Компания мед ополья: Мед Ополья — производство и продажа натурального меда

работает

Информация обновлена: 08.02.2017.

Акции — Мед Ополья — торговая компания во Владимире на СКИДКОМ.РФ

Пн:09:00-20:00; Вт:09:00-20:00; Ср:09:00-20:00; Чт:09:00-20:00; Пт:09:00-20:00; Сб:09:00-20:00; Вс:09:00-20:00

Пн:09:00-20:00; Вт:09:00-20:00; Ср:09:00-20:00; Чт:09:00-20:00; Пт:09:00-20:00; Сб:09:00-20:00; Вс:09:00-20:00

Пн:09:00-20:00; Вт:09:00-20:00; Ср:09:00-20:00; Чт:09:00-20:00; Пт:09:00-20:00; Сб:09:00-20:00; Вс:09:00-20:00

Пн:09:00-20:00; Вт:09:00-20:00; Ср:09:00-20:00; Чт:09:00-20:00; Пт:09:00-20:00; Сб:09:00-20:00; Вс:09:00-20:00

Пн:09:00-20:00; Вт:09:00-20:00; Ср:09:00-20:00; Чт:09:00-20:00; Пт:09:00-20:00; Сб:09:00-20:00; Вс:09:00-20:00

Пн:09:00-20:00; Вт:09:00-20:00; Ср:09:00-20:00; Чт:09:00-20:00; Пт:09:00-20:00; Сб:09:00-20:00; Вс:09:00-20:00

ГАСТРОНОМИЧЕСКИЙ ТУР (ПОКРОВ-ВЛАДИМИР-ЮРЬЕВ-ПОЛЬСКИЙ РАЙОН-СУЗДАЛЬ)

«Покровский пряник» — квест-экскурсия «Легенды Городничего» —
музей Ложки – «НЕБО 33» – «Мед Ополья» – «Русская плетенка»
2 дня/ 1 ночь
1 день. Сбор группы в Москве. Переезд в Покров.
Экскурсия на завод «Покровский пряник» — туристы окунутся в пряничный мир! Введение в экскурсию начинается с исторической экспозиции пряничного дела. Высококвалифицированные экскурсоводы расскажут и покажут первые инструменты приготовления старорусского лакомства, раскроют особенности приготовления пряника той эпохи. Здесь можно продегустировать продукцию.
Переезд во Владимир. Обед.

Юрьев-Польский – Русь Крестьянская

Обзорная экскурсия по городу Юрьев-Польский.
Посещение Юрьев-Польского историко-архитектурного и художественного музея, расположенного в Михаило-Архангельском монастыре. Георгиевский собор XIII века, колокольня со смотровой площадкой, храм Михаила-Архангела, экспозиция «История мануфактуры Юрьев-Польского уезда», мастер-класс по масляной набойке на ткань.

Экскурсия на старейшее крупное промышленное предприятие «Авангард» с посещением музея и фирменного магазина, где можно приобрести продукцию из натурального экологически чистого сырья.

Отправление в с. Симу.
Посещение усадьбы Голицыных и народного музея П. И. Багратиона.
Дорожный сюрприз. Автобус с туристами встречают «крестьянки», возвращающиеся «с богомолья из Сергиевой Лавры» (у сосны, от которой несли на руках П. И. Багратиона). Рассказ крестьянок об усадьбе, о живущих там привидениях, о родственных связях родов Багратиона и Голицыных, о народной любви и известности Петра Ивановича среди окрестного населения.

Усадьба Голицыных.
Регулярный парк, вековые дубы и липы — свидетели событий XIX в., особняк. Туристов встречает дворецкий, провожает в комнаты, занимает приехавших гостей рассказом о первом визите П. И. Багратиона в Симу. Появляется княгиня Анна. Она журит дворецкого, велит вынести квасу да пирогов, угостить путников с дороги. Княгиня Анна приглашает гостей в горницу, где княжеские белошвейки занимаются рукоделием. Княжеские белошвейки изготавливают вместе с туристами ароматные мешочки с чаем, которые им дарятся на память в качестве сувенира.

Пешая прогулка к храму Дмитрия
Солунского — по пути следования процессии, провожавшей П. И. Багратиона в последний путь. Памятник П. И. Багратиону на месте его первого захоронения.

Переезд в деревню Леднево.
Посещение компании «Мед Ополья» (крестьянско-фермерское хозяйство, дегустационный зал, пасека). Дегустация и приобретение меда и других продуктов пчеловодства. Чаепитие с медом и пирогами.

Молочная продукция ОПОЛЬЕ | Питание и здоровье

Комплектовщик Склад готовой продукции Ополье WBD PepsiCo (Юрьев-Польский молочный комбинат)

PepsiCo в России. Все вкусы успеха. Компания PepsiCo – один из мировых лидеров на рынке продуктов питания и напитков с годовым объемом продаж более 65 млрд. долларов США. Компания выпускает широкий ассортимент продукции, включая 22 бренда, ежегодные розничные продажи каждого из которых превышают 1 млрд. долларов. Все вкусы успеха: PepsiCo – крупнейший в России производитель продуктов питания и напитков. Инвестиции PepsiCo в экономику России составляют более 9 млрд. долларов. В России компания представлена более чем 30 предприятиями. В 2011 году в «семью» PepsiCo вошла основанная в 1992 году компания «Вимм-Билль-Данн», занимавшая лидирующие позиции на рынке молочных продуктов и напитков в России и СНГ. PepsiCo является одним из крупнейших международных работодателей. В российском подразделении компании работает более 24 500 сотрудников. Компания входит в число наиболее привлекательных работодателей и занимает высокие позиции в международных и российских рейтингах. Вкус роста: Высокие темпы роста нашего бизнеса создают оптимальные условия для динамичной карьеры. Карьерный рост в PepsiCo не ограничивается движением вверх по карьерной лестнице, но предполагает также развитие в занимаемой должности, изменение функционала, перевод в другой город или кросс-категорийный переход. Сотрудник выбирает свой путь к успеху, руководствуясь индивидуальными ценностями, знаниями и опытом, а также теми возможностями, которые предоставляет компания. Линейный руководитель и компания являются основными партнерами сотрудника в процессе развития карьеры. Вкус признания: PepsiCo предлагает своим сотрудникам привлекательный компенсационный пакет. Помимо конкурентной заработной платы, он включает премии, добровольное медицинское страхование, страхование жизни от несчастного случая и другие корпоративные льготы. В PepsiCo разработаны единые правила определения заработной платы и льгот в соответствии с оценкой должностей. Система вознаграждения построена на принципах внутренней справедливости и поощрения за результативность работы. В компании действуют многочисленные инструменты, позволяющие отмечать выдающиеся достижения сотрудников и поддерживать культуру, в которой коллеги не забывают благодарить друг друга. Вкус причастности: Мы гордимся легендарной историей PepsiCo и стабильно добиваемся успеха, работая в команде победителей. Мы заботимся об окружающем мире и строим наш бизнес, опираясь на принципы устойчивого развития, предлагая потребителям вкусные и полезные продукты питания и напитки, фокусируясь на защите окружающей среды и создавая комфортные условия для развития талантов. Вкус свободы: Сотрудники PepsiCo — яркие и незаурядные личности, которым близок дух предпринимательства и присуща свобода во всем — от стиля работы до стиля жизни. Компания предоставляет своим сотрудникам большую самостоятельность в реализации проектов. Деловые взаимоотношения и культура PepsiCo строятся на уважении мнений, взглядов и образа жизни разных людей (мы называем этот принцип «Разнообразие и вовлечение»). Несмотря на амбициозные цели, компания уделяет большое внимание соблюдению баланса между профессиональной деятельностью и личной жизнью сотрудников.

