозы в качестве источников углеводов, включая целлобиозу, дисахаридный компонент целлюлозы [74].Виды, связанные с Oenococcus oeni в нашем анализе, различались по идентичности последовательностей относительно известных изолятов (77-80% идентичности нуклеотидов) и могут представлять новую группу организмов в пределах Oenococcus , Leuconostoc и Weissella clade. .

Bifidobacterium и Paraloctobacillus , два потенциально пробиотических рода, представители которых известны своим участием в ферментации пищевых продуктов [75], [76], оказались высокоактивными в каждой взятой колонии (Таблица 1). Paralactobacillus входила в состав основной микробиоты колонии (рис. 1B) и составляла 10–28% от общей микробиоты в каждом типе образцов (таблица 1). Bifidobacterium составляла меньшую часть активного сообщества в каждой среде колонии и составляла от <1 до 4,7% от всех последовательностей. Интересно, что нагрузка родов, связанных с патогенами растений и животных, которые были активны в кишечнике пчел (Таблица 2), отрицательно коррелировала с активностью в кишечнике Bifidobacterium (Рисунок 3; корреляция Пирсона: r = -0.41, n = 22, p <0,05) (но не Paralactobacillus ; корреляция Пирсона: r = -0,27, n = 22, p = 0,232). Кроме того, Melissococcus , возбудитель европейского гнилостного расплода, никогда не обнаруживался в колониях с высокой нагрузкой Bifidobacterium (средняя нагрузка 4,7% в образцах пчелиного кишечника) и был обнаружен только в колониях с пониженной нагрузкой Bifidobacterium. видов (в среднем 2,7%), что позволяет предположить, что Bifidobacterium , многие виды которых являются пробиотиками в других системах [77], могут обеспечить некоторую защиту медоносных пчел от инфекции.

Рисунок 3. Численность Bifidobacterium обратно коррелировала с численностью патогенов.

Численность последовательностей активных Bifidobacterium (известного пробиотика) на колонию значительно и обратно коррелировала с численностью последовательностей в кишечнике пчел видов, принадлежащих к известным патогенным родам (корреляция Пирсона: r = -0,41, n = 22, р <0,05). Каждая точка данных представляет собой одну исследуемую колонию с генетически однородными колониями (красный цвет), отличными от генетически разнообразных (черный цвет).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962.g003

Генетическое разнообразие увеличивает количество и качество активных микробиот в семьях медоносных пчел

Мы стремились определить, увеличилось ли разнообразие или состав активной микробиоты колонии за счет увеличения генетического разнообразия ее рабочей популяции. U-критерий Манна-Уитни не выявил статистической разницы между типами колоний по количеству активных видов ( U = 63, p = 0.43), что не является неожиданным, учитывая наше относительно небольшое количество фокальных колоний, поэтому мы использовали бутстрап-анализ (5000 запусков, в которых случайным образом производилась повторная выборка колоний из генетически разнообразных и однородных групп обработки для получения средней разницы в среднем количестве уникальных OTU для каждую группу), потому что он обычно используется для получения большей мощности для распознавания статистических различий, когда наборы данных имеют небольшое количество повторов [78]. Анализ начальной загрузки показал, что колонии с генетически разнообразными рабочими популяциями показали значительно большее разнообразие активных бактериальных видов, чем колонии с генетически однородными рабочими популяциями [95% доверительный интервал (ДИ) для средней разницы в видовом разнообразии между генетически разнообразными и однородными колониями превышал 0; среднее значение разницы и 95% доверительный интервал для числа активных видов: 68, 64–73; Таблица 2, Таблица S2].Во всех колониях в каждой экспериментальной группе 1105 уникальных видов бактерий (при 97% идентичности последовательностей) были обнаружены в генетически разнообразных колониях и 781 вид были обнаружены в генетически однородных колониях. Кроме того, генетически разнообразные колонии имели большее количество последовательностей, связанных с активными бактериями известных полезных родов, и меньшее количество последовательностей, относящихся к родам, заведомо вредным, чем колонии, которые были генетически однородными (средние значения разницы и 95% доверительный интервал для числовых последовательностей известных патогенов. : 604, 587–614; для числа последовательностей Bifidobacterium : 388, 376–392; таблица 2).Активность известных патогенов животных и растений в пищеварительном тракте рабочих на основе количества последовательностей была на 127% выше в генетически однородных колониях по сравнению с генетически разнообразными, и эта нагрузка включала известный пчелиный патоген Melissococcus (хотя симптомы отсутствуют. заболеваний наблюдались в любой из наших колоний; Таблица 2). Напротив, генетически разнообразные колонии имели на 40% большую активность полезных пробиотических родов Bifidobacterium и Paralactobacillus (таблица 2).

Обсуждение

Бактерии удивительно многочисленны в семьях медоносных пчел — по оценкам, только кишечник медоносных пчел содержит от 10 ⁸ до 10 ⁹ бактерий на грамм содержимого [79]. Исторически сложилось так, что большинство попыток охарактеризовать эти многочисленные микробы основывались на культуральном подходе (обзор Gilliam 1997), который вносит присущую систематическую ошибку в каталог микробов, которые впоследствии идентифицируются в колониях. В более поздних исследованиях использовался независимый от культуры анализ последовательности гена 16S рРНК для исследования этого сообщества на основе однонитевого конформационного полиморфизма [80], библиотек клонов [46] — [48] и метагеномного проекта [4].За некоторыми исключениями [4], другие авторы сосредоточились на ДНК, которая была выделена из образцов пчел (которые могут включать контаминирующие организмы, не являющиеся частью активного бактериального сообщества [81] — [83]), и которые были относительно небольшими в масштабирование, выборка от десятков до нескольких сотен последовательностей 16S рРНК самое большее (по сравнению с 70 562 последовательностями, проанализированными здесь). Наше исследование отличается от этих предыдущих обзоров микробиоты медоносных пчел тем, что оно является первым методом 454-пиросеквенирования для глубокой выборки активных бактериальных сообществ (т.е. те, которые продуцируют РНК), которые связаны с несколькими средами колоний. Исследования с использованием пиросеквенирования 454-ампликона в подавляющем большинстве случаев показывают, что наиболее распространенные и активные микробы в окружающей среде производят наибольшее количество рРНК в этой среде [84] — [87], поэтому наши методы позволяют нам всесторонне каталогизировать микробиомы активных колоний без смещения культуры или путаница в отношении видов, которые присутствуют, но не функционируют в колониях. Мы считаем, что этот метод в сочетании с комплексным режимом отбора проб внутри и между многочисленными колониями объясняет удивительные открытия, которые мы сделали в отношении состава активных микробиот в семьях медоносных пчел.Другими объяснениями различий между нашим и другими исследованиями могут быть детали используемых молекулярных и вычислительных методов (например, используемые пары праймеров, протоколы для извлечения нуклеиновых кислот, обработка последовательностей или запрашиваемые базы данных [88]) или возраст пчел, которые были взяты пробы, которые могут вызывать изменения в составе микробиома по мере взросления особей (см. [89], [90]). Влияние географии отбора проб, вероятно, ограничено, поскольку имеется сильная эмпирическая поддержка стабильной и видоспецифической микрофлоры кишечника на больших географических территориях [91], [92], в том числе для подвидов A.mellifera [4].