Работа в Юрьеве-Польском (Владимирская область). Новые вакансии в города

Свежие вакансии — Юрьев-Польский:

Careerjet

вакансии — Юрьев-Польский — Россия — Careerjet

Кладовщик Основного производства (Юрьев-Польский, молочное производство Ополье PepsiCo)

Юрьев-Польский, Владимирская Область — Условия:
&nbsp — Предприятие: АО Холдинговая компания Ополье, современное сертифицированное производство молочной продукции («Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник», а также молочной продукции федеральных ритейлеров). АО ХК Ополье с 2012 года входит в состав международной компании PepsiCo. Адрес предприятия: г. Юрьев-Польский, ул. Производственная, 3
&nbsp — Трудоустройство на срочный период — до 01.10.19 (на период перевода сотрудницы в другое подразделение), при наличии вакансий готовы будем…

Лаборант химического анализа Ополье PepsiCo (г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область —
&nbspсоцпакет, ДМС, компенсация стоимости первичного медосмотра и оформления мед.книжки
&nbspПредприятие: молочное производство Ополье PepsiCo, г. Юрьев-Польский, ул. Производственная
&nbspГрафик работы: сменный, 2/2 (день/ночь/2 выходных, дневная смена: с 08.00 до 20.00, ночная смена: с 20.00 до 08.00).
&nbspЕжемесячный уровень дохода: оклад+премия+доплата за работу в ночные часы
&nbspОбучение профессии с опытными наставниками, возможность карьерного и профессионального роста и развития в компании. Qualifications…

Инженер-электроник Pepsico (молочное производство в г. Юрьев-Польский Владимирская область)

Юрьев-Польский, Владимирская Область — Условия:
&nbsp — Предприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав российско-западной компании PepsiCo.
&nbsp — Адрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул…

Кладовщик (Юрьев-Польский, молочное производство Ополье Pepsico)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область —
&nbspпродукции федеральных ритейлеров). АО ХК Ополье с 2012 года входит в состав международной компании PepsiCo. Адрес предприятия: г. Юрьев-Польский, ул. Производственная, 3
&nbspТрудоустройство на срочный период — до 01.10.19 (на период перевода сотрудницы в другое подразделение), при наличии вакансий готовы будем перести на постоянный или более длительный срочный период.
&nbspГибкий график работы (не более 170 рабочих часов в месяц): часть времени сотрудник будет работать в графике 5/2 (пн-пт 8-17.00), часть…

Инженер-электроник PepsiCo (г. Юрьев-Польский, молочное производство)

PepsiCo — Владимир — . Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в состав российско-западной компании PepsiCo.
&nbsp- Адрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул. Производственная
&nbsp- Нет корпоративного транспорта, компенсации ГСМ за использованием личного транспорта или компенсации за аренду жилья
&nbsp- Официальное трудоустройство по ТК РФ, полный соц. пакет, полис ДМС, страхование жизни…

Инженер-электроник PepsiCo (г. Юрьев-Польский, молочное производство)

PepsiCo — Иваново — . Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в состав российско-западной компании PepsiCo.
&nbsp- Адрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул. Производственная
&nbsp- Нет корпоративного транспорта, компенсации ГСМ за использованием личного транспорта или компенсации за аренду жилья
&nbsp- Официальное трудоустройство по ТК РФ, полный соц. пакет, полис ДМС, страхование жизни…

Инженер-электроник PepsiCo (г. Юрьев-Польский, молочное производство)

PepsiCo — Кольчугино, Владимирская Область — . Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в состав российско-западной компании PepsiCo.
&nbsp- Адрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул. Производственная
&nbsp- Нет корпоративного транспорта, компенсации ГСМ за использованием личного транспорта или компенсации за аренду жилья
&nbsp- Официальное трудоустройство по ТК РФ, полный соц. пакет, полис ДМС, страхование жизни…

Инженер-механик (молочное производство Ополье Pepsico, г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Владимир —
&nbsp Участие в обучении/адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp Требования:
&nbspГотовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области или возможность ездить на личном а/м
&nbspОбразование: среднее профессиональное / высшее… стажировок / производственных практик
&nbspМы ищем ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Мы предлагаем:
&nbspАдрес предприятия: молочное производство Ополье WBD PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул.
&nbspПроизводственная д.3 (производство молочной продукции торговых марок «Ополье», «Домик в Деревне»)
&nbspОфициальное трудоустройство по ТК РФ с первого рабочего дня, полный…

Инженер-механик (молочное производство Ополье Pepsico, г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Кольчугино, Владимирская Область —
&nbsp Участие в обучении/адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp Требования:
&nbspГотовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области или возможность ездить на личном а/м
&nbspОбразование: среднее профессиональное / высшее… стажировок / производственных практик
&nbspМы ищем ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Мы предлагаем:
&nbspАдрес предприятия: молочное производство Ополье WBD PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул.
&nbspПроизводственная д.3 (производство молочной продукции торговых марок «Ополье», «Домик в Деревне»)
&nbspОфициальное трудоустройство по ТК РФ с первого рабочего дня, полный…