Важно отметить, что два доминирующих рода, идентифицированные в нашем исследовании ( Succinivibrio и Oenococcus ), никогда не были идентифицированы в семьях медоносных пчел, что позволяет предположить, что основные микробиотические игроки, связанные с медоносными пчелами, были упущены из виду предыдущими методологиями. Действительно, тот факт, что известные изоляты Succinivibrio являются облигатными анаэробами, возможно, препятствовал их идентификации с помощью более традиционных попыток культивирования, что является значительным упущением, учитывая, что они составляли большую часть основной группы активных микробов, которые были обнаружены во всей колонии. среды, которые мы опробовали.Кроме того, грамположительные организмы, такие как Oenococcus , не были бы идентифицированы предыдущими исследованиями, если бы не были предприняты усилия для правильного лизирования этих клеток. Наш комплексный метод характеристики активной микробиоты медоносных пчел позволил нам сделать три важных и новых открытия, включая открытие в колониях медоносных пчел родов, связанных с обработкой пищи и ферментационными путями в других средах обитания, обратной зависимости между активностью известных пробиотических родов и известные бактериальные патогены, а также наблюдение, что полиандрия матки порождает более разнообразную и, возможно, более здоровую микробиоту в колониях.Сильная связь медоносных пчел с микробами отражает сильную зависимость других социальных насекомых от бактериальных симбионтов, которые перерабатывают относительно неперевариваемый корм в питательную пищу для своих хозяев [25] и обеспечивают защиту от патогенов [93]. Бактериальные роды, выявленные в этом исследовании, предполагают цели для изучения способов, которыми микробы могут принести пользу колониям социальных насекомых, таких как обеспечение либо защитных, либо пищевых преимуществ хозяевам путем предотвращения колонизации патогенных бактерий и / или повышения биодоступности питательных веществ в продукты, которые производят и потребляют население колонии.

Мы идентифицировали множество микроорганизмов в семьях медоносных пчел, которые связаны с ферментацией в анаэробных средах обитания. Культивируемые виды Succinivibrio являются облигатными анаэробами, которые не могут расти при атмосферных концентрациях кислорода, и мы обнаружили, что близкие родственники в значительном количестве активны в кишечнике пчел. Организмы, идентифицированные как Succinivibrionaceae в образцах пчел, были на 80–90% идентичны известным изолятам. Характерные виды из рода Succinivibrio включают S.dextrinosolvens и S. amylolytica , оба из которых были выделены из рубца коров и, как известно, играют важную роль в ферментации крахмалов и производстве больших количеств уксусной и янтарной кислот в этой среде [73], [73] [ 94]. Богатая крахмалом пчелиная кишка, вероятно, является идеальной средой обитания для Succinivibrionaceae . Кроме того, Succinivibrio может выполнять в этой среде анаэробную ферментацию сахаров, потребляемых пчелами, — процесс, который, как подозревали другие авторы, имеет место [37].Сходный состав сообществ, переваривающих полисахариды растений, в рубцах коров и кишках пчел является яркой иллюстрацией конвергенции двух разных микробиомов, связанных с хозяином. Метатранскриптомическое секвенирование кишечника пчел дало бы нам более полную картину функции, которую эти Succinivibrio -подобные организмы выполняют в этом микробном сообществе. Необходимость в анаэробной среде может объяснить отсутствие активности Succinivibrionaceae в пчелином хлебе; собранная пыльца, вероятно, не станет анаэробной в течение некоторого времени (если вообще не становится) после того, как она была заражена микробами и упакована в клетки рабочими.Однако возможно, что пчелиный хлеб стратифицирован по напряжению кислорода, что может позволить ему поддерживать ряд бактерий, включая аэробы и строгие анаэробы, поскольку структура сообщества изменяется с переработкой пищи и созреванием.