Инженер-электроник PepsiCo (г. Юрьев-Польский, молочное производство)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область — . Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в состав российско-западной компании PepsiCo.
&nbsp- Адрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул. Производственная
&nbsp- Нет корпоративного транспорта, компенсации ГСМ за использованием личного транспорта или компенсации за аренду жилья
&nbsp- Официальное трудоустройство по ТК РФ, полный соц. пакет, полис ДМС, страхование жизни…

Инженер-механик (молочное производство Ополье Pepsico, г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Иваново —
&nbsp Участие в обучении/адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp Требования:
&nbspГотовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области (нет компенсации аренды квартиры)
&nbspОбразование: среднее профессиональное / высшее профессиональное… / производственных практик
&nbspМы ищем ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Мы предлагаем:
&nbspАдрес предприятия: молочное производство Ополье WBD PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул.
&nbspПроизводственная д.3 (производство молочной продукции торговых марок «Ополье», «Домик в Деревне»)
&nbspОфициальное трудоустройство по ТК РФ с первого рабочего дня, полный соц. пакет, ДМС…

Инженер-механик (молочное производство Ополье Pepsico, г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область —
&nbspсовременным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Мы предлагаем:
&nbspАдрес предприятия: молочное производство Ополье WBD PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул.
&nbspПроизводственная д.3 (производство молочной продукции торговых марок «Ополье», «Домик в Деревне»)
&nbspОфициальное трудоустройство по ТК РФ с первого рабочего дня, полный соц. пакет, ДМС, страхование жизни
&nbspГрафик работы:
&nbsp- Основной график работы сменный: день (08-20.00) / ночь…

Инженер-электроник Pepsico (молочное производство в г. Юрьев-Польский Владимирская область)

Юрьев-Польский, Владимирская Область — Условия:
&nbsp — Предприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав российско-западной компании PepsiCo.
&nbsp — Адрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул…

Инженер-электроник Ополье PepsiCo (г. Юрьев-Польский Владимирская область)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область —
&nbspспециальностей ВУЗов (Электроснабжение, Автоматизация, Радиотехника и тп.) без опыта работы, которым действительно интересно развитие в технической сфере.
&nbsp Условия:
&nbspАдрес предприятия: Юрьев-Польский молочный комбинат Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул. Производственная д.3
&nbspОфициальное трудоустройство по ТК РФ, полный соц. пакет, дополнительное медицинское страхование и страхование жизни, компенсация первичного прохождения медосмотра и оформления медицинской книжки перед…

Инженер-электроник Pepsico (молочное производство в г. Юрьев-Польский Владимирская область)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область — Условия:
&nbsp Предприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав российско-западной компании PepsiCo.
&nbspАдрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул…

Инженер-электроник Pepsico (молочное производство в г. Юрьев-Польский Владимирская область)

PepsiCo — Владимир — Условия:
&nbsp Предприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав российско-западной компании PepsiCo.
&nbspАдрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул…

Инженер-электроник Pepsico (молочное производство в г. Юрьев-Польский Владимирская область)

PepsiCo — Кольчугино, Владимирская Область — Условия:
&nbsp Предприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав российско-западной компании PepsiCo.
&nbspАдрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул…

Инженер-механик (молочное производство Pepsico,г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Иваново —
&nbspобучении/адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp
&nbspТребования:
&nbsp Готовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области
&nbspОбразование: среднее профессиональное / высшее профессиональное (техническая специальность).
&nbspОпыт работы… ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Условия:
&nbspПредприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в состав…

Кладовщик Основного производства (Юрьев-Польский, молочное производство Ополье PepsiCo)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область — Условия:
&nbsp Предприятие: АО Холдинговая компания Ополье, современное сертифицированное производство молочной продукции («Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник», а также молочной продукции федеральных ритейлеров). АО ХК Ополье с 2012 года входит в состав международной компании PepsiCo. Адрес предприятия: г. Юрьев-Польский, ул. Производственная, 3
&nbspТрудоустройство на срочный период — до 01.10.19 (на период перевода сотрудницы в другое подразделение), при наличии вакансий готовы будем…

Инженер-механик (молочное производство Pepsico,г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Владимир —
&nbspобучении/адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp
&nbspТребования:
&nbsp Готовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области
&nbspОбразование: среднее профессиональное / высшее профессиональное (техническая специальность).
&nbspОпыт работы… ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Условия:
&nbspПредприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав…

Инженер-механик (молочное производство Pepsico,г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область —
&nbspобучении/адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp
&nbspТребования:
&nbsp Готовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области
&nbspОбразование: среднее профессиональное / высшее профессиональное (техническая специальность).
&nbspОпыт работы… ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Условия:
&nbspПредприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав…

Инженер-электроник Pepsico (молочное производство в г. Юрьев-Польский Владимирская область)

PepsiCo — Иваново — Условия:
&nbsp Предприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года АО ХК Ополье входит в ростав российско-западной компании PepsiCo.
&nbspАдрес места работы сотрудника: молочное производство Ополье PepsiCo, Владимирская область, г. Юрьев-Польский, ул…

Инженер-механик Ополье PepsiCo (г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область — /адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp Qualifications/Requirements
&nbsp Требования:
&nbsp Готовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области или готовность самостоятельно на личном а/м ездить на работу
&nbspОбразование: среднее… и/или опытом опытом стажировок / производственных практик
&nbspМы ищем ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp Условия:
&nbspПредприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье…

Инженер-механик АО ХК Ополье Pepsico (г. Юрьев-Польский)

PepsiCo — Юрьев-Польский, Владимирская Область — /адаптации новых сотрудников производства по эксплуатации и базовой наладке/настройке оборудования
&nbspСвоевременное обновление документации и рабочих инструкций по обслуживанию и ремонту оборудования
&nbspУчастие в ведение сменной отчетности о результатах работы по ремонту оборудования, заполнение сменных журналов
&nbsp Qualifications/Requirements
&nbsp Требования:
&nbsp Готовность к переезду в г. Юрьев-Польский Владимирской области
&nbspОбразование: среднее профессиональное / высшее профессиональное (техническая… практик
&nbspМы ищем ответственного сотрудника, готового обучаться и работать с современным производственным оборудованием, заинтересованного в дальнейшем профессиональном росте и развитии
&nbsp
&nbspМы предлагаем
&nbsp
&nbspПредприятие: АО «Холдинговая компания «Ополье» (производство, логистика и продажа молочной продукции), офис и отдел продаж находятся в пгт Боголюбово, завод по производству молочной продукции находится в г. Юрьев-Польский. Основные бренды «Ополье», «Домик в деревне», «Веселый молочник». С 2012 года…

Менеджер по работе с клиентами г. Юрьев-Польский

Быстрый заем — Юрьев-Польский, Владимирская Область — «Быстрый заём» — это команда профессионалов, которая помогает людям каждый день!
&nbsp Мы Микрофинансовая компания с девятилетним опытом работы и отделениями по всей стране от Крыма до Красноярского края. В нашей команде работает уже свыше 600 соратников. Мы быстрая, гибкая, смелая, активная и целеустремленная команда, которая растет с каждым днем.
&nbsp Мы гордимся:
&nbsp — Наша компания состоит в реестре Центробанка РФ;
&nbsp — У нас самый низкий процент для тех, кому мы помогаем.
&nbsp — Мы рассматриваем каждый случай выдачи и возврата индивидуально.
&nbsp — Мы помогаем нашим сотрудникам стать профессионалами.
&nbsp Если ты:
&nbsp С Опытом Работы в МКК более 3х лет,
&nbsp — Умеешь располагать к себе людей, а также слушать и слышать;
&nbsp — Честный и добропорядочный;
&nbsp — Готов брать на себя ответственность и действовать самостоятельно в достижении новых финансовых результатов;
&nbsp — Очень внимателен и аккуратен, при работе с документами;
&nbsp То для нас ты идеальный кандидат, но, если ты обладаешь только частью талантов, мы вс…

Продавец-консультант г. Юрьев-Польский

Розничная сеть МТС — Юрьев-Польский, Владимирская Область — Требуемый опыт работы: не требуется
&nbsp Полная занятость, полный день
&nbsp МТС сегодня — ведущая компания в России по предоставлению цифровых услуг: от мобильной связи, домашнего интернета и ТВ до развлекательных приложений, финансовых сервисов и даже киберспорта.
&nbsp Розничная сеть МТС — это более 5 000 салонов связи от Калининграда до Владивостока, более 20 000 сотрудников, 100 млн абонентов в России и СНГ.
&nbsp Стань частью нашей команды!
&nbsp СВОЕМУ НОВИЧКУ МЫ ГАРАНТИРУЕМ:
&nbsp Деньги: Платим зарплату официально, стабильно, вовремя и 2 раза в месяц. А наша понятная система бонусов позволяет зарабатывать больше. Границ нет, все зависит только от тебя!
&nbsp Комфортный график: О графике ты будешь знать заранее и сможешь планировать свое свободное время.
&nbsp Удобное расположение: Ты сам выбираешь в каком салоне связи будешь работать. Это крутая возможность работать рядом с домом и экономить время на дорогу.
&nbsp Учиться в удовольствие: У МТС есть свой университет — это не обычный вуз, это намного круче. Учишь…

Администратор (Юрьев-Польский, ул Краснооктябрьская, 1)

Пятерочка — Юрьев-Польский, Владимирская Область — Ведущая федеральная розничная сеть магазинов «Пятерочка» приглашает к сотрудничеству профессионалов, нацеленных на результат, ответственных, готовых к решению интересных задач.
&nbsp Управленческая практика и реальные перспективы карьерного роста!
&nbsp Обязанности:
&nbsp
&nbspОрганизация работы магазина
&nbsp
&nbsp Организация и контроль работы сотрудников
&nbsp
&nbsp Выполнение плана по товарообороту, минимизация потерь и соблюдение бизнес-процессов
&nbsp
&nbsp Взаимодействие с проверяющими и контролирующими органами
&nbsp
&nbsp Ведение отчетности и анализ плановых показателей магазина
&nbsp
&nbsp Контроль заказов, приемки, списания и сроков годности товаров, планирование товарных запасов и ротация
&nbsp
&nbsp Участие в локальных и плановых инвентаризациях
&nbsp
&nbspТребования:
&nbsp
&nbspОбразование не ниже среднего профессионального
&nbsp
&nbsp Управленческий опыт работы от 0,5 года
&nbsp
&nbsp Опыт работы в розничной торговле от 0,5 года (желательно)
&nbsp
&nbsp Уверенный пользователь ПК (Word, Excel, почта Microsoft Outlook)
&nbsp
&nbsp Грамотное распределение обязанностей и мотивация сот…

Продавец-кассир (Юрьев-Польский, Вокзальный пер, 4)

Пятерочка — Юрьев-Польский, Владимирская Область — Для каждого, кто хочет работать и зарабатывать!
&nbsp Для каждого, кто готов к профессиональному и карьерному росту!
&nbsp Ведущая федеральная розничная сеть магазинов «Пятерочка» приглашает на работу:
&nbsp Обязанности:
&nbsp
&nbspОбслуживание покупателей на кассе (наличный и безналичный расчет)
&nbsp
&nbsp Выкладка товара в зале
&nbsp
&nbsp Отслеживание сроков годности товара
&nbsp
&nbsp Проверка наличия ценников
&nbsp
&nbsp Консультация покупателей в зале
&nbsp
&nbspТребования:
&nbsp
&nbspОтветственность, дисциплинированность, внимательность
&nbsp
&nbspУсловия:
&nbsp
&nbspОформление в соответствии с ТК РФ,
&nbsp
&nbsp Стабильная официальная заработная плата, выплата 2 раза в месяц
&nbsp
&nbsp График работы 5/2, 2/2, возможен неполный рабочий день, неполная рабочая неделя
&nbsp
&nbsp Возможность подработки (работа по совместительству)
&nbsp
&nbsp Социальные гарантии, оплата отпусков и больничных листов
&nbsp
&nbsp Работа рядом с домом
&nbsp
&nbsp Скидки в магазинах сети
&nbsp
&nbsp Фирменная спецодежда
&nbsp
&nbsp Возможность профессионального и карьерного роста, корпоративное обучение
&nbsp
&nbsp Корпоративные мероприятия и конкурсы с …

Администратор (Юрьев-Польский, ул 1 Мая, 56)