Пчелиные кишки и пчелиный хлеб, как известно, являются очень кислой средой [80] и могут отражать или определять присутствие молочнокислых бактерий (LAB). Важные LAB, которые были идентифицированы в нашем исследовании, включают Oenococcus , Bifidobacterium и Paralactobacillus , все из которых являются факультативными анаэробами.Активность этих LAB как в пчелином хлебе, так и в пчелином кишечнике предполагает, что эти среды могут быть временами анаэробными. Oenococcus обязательно гетероферментативен и хорошо известен своим участием в яблочно-молочной ферментации вина (декарбоксилирование малата с образованием лактата; [95]. Oenococcus использует гексозы и пентозы в качестве источников углеводов, включая целлобиозу, дисахаридный компонент целлюлозы [целлюлозо-харидный компонент]). 74]. Было высказано предположение, что осмотический потенциал пчелиного кишечника может помочь раскрыть пыльцевые зерна и облегчить пищеварение [31], но наши данные предполагают еще один возможный способ разрушения жестких стенок пыльцы во время брожения пчелиного хлеба.Гемицеллюлоза легко гидролизуется кислотой, а подкисление пчелиного хлеба при его ферментации LAB может помочь расщепить сложные растительные углеводы на составляющие их дисахариды, которые затем могут быть переработаны другими ферментативными организмами внутри сообщества.

В самом деле, другие кислотоустойчивые бактерии, такие как уксуснокислые бактерии (ААБ), предположительно играют большую роль в сообществе пчелиного кишечника, основываясь на их культивируемости, а также на их присутствии в библиотеках клонов 16S рРНК [96] .В нашем наборе данных было обнаружено только два вида AAB: Saccharibacter и Swaminathania видов. В целом, AAB составляют менее 3% от общей активной микробиоты медоносных пчел (на основе численности последовательностей). Хотя микробы, которые существуют в небольшом количестве, безусловно, могут влиять на сообщество либо через секрецию метаболитов, либо за счет эффектов посева [97], тот факт, что мы использовали кДНК в качестве матрицы для нашего секвенирования, свидетельствует против очень активного сообщества AAB в семьях медоносных пчел.

Присутствие двух потенциально пробиотических LAB в наших образцах заслуживает особого внимания. Виды Bifidobacterium и Paralactobacillus хорошо известны своим участием в ферментации йогурта и других пищевых продуктов соответственно [98]. Оба рода относятся к Lactobacillaceae, группе LAB, которая включает важные организмы, участвующие в производстве японского саке ( Lactobacillus sakei ) и вина ( L. casei ) [75].Это факультативно гетероферментативные лактобациллы со способностью использовать ряд гексоз и пентоз, включая целлобиозу [76]. Bifidobacterium , как ранее было обнаружено, ассоциируется с социальными насекомыми [99], включая медоносных пчел [4], [48], [100], и один штамм Paralactobacillus был запатентован за его способность защищать от патогенов [101]. ]. Мы обнаружили, что чем более активным было сообщество Bifidobacterium в кишечнике пчел, тем ниже была активность родов бактерий, к которым принадлежат известные патогены.Эта корреляционная связь предполагает возможность того, что Bifidobacterium может принести пользу пчелам для здоровья, возможно, за счет модуляции их иммунного ответа [102] или исключения патогенов [103]. Конкретные организмы Bifidobacterium , которые были идентифицированы в ходе этого исследования, могут обеспечивать отличную пробиотическую активность для медоносных пчел, и мы выбрали их для культивирования.