Пятерочка — Юрьев-Польский, Владимирская Область — Ведущая федеральная розничная сеть магазинов «Пятерочка» приглашает к сотрудничеству профессионалов, нацеленных на результат, ответственных, готовых к решению интересных задач.
&nbsp Управленческая практика и реальные перспективы карьерного роста!
&nbsp Обязанности:
&nbsp
&nbspОрганизация работы магазина
&nbsp
&nbsp Организация и контроль работы сотрудников
&nbsp
&nbsp Выполнение плана по товарообороту, минимизация потерь и соблюдение бизнес-процессов
&nbsp
&nbsp Взаимодействие с проверяющими и контролирующими органами
&nbsp
&nbsp Ведение отчетности и анализ плановых показателей магазина
&nbsp
&nbsp Контроль заказов, приемки, списания и сроков годности товаров, планирование товарных запасов и ротация
&nbsp
&nbsp Участие в локальных и плановых инвентаризациях
&nbsp
&nbspТребования:
&nbsp
&nbspОбразование не ниже среднего профессионального
&nbsp
&nbsp Управленческий опыт работы от 0,5 года
&nbsp
&nbsp Опыт работы в розничной торговле от 0,5 года (желательно)
&nbsp
&nbsp Уверенный пользователь ПК (Word, Excel, почта Microsoft Outlook)
&nbsp
&nbsp Грамотное распределение обязанностей и мотивация сот…

Не нашли что искали? Поиск:

К весне Pure Florida Honey Company переезжает на более просторное место в торговом центре Jennings Arcade Mall

Шум в торговом центре Jennings Arcade на Олд-Мейн-стрит может быть связан с недавним переездом Pure Florida Honey Company.

Плохой каламбур, конечно, про самый сладкий бизнес в Аркаде, 417 12-я улица W. Владельцы слышали их все. Не то чтобы они возражали. Они приветствуют шутки и бизнес.

Владелец Анджела Ионита управляет магазином сырого меда вместе со своей матерью, Евой Ионита.Брат Анжелы, Алекс, занимается пчеловодством в поле.

Компания Pure Florida Honey зародилась около девяти лет назад, когда Алекс Ионита заинтересовался пчеловодством.

«Алекс не хотел заниматься кондиционированием воздуха и холодильным оборудованием, как его отец», — сказала Ева Ионита. «Один из друзей его отца, Джош Джентри, открыл глаза на пчеловодство».

Изначально семья продавала мед на фермерском рынке Брадентона на Старой Мейн-стрит, а затем около 18 месяцев назад переехала в небольшое торговое помещение в торговом центре Jennings Arcade.Примерно месяц назад компания переехала в более просторное пространство Arcade, Suite 104, в дальнем конце зала.

«Замечательно», — сказала Ева Ионита о новом помещении. «Удивительно, что люди узнают о пользе меда для здоровья и физического здоровья. Он существовал всегда и был найден в гробнице Тутанхамона. Люди готовят из него, едят ».

Анджела Ионита говорит, что семье повезло, что она смогла переехать в новое место.

«У нас намного больше трафика, и люди могут заходить и просматривать», — сказала Анжела Ионита.

Помимо меда, компания также продает подарочные корзины для чая и меда, свечи из пчелиного воска, мыло и косметические товары. Компания также продает работы из Брадентонской деревни искусств.

«Люди думают, что мед — это просто мед, но это сезонная культура, в зависимости от того, что цветет», — сказала Ева.

Компания Pure Florida Honey теперь предлагает мед из бразильского перца.

Бразильские перечные деревья, как инвазивные виды, не пользуются большим уважением.

Но в свою защиту Ева сказала: «Птицы и пчелы любят бразильский перец.Замечательный мед.

Через несколько недель на полки магазинов начнет поступать мед из цветков апельсина, за ним — мед из пальмы и мангровый мед, сказала она.

Алекс Ионита возит свои пчелиные ульи к местным цветущим растениям, а также возит их через всю страну, чтобы помочь фермерам опылять их растения. Партия пчел компании скоро возвращается из Калифорнии.

Родители Евы Иониты были венграми и покинули эту страну после революции 1956 года против оккупантов из Советского Союза.Они прибыли в Соединенные Штаты через Австрию в 1960 году.

В 1995 году семья переехала в Брадентон, и Алекс и Анджела окончили среднюю школу ламантинов.

В наши дни Алекс извлекает мед, а его мать и сестра разливают его по бутылкам для продажи.

Магазин работает с 11:00 до 18:00. Со среды по пятницу и с 10:00 до 15:00. в субботу. Кроме того, у семьи все еще есть киоск на фермерском рынке Брадентона с 9:00 до 14:00. по субботам с октября по май.

Для получения дополнительной информации посетите purefloridaapiary.com или позвоните по телефону 941-746-8600.

Транскриптомный признак низкой агрессии у медоносных пчел напоминает реакцию на инфекцию | BMC Genomics

Динамика заражения вирусами медоносных пчел in vivo и in vitro

ADS Статья PubMed Google ученый

(PDF) Призыв к использованию естественной устойчивости медоносных пчел в пчеловодстве