Центральным аспектом нашего исследования было изучение влияния полиандрии королевы и генетического разнообразия, которое она вносит в колонии, на микробиоту колоний.Наш анализ показал, что генетически разнообразные колонии имели более разнообразные активные микробиоты на уровне видов, чем генетически однородные колонии. Это открытие перекликается с наблюдением экологических исследований, согласно которому генетическое разнообразие в популяциях хозяев порождает разнообразие в других частях сообщества, которое эти популяции поддерживают [104] — [106], включая микробные сообщества [107]. Наличие множества генотипов хозяев в одной и той же колонии, каждый из которых может быть связан с разной микробиотой, является одним из способов увеличения разнообразия кишечника в колонии с полиандрозной маткой.В качестве альтернативы, у каждого рабочего может быть общий микробиом, связанный с его сокамерниками. Также наблюдались интригующие различия между типами колоний в содержании микробиоты, в частности, в количестве последовательностей, связанных с родами бактерий, члены которых, как известно, вредны или полезны. Мы наблюдали стабильно меньшее количество последовательностей из потенциально патогенных родов в генетически разнообразных колониях по сравнению с генетически однородными колониями, паттерн, который сохранялся для нескольких родов (таблица 2).Ранее было обнаружено, что многие из этих родов ассоциируются с колониями медоносных пчел [46], [47], [80], хотя их специфические патологии (если таковые имеются у медоносных пчел) охарактеризованы не все. Мы также наблюдали большее количество последовательностей, которые были связаны с потенциально пробиотическими родами в колониях с высоким уровнем разнообразия по сравнению с колониями с низким разнообразием (Таблица 2). Эти ключевые результаты согласуются с наблюдениями о том, что генетически разнообразные колонии снижают проявление симптомов при заражении бактериальными патогенами по сравнению с колониями, в которых отсутствует такое разнообразие в своей рабочей силе [56] — [58], хотя роль, которую полезные микробы могут играть в модуляции колоний ответ в настоящее время открыт для предположений.Разнообразие микробов в здоровых, генетически разнообразных колониях может обеспечить устойчивость к колонизации патогенами [108], [109] и может иметь огромное значение для здоровья медоносных пчел, учитывая, что медоносные пчелы имеют значительно ослабленную иммунную систему по сравнению с другими модельными насекомыми [110] . Наши будущие исследования будут стремиться понять, как внутриколониальное генетическое разнообразие генерирует и поддерживает более разнообразные и полезные микробиоты, а также селективное преимущество этого явления для семей медоносных пчел. Необходимость раскрыть потенциал генетического разнообразия для улучшения здоровья и продуктивности колоний за счет улучшенного питания особенно актуальна, учитывая, что плохое питание явно определено как вероятный фактор, способствующий недавней гибели колоний [111], [112] и постоянные опасения по поводу уровни генетического разнообразия в популяциях медоносных пчел и качество спаривания маток в программах пчеловодства [12], [113].

Материалы и методы

Создание пчелиных семей

колоний медоносных пчел (n = 30) были созданы для исследования в колледже Уэллсли (Уэлсли, Массачусетс, США) в 2010 году. Для создания генетически разнообразных или однородных популяций пчелосемей в каждой колонии удаляли постоянную матку и заменяли ее матка, осемененная 1 мкл спермы, полученной либо от группы из 15 различных трутней, либо от одного трутня, что привело к их размножению или одиночному спариванию, соответственно (королевы выращивались на пасеке Гленн, Фоллбрук, Калифорния).Оплодотворяющие дроны были отобраны случайным образом из колоний банка дронов, каждая из которых содержала особей из более чем 10 исходных колоний, происходящих из линий карниолана, кордована, гигиенического итальянского и чувствительных к варроа гигиенических линий, содержащихся у заводчика маток (было взято не более 4 трутней на одну птицу). банк). Сперма от каждого дрона использовалась для осеменения только одной из подопытных маток. Все осемененные королевы были дочерьми однократно осемененной карниольской королевы и, следовательно, были тесно связаны друг с другом (r = 0.75), в то время как дроны были взяты из самых разных колоний и, как предполагалось, не были связаны между собой. Королевы были введены в колонии 11 мая, и им было дано два месяца на полную замену рабочих маток своими собственными, в течение которых колонии еженедельно контролировались на предмет общего состояния здоровья и жизнеспособности маток. Перед началом отбора проб восемь колоний были исключены из исследования, поскольку их матки были плохими яйцеклетками, в результате чего осталось 10 генетически однородных колоний и 12 генетически разнообразных колоний, по которым можно было оценить бактериальные сообщества.