Bee World • ТОМ 95 • Июнь 2018 • Страница 37

СТАТЬЯ

развитие и заражение клещами пчел

Всего было амплифицировано и идентифицировано 29 различных последовательностей кДНК дефенсина ( Defensin1∼Defensin29 , GenBank: EU727268∼EU727296), кодирующих 7 различных пептидов дефенсина (названных AcDe1∼AcDe7). Все эти гены кДНК имеют высокую идентичность последовательности с геном кДНК дефенсина западной медоносной пчелы.Почти две трети (20/29) генов кДНК кодируют основной пептид AcDe4 и один или два гена кДНК кодируют пептиды дефенсина AcDe1∼AcDe3 и AcDe5∼AcDe7. Главный пептид AcDe4 был идентичен пептиду AcDe8, описанному для гена кДНК дефенсина азиатской пчелы (GenBank: ABS10820, прямое представление). Все предполагаемые зрелые пептидные последовательности высоко гомологичны двум пептидам дефенсина западной медоносной пчелы (AmDe1, кодируемый одним геном кДНК дефенсина , GenBank: U15955, и AmDe2, кодируемым одним геном кДНК дефенсина , GenBank: AAR01214) и геном Royalis пептид (названный AmRo1) [26] (Рисунок 1A).По сравнению с пептидами дефенсина западной медоносной пчелы в каждом пептиде дефенсина азиатской медоносной пчелы существуют от одной до трех аминокислотных замен. Мутации происходят между двумя гидрофобными аминокислотами, Phe и Leu, в AcDe1, AcDe2, AcDe3 и AcDe5, которые могут не изменять свойства и структуру. Одна кислая аминокислота (Glu) заменяет основную аминокислоту (Lys) в положении 9 в AcDe6, что снижает изоэлектрическую точку и может изменить антимикробные свойства. В AcDe7 существуют следующие три аминокислотные замены: одна аполярная аминокислота (Gly) заменяет полярную аминокислоту (Cys) в положении 3, одна аполярная аминокислота (Pro) заменяет полярную аминокислоту (Thr) в положении 41 и одна естественная аминокислота. мутация происходит в положении 20 (Thr-Asn) в AcDe7 (рис. 1А).Первая замена может изменить вторичную структуру AcDe7, вторая может снизить гидрофильную способность и может изменить другие антимикробные свойства AcDe7, а последняя может не оказать никакого влияния. Существует еще один уникальный пептид дефенсина западной пчелы (AmDe3, GenBank: NP 001011638), который представляет собой предполагаемую пептидную последовательность для признанного паралога дефинитивного гена дефенсина западной пчелы [25]. Это кажется совершенно уникальным по сравнению с аминокислотными последовательностями других дефенсинов и роялизина.В нем всего 43 аминокислоты (VTCDVLSWQSKWLSINHSACAIRCLAQRRKGGSCRNGVCICRK), в то время как все остальные содержат 51 аминокислоту и больше аминокислотных замен среди них. Более того, ORF дефенсина азиатской медоносной пчелы содержит одну дополнительную аминокислоту (Gly) на С-конце, которая может быть амидирована, как в зрелом антимикробном пептиде дефенсина A. mellifera [24], [27].

Рисунок 1. Выравнивание зрелых пептидов четырех семейств антимикробных пептидов A. cerana и A.mellifera .

(A): выравнивание зрелых пептидов дефенсинов медоносных пчел. От AcDe1 до AcDe8 от азиатской медоносной пчелы; AmDe1, AmDe2 и AmRo1 от западной пчелы, AcDe8, AmDe1, AmDe2 и AmRo1 загружены с веб-сайта NCBI. (B): выравнивание зрелых пептидов абацинов медоносных пчел. AcAb1 и AcAb2 азиатской медоносной пчелы; AmAb1 и AmAb2 от западной пчелы и загружены с веб-сайта NCBI. (C): выравнивание зрелых пептидов апидецинов медоносных пчел. От AcAp1 до AcAp4 азиатской медоносной пчелы; AmAp1∼AmAp5 от западной пчелы и загружено с веб-сайта NCBI.(D): выравнивание зрелых пептидов гименоптацинов медоносных пчел. AcHy1∼AcHy13 от азиатской медоносной пчелы; AmHy1 от Western honeybee и загружен с веб-сайта NCBI. Множественное выравнивание последовательностей выполняли с использованием Clustal_X. Идентичные аминокислоты отмечены черными точками. В выравнивании показаны разные аминокислоты. Мелкие черточки указывают на зазоры, вставленные для оптимального совмещения. Аминокислотные остатки пронумерованы справа.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004239.g001

Ген-предшественник дефенсина азиатской медоносной пчелы состоит из трех частей: пре-области или сигнальной области (кодирующей 18 или 19 аминокислот), область (между сигнальной и зрелой областью, кодирующая 24 аминокислоты) и зрелая область (кодирующая 52 аминокислоты) (рис. 2).Всего 303 несинонимичные замены (NS) и 451 синонимичные замены (SS) существуют в 29 генах-предшественниках, 55 NS и 116 SS в пре-про-области и 136 NS и 97 SS в зрелой области. Большая часть НП занимает зрелый регион, а большая часть СС находится в пре-про-регионе. Транскрипт мРНК дефенсина продолжается еще на 41–126 оснований (исключая PolyA) после стоп-кодона (рис. 2).

Рисунок 2. Нуклеотидная последовательность и предсказанная аминокислотная последовательность Defensin1 (GenBank Accession EU727268).

Предполагаемый сигнальный пептид выделен жирным шрифтом, прообласть пептида затенена, а зрелый пептид обозначен открытым прямоугольником. Трансляционный сигнал (TAG) обозначается звездочкой. Сигналы рестрикции и поли (A) аденилирования (AATAAA) показаны волнистой линией. Вариантные локусы заключены в рамку и пронумерованы красным. Сайты нуклеотидных замен в последовательностях-предшественниках между Defensin1 и другими генами Defensin отмечены пунктирной линией.« Defensin1∼Defensin 29 » сокращенно обозначается как « Defensin1∼Def29 ».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004239.g002

Анализ

Всего было амплифицировано и идентифицировано 11 различных последовательностей кДНК абаецина ( Abaecin1∼Abaecin11 , GenBank: EU714043∼EU714053), кодирующих 2 различных пептида абаецина (названных AcAb1 и AcAb2). Семь различных генов кДНК, кодированных для основного пептида AcAb1, и 4 различных гена кДНК, кодированных для пептида AcAb2.AcAb1 состоит из 34 аминокислот, тогда как AcAb2 состоит из 33 аминокислот и не имеет Gln в положении 9 Ab1 (рис. 1B). Одна естественная мутация (Ile-Val) в положении 7 существует в AcAb1 и AcAb2 по сравнению с пептидом абацина западной медоносной пчелы (называемым AmAb1, кодируемым одним геном кДНК абаецина западной медоносной пчелы, GenBank: NM_001011617) (рис. 1B), что может не изменять свою структуру и свойства; одна полярная аминокислота Gln отсутствует в AcAb2, что снижает гидрофильность AcAb2.Одна полярная аминокислота Ser заменяет аполярную аминокислоту Ile в положении 8 в AcAp2, а одна аполярная кислота Ile заменяет полярную аминокислоту Asn. Оба они существуют в вариабельной области, что изменит общий спектр противомикробных препаратов, в то время как консервативная (постоянная) область останется прежней. Это сохранит общую антимикробную способность [29], [33]. Еще один пептид абаецина западной медоносной пчелы (названный AmAb2, прямое представление в GenBank: U15954) представляет собой специальный пептид, состоящий из 33 аминокислот с 5 аминокислотами (CAAFA) на N-конце и 6 аминокислотами (KWPQGY).Он отсутствует на С-конце по сравнению с другими пептидами абаецина медоносных пчел.

Ген-предшественник абэцина азиатской медоносной пчелы состоит из двух частей: пре-области (кодирующей 19 аминокислот) и зрелой области (кодирующей 33 или 34 аминокислоты). В нем отсутствует про-регион (Рисунок 3). Всего 22 NS и 48 SS существуют в 11 генах-предшественниках, 3 NS и 6 SS в пре-области и 4 NS и 10 SS в зрелой области. Транскрипт мРНК abaecin продолжается еще на 140 оснований после стоп-кодона (исключая PolyA) (рис. 3).

Фигура 3. Нуклеотидная последовательность и предсказанная аминокислотная последовательность Abaecin1 (доступ в GenBank EU714043).

Предполагаемый сигнальный пептид выделен жирным шрифтом, а зрелый пептид обозначен открытой рамкой. Трансляционный сигнал (TAA) обозначен звездочкой. Сигналы рестрикции и поли (A) аденилирования (AATAAA) показаны волнистой линией. Вариантные локусы обведены рамкой или обозначены красной короткой стрелкой и пронумерованы красным цветом. Сайты нуклеотидных замен в последовательностях-предшественниках между Abaecin1 и другими Abaecin генами отмечены пунктирной линией.« Abaecin1∼Abaecin11 » сокращается до « Aba1∼Aba11 ».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004239.g003

Анализ

В целом, 34 различных гименоптецина последовательностей кДНК ( Hymenoptaecin1∼Hymenoptaecin18 , GenBank: EU727297∼EU727314; Hymenoptaecin19∼Hymenoptaecin34 H∼Hymenoptaecin34, H∼Hymenodes (1335A), кодирующие генсинBank3U835, кодирующие пептиды, образующие 131660, termedc8U1 усилены и идентифицированы.По сравнению с пептидом гименоптаецина западной медоносной пчелы (называемым AmHy1, кодируемым одним геном кДНК hymenoptaecin , GenBank: NM 001011615), две аминокислотные замены (Asn-Ser в положении 16 и Val-Phe в положении 85) существуют во всех Пептиды гименоптаецина азиатской медоносной пчелы, одна замена (Lys-Gln в положении 9) в AcHy1∼AcHy5, одна замена (Ala-Ser в положении 50) в AcHy1, AcHy2 и AcHy5∼AcHy7, Ser в том же положении (положение 50) мутирует на Thr в AcHy3, AcHy4 и AcHy8∼AcHy13, и одна замена (Ser-Pro в положении 46) существует в AcHy2, одна замена (Asn-Asp в положении 37) в AcHy9, одна замена (Arg-His в положении 53) в AcHy3 ∼AcHy5, одна замена (Ser-Asn в положении 43) в AcHy9, одна замена (Arg-His в положении 53) в AcHy3∼AcHy5, одна замена (Ser-Asn в положении 43) в AcHy10, одна замена (His-Tyr в положении 24) в AcHy11 и одну замену (Leu-Gln в положении 50) в AcHy12 (рис. 1D).Ген-предшественник гименоптаецина азиатской медоносной пчелы состоит из трех частей: пре-области (кодирующей 17 аминокислот), про-области (кодирующей 16 аминокислот) и зрелой области (кодирующей 93 аминокислоты). В целом, 733 NS и 608 SS существуют во всех генах-предшественниках, 54 NS и 30 SS в пре-про-области, 499 NS и 448 SS в зрелой области. Пре-про-область высококонсервативна, и большинство замен находится в зрелой области. Транскрипт мРНК hymenoptaecin продолжается еще примерно 230 оснований после стоп-кодона (фиг. 5), но только 75 оснований (исключая PolyA) после стоп-кодона находятся в последовательностях Hymenoptaecin28 .

Фигура 5. Нуклеотидная последовательность и предсказанная аминокислотная последовательность Hymenoptaecin1 (доступ в GenBank EU727297).

Предполагаемый сигнальный пептид выделен жирным шрифтом, черным, прорегион пептида затенен, а зрелый пептид обозначен открытым прямоугольником. Трансляционный сигнал (TAG) обозначается звездочкой. Сигналы рестрикции и поли (A) аденилирования (AATAAA) показаны волнистой линией. Последовательность ATTTA обозначена двойной волнистой линией.Вариантные локусы заключены в рамку и пронумерованы красным. Сайты нуклеотидных замен в последовательностях-предшественниках между Hymenoptaecin1 и другими Hymenoptaecin генами отмечены пунктирной линией. « Hymenoptaecin1∼Hymenoptaecin34 » сокращается до « Hym1∼Hym34 ».

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004239.g005

Филогенетический анализ

Для построения филогенетического дерева были выбраны различные последовательности гена-предшественника из каждого из генов кДНК, кодирующих разные зрелые пептиды азиатской медоносной пчелы, и полные или частичные последовательности cds у западной медоносной пчелы, загруженные с веб-сайта NCBI.Результаты показывают, что существует три основных ветви (семейства hymenoptaecin , defensin и apidaecin ), и гены кДНК abacin имеют относительно тесную связь с генами кДНК hymenoptaecin (рис. 6). AmDef3 — это одна особая последовательность, которая имеет только 46% возможность группироваться вместе с другими генами кДНК дефенсина . Из-за высокой гомогенности (сходство в диапазоне от 96,5% до 100%), существующей в каждом из четырех семейств генов антимикробных пептидов, в каждом из четырех семейств имеется только несколько ветвей и узлов (рис. 6).Хотя несколько нуклеотидных сайтов различаются в пределах каждого из четырех семейств, даже только одна несинонимичная замена в относительно вариабельной зрелой области будет индуцировать образование нового пептида.

Рисунок 6. Дерево соседнего соединения (NJ) четырех семейств генов кДНК антимикробного пептида A. cerana и A. mellifera .