Отбор проб из семей медоносных пчел

Чтобы глубже охарактеризовать бактериальные сообщества, которые связаны с пчелами и пергой, мы выполнили пиросеквенирование, меченное 16S рРНК. Наша стратегия отбора проб включала взятие 4–5 образцов на каждую колонию (либо целые пищеварительные тракты рабочих пчел, целые рабочие пчелы или пчелиный хлеб) и объединение образцов в каждой колонии для амплификации 16S рРНК. Мы убедились, что отобранные рабочие были одного возраста внутри и между колониями, чтобы уменьшить вариабельность, которая могла быть результатом возрастных или поведенческих кастовых различий.Мы подобрали рабочих по возрасту, поместив рамки с окукливающимся выводком из каждой очаговой колонии в инкубатор с температурой 34 ° C, позволив рабочим выйти взрослыми в течение ночи из камер, пометив только что появившихся особей краской на их грудной клетке и вернув всех отмеченных рабочих и рамки в их исходная колония. Отмеченные краской рабочие были впоследствии собраны из колоний в возрасте 12 дней. Образцы перги были взяты из рамок, которые были помещены в колонии при введении осемененных маток; в то время каркасы были только фундаментным воском, и все содержимое сот и сот было произведено локальными генетически разнообразными или однородными рабочими популяциями в течение двух месяцев между интродукцией матки и взятием образцов колонии.Соответствующие меры предосторожности были приняты в полевых условиях во время отбора проб для предотвращения перекрестного заражения между пробами и колониями, включая использование перчаток и стерильного оборудования для отбора проб. Особое внимание было уделено надлежащему хранению образцов при отборе. Пробы цельной пчелы и перги были мгновенно заморожены в жидком азоте в полевых условиях, чтобы гарантировать, что структура бактериальных сообществ, которые были взяты, представляла in situ разнообразия. Пчелиные кишки (весь пищеварительный тракт, включая желудок с медом) собирали у рабочих в поле путем иммобилизации помеченных особей на льду, вскрытия их кишок, немедленного помещения их в РНК позже (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) и хранения всех образцы кишечника при 4 ° C до дальнейшей обработки.

Выделение РНК и синтез кДНК

Мы специально выделили целую РНК из наших образцов, что позволило нам определить активных бактерий в колониях и избежать включения в наши анализы спящих спор, которые могли быть собраны пчелами вместе с пыльцой. Целые образцы пчел измельчали ​​в жидком азоте перед тем, как приступить к дальнейшим экстракциям; все остальные образцы обрабатывались в том виде, в котором они были собраны. Каждый образец подвергали взбиванию шариками при 4 ° C в течение 7 минут для обеспечения лизиса грамположительных клеток.Наборы MoBio (Калифорния, США), подходящие для каждого типа образцов, использовали в соответствии с инструкциями производителя для выделения РНК из образцов перги (набор RNA Powersoil Total RNA) и образцов цельной пчелы и пчелиного кишечника (Ultraclean Tissue and Cells RNA Isolation). Комплект). Все экстракты РНК подвергали обработке ДНКазой для удаления этой загрязняющей нуклеиновой кислоты. Для каждого типа образца на колонию отдельные экстракты РНК были объединены, но только после того, как они были нормализованы по концентрации, чтобы гарантировать, что каждый индивидуум вносит равный вклад в объединенный образец.Таким образом, каждая колония была представлена ​​одним объединенным образцом пчелиного кишечника, перги и цельной пчелы. Эти объединенные экстракты затем подвергали реакции обратной транскриптазы с использованием случайных гексамеров для получения кДНК (Thermo Scientific, MA, США). Концентрации кДНК в каждом образце оценивали с помощью спектрофотометрии (Nanodrop 2000, Wilmington, DE, USA) и гель-электрофореза, а затем нормализовали для реакций ПЦР, описанных ниже.

Амплификация гена 16S рРНК и пиросеквенирование ампликонов со штрих-кодом

Микробиоты, обнаруженные в образцах пчелиного хлеба, пчелиных кишок и целых пчел, были проанализированы с помощью пиросеквенирования с массовым параллельным штрих-кодом.Фрагмент гена 16S рРНК (~ 330 п.н.), который охватывает гипервариабельные области V1 и V2, амплифицировали с помощью ПЦР с кДНК. Универсальные бактериальные праймеры 27F [114] и 338RII [115] были модифицированы путем добавления адаптеров лигирования и / или штрих-кодов (то есть последовательностей для идентификации образца) на 5′-концах (см. Метаданные DDBJ для праймеров). ПЦР выполняли с использованием высокоточной полимеразы (Phusion Hot Start, Finnzymes, Lafayette, CO, США), температуры отжига 50 ° C, матрицы 1500 нг в объемах 50 мкл и 25 циклов, чтобы ограничить влияние смещения и ошибок ПЦР. которые вводятся непроверяющими полимеразами.Ампликоны, очищенные и сконцентрированные до 50 мкл с использованием наборов Qiagen PCR Cleanup (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), количественно оцененные с помощью Nanodrop 2000 (Уилмингтон, Делавэр, США) и стандартизованные до 100 нг / мкл, использовали в качестве матриц для эмульсии. ПЦР с использованием набора emPCR II (Roche, Branford, CT). ДНК секвенировали с использованием пиросеквенатора GS-FLX (Roche) и набора GS-Titanium (Roche) от Beckman Coulter Genomics (Danvers, MA, США) на титановых планшетах GS FLX Titanium Pico Titre Plates в соответствии со стандартными протоколами Roche.

Обработка и анализ последовательностей

последовательности в формате FASTA и соответствующие показатели качества были извлечены из файла.Файл данных .sff, созданный пиросеквенсором с использованием программного пакета GS Amplicon (Roche, Branford, CT). Вся предварительная обработка данных, анализ операционных таксономических единиц (OTU), анализ филотипов и проверка гипотез выполнялись с использованием модулей, реализованных на программной платформе Mothur [116]. Объединенные последовательности были объединены в соответствии с колонией, из которой они были получены, с использованием уникальных штрих-кодов на праймерах (они были удалены перед последующим анализом). На этом этапе праймерные области также были удалены из последовательностей.Длина и качество последовательности оценивались для каждого считывания; Последовательности отбирались, если длина была <300 п.н. и> 500 п.н., средний показатель качества SFF был <30, они содержали какие-либо неоднозначные вызовы оснований или не соответствовали ни одному из праймеров или идентификаторов колоний штрих-кода. Набор данных был упрощен за счет использования команды «unique.seqs» для создания неизбыточного (уникального) набора последовательностей. Уникальные последовательности были выровнены с использованием команды «align.seqs» и адаптации базы данных Bacterial SILVA SEED в качестве шаблона (доступно по адресу: http: // www.mothur.org/wiki/Alignment_database). Чтобы гарантировать, что мы анализируем сопоставимые области гена 16S рРНК во всех чтениях, последовательности, которые начинались до 2,5-процентиля или заканчивались после 97,5-процентиля в выравнивании, были отфильтрованы. Последовательности были удалены с помощью команды «pre.cluster». Эта команда применяет алгоритм псевдо-одиночного связывания с целью удаления последовательностей, которые, вероятно, связаны с ошибками пиросеквенирования [117]. Всего 2154 потенциально химерных последовательности были обнаружены и удалены с помощью «химеры.убийца »[118]. Выровненные последовательности были сгруппированы в OTU (определяемые 97% -ным сходством) с использованием алгоритма среднего соседа. Кривые разрежения были построены для каждого образца, а взвешенная дендрограмма UniFrac [119] была построена с использованием модуля UniFrac, реализованного в Mothur. Алгоритм UniFrac определил расстояние между различными микробными сообществами на основе состава клонов, обнаруженных в каждом образце. Важно отметить, что UniFrac учитывает филогенетическое родство линий в каждом образце.Все параметры разнообразия сообществ (Shannon-Weaver, Chao1 и Simpson) были рассчитаны, как описано в руководстве по программному обеспечению Mothur. Последовательности были таксономически классифицированы с помощью наивного байесовского классификатора RDP-II [120] с использованием доверительного порога 60%. Последовательности, которые нельзя было классифицировать, по крайней мере, на уровне царства, были исключены из последующего анализа разнообразия. Диаграммы Венна и рисунки тепловых карт были созданы с использованием пользовательских скриптов Perl. Наборы данных пиросеквенции доступны через регистрационный номер архива чтения последовательностей EBI / DDBJ DRA000526.Основываясь на этих процедурах, мы используем термин «виды» для обозначения операционных таксономических единиц (OTU) с порогом идентичности последовательностей 97%.

Статистический анализ

Корреляции Пирсона и U-тесты Манна-Уитни использовали классификационные данные, полученные с помощью конвейера Mothur (описанного выше), и были запущены в статистическом пакете SPSS. Анализы начальной загрузки (5000 запусков на анализ) также основывались на данных и средних классификациях, стандартных отклонениях от средних различий, поскольку доверительные интервалы были выполнены для 5000 повторов с использованием собственного Perl-скрипта.Анализ начальной загрузки был выполнен таким образом, что случайно выбранные 10 из 12 генетически разнообразных колоний сравнивались с 10 генетически однородными колониями. Для каждой выборки рассчитывалась разница между типами колоний в общем количестве видов, а также количество последовательностей, связанных с известными патогенами или Bifidobacterium . Были рассчитаны 95% доверительные интервалы (ДИ) вокруг значений разницы средних значений, и нулевая гипотеза о том, что не было эффекта увеличения разнообразия внутри колонии, была отвергнута, если ноль не был включен в ДИ.

Дополнительная информация

Рисунок S1.

Ранжируйте графики численности для каждой среды, выбранной для отбора проб, в колониях медоносных пчел. Для каждой среды OTU ранжируются по количеству в наборе данных, так что наиболее распространенные OTU находятся в крайнем левом положении, а OTU все реже — справа от порядковой оси. Образцы пчелиного кишечника содержали намного больше редких ОТЕ (одиночные и двойные) по сравнению с образцами пчелиного хлеба и цельной пчелы, что, вероятно, является следствием более глубокой выборки последовательностей в этой среде.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962.s001

(TIF)

Рисунок S2.

Кластеризация Unifrac, повторяемая с нормализованными библиотеками, суммирует результаты для всего набора данных. Взвешенная, на основе видов (идентичность 97%) Unifrac-кластеризация отобранных сред в каждой исследуемой колонии с использованием нормализованных библиотек для каждого типа среды. Отобранные образцы среды обитания колоний окрашены следующим образом: образцы пчелиного кишечника окрашены в бледно-лиловый цвет; Пробы цельной пчелы выделены зеленым цветом, а образцы перги — розовым, как на Рисунке 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962.s002

(TIF)

Рисунок S3.

Сравнение сред колоний с использованием нормализованных библиотек. Диаграмма Венна, представляющая видовое разнообразие (97% идентичности) активных бактериальных сообществ, которые были обнаружены в трех связанных с пчелами средах отбора проб (пчелиный хлеб, пчелиные кишки и целые пчелы), объединенные по типу колонии и нормализованные для размера библиотеки . Общее видовое богатство в наборе данных составило 216 OTU, при этом наиболее богатая видами среда — это пчелиные кишки (всего 174 вида).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962.s003

(TIF)

Таблица S1.

Обнаружены анаэробные роды, связанные с образцами медоносных пчел. Число уникальных последовательностей, связанных с факультативными (F) и облигатными (O) анаэробами, обнаруженных во всех трех связанных с пчелами средах отбора проб (пчелиные кишки, пчелиный хлеб и целые пчелы).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0032962.s004

(DOCX)

Таблица S2.

Статистика секвенирования по образцам. Все показатели разнообразия, полученные при анализе каждого образца колонии. Столбцы в следующем порядке: метка (уровень дивергенции), группа (идентификатор колонии), nseqs (количество последовательностей, покрытие, npshannon, simpson, simpson_lci, simpson_hci, sobs, chao, chao_lci, chao_hci,