Все последовательности кДНК для A. cerana были отредактированы так, чтобы они начинались с инициирующего кодона и заканчивались стоп-кодоном (содержащим полные CD).Все последовательности кДНК для A. mellifera загружены с веб-сайта NCBI и отредактированы так, чтобы заканчиваться стоп-кодоном (содержащим полные или частичные CD). Числа в узлах являются значениями начальной загрузки, основанными на 1000 репликациях. Названия генов кДНК, номера доступа в GenBank и названия кодирующих пептидов перечислены в таблице 1.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004239.g006

Обсуждение

Медоносные пчелы, будучи эусоциальными насекомыми, развили как общие, так и индивидуальные черты, уменьшающие влияние их многочисленных паразитов и патогенов.Среди индивидуальных особенностей врожденный иммунный ответ может снизить как индивидуальную смертность, так и распространение патогенов среди членов колонии [3], [31]. Прополис — это смолистое вещество, состоящее из разжеванных почек деревьев, смешанных с пыльцой, собранной пчелами, а также ферментов, выделяемых пчелами. Он выполняет множество функций по защите гнезда, расплода и хранимой пищи, а также играет важную роль в защите личинок медоносных пчел, предотвращая проникновение болезней и паразитов в улей [32].Вызывает недоумение то, что азиатские пчелы не производят прополис. Как азиатская пчела защищает личинок? Когда рабочие посещают цветы растений для сбора пыльцы и меда, они неизбежно действуют как потенциальные переносчики различных патогенов, таких как бактерии, грибки и вирусы, и даже некоторые паразитические клещи и насекомые. Таким образом, врожденная иммунная система взрослых рабочих, вероятно, будет играть важную роль не только в самообороне, но и в обеспечении защиты личинок и матки от патогенов.В дикой природе азиатская медоносная пчела может опылять гораздо больше видов растений, чем западная медоносная пчела, и поэтому может подвергаться более высокому риску контакта с патогенами. Легко сделать вывод, что азиатская медоносная пчела может быть подвергнута более сильному отбору для защиты от патогенов и паразитов, чем западная медоносная пчела.

Четыре семейства генов антимикробных пептидов были выделены из западной медоносной пчелы и идентифицированы. Каждое семейство генов отвечает за разные обязанности во врожденной иммунной системе медоносной пчелы.Апидецин является наиболее важным компонентом гуморальной защиты медоносных пчел. Его уникальная структура предшественника и / или процессинг делает apidaecin легко запускаемым и потенциально избыточно продуцируемым из-за низкого порога активации транскрипции [24]. Напротив, значительные экспериментальные инфекции необходимы для индукции обычно молчащих генов дефенсина , абаецина и гименоптецина . Анализ кДНК последовательности апидецина западной медоносной пчелы показал, что до 12 пептидов апидецина можно получить путем обработки отдельных белков-предшественников [28].Такие же результаты были получены при анализе последовательности кДНК apidaecin азиатской медоносной пчелы. Однако только активные антимикробные пептиды обнаруживаются в гемолимфе взрослых пчел [28], [33]. Апидецин обладает сильным антимикробным действием по отношению к широкому спектру обычных связанных с растениями грамотрицательных бактерий [21], [24] и является первой линией защиты от вторжения патогенов. Абаецин — еще один важный антимикробный пептид в гемолимфе медоносной пчелы. Он относительно слабее, но так же активен, как апидецин, против грамотрицательных и грамположительных бактерий.Он также обладает противомикробной активностью в отношении некоторых бактерий in vitro , устойчивых к апидецину [22]. В гене-предшественнике абэцина отсутствует про-регион, это означает, что активный пептид был произведен после того, как он был перемещен в эндоплазматический ретикулум и без другого процессинга [24]. Еще одна загадочная особенность абаецина заключается в том, что он теряет большую часть своей антибактериальной активности в присутствии фосфатно-солевого буфера или разбавленной пчелиной гемолимфы, среды, которая напоминает ее физиологическую среду [22].Слабый антимикробный препарат абаецин, по-видимому, действует как резервная копия устойчивости бактерий к апидецину [22]. Что касается основного иммунного компонента (апидецина), гименоптецин в значительной степени комплементарен апидецину, поскольку подавляет рост некоторых грамотрицательных бактерий, устойчивых к апидецину [23]. В физиологических условиях пчелы он подавляет жизнеспособность грамотрицательных и грамположительных бактерий, включая несколько патогенов человека [23]. Для сравнения, продукция дефенсина пчелы довольно минимальна и значительно задерживается, представляя собой единственный компонент гуморальной защиты пчел, специфически нацеленный на грамположительные бактерии [24], [26].Стабильные уровни дефенсина, вероятно, достаточны для удаления стойких грамположительных клеток через 24 часа после инфицирования [24]. При незначительном заражении патогенами в дикой природе только генов апидецина и гименоптецина были обнаружены в организме взрослых пчел западной медоносной пчелы (отсутствовали абаецин и дефенсин ) [24]. Широкий спектр грамотрицательных бактерий, на которые нацелен апидецин, может быть причиной большинства инфекций медоносных пчел в дикой природе [24]. Пептиды апидецина и гименоптецина могут быть важными факторами в ограничении или уничтожении различных патогенов во врожденной иммунной системе медоносной пчелы.Пептид абаецин, по-видимому, действует как резервная копия для потенциального возникновения устойчивости бактерий к апидецину [23]. Пептид дефенсина может играть важную роль в поддержании иммунологических способностей пчел на поздних стадиях инфекций.

Мы амплифицировали и идентифицировали четыре семейства генов антимикробных пептидных транскриптов от взрослых рабочих азиатских медоносных пчел, инфицированных E. coli . Результаты Blastn предполагают, что все они имеют высокую последовательность идентичности с западной медоносной пчелой.Результаты филогенетического анализа показывают, что все гены кДНК в каждом из четырех семейств генов одного и того же вида медоносных пчел являются паралоговыми генами, а пептиды, которые они кодируют, являются аллельными вариантами. Например, высокое сходство последовательностей пептидов дефенсина и идентичность пре-про-областей всех пептидов предполагает, что пептиды дефенсина могут быть вариантами, кодируемыми одним полиморфным геном [25]. В целом, по крайней мере 29 различных генов кДНК дефенсина , кодирующих 7 пептидов дефенсина, хотя один из вариантов дефенсина (AcDe7) имеет замену в остатке цистеина, которая является дефинитивной и широко консервативной по природе, что позволяет предположить, что эта последовательность может происходить из псевдоген или аллель с нулевой активностью.У азиатской медоносной пчелы существует 11 различных генов кДНК абаецина , кодирующих 2 пептида абаецина, 13 различных генов кДНК апидецина , кодирующих 4 пептида апидецина, и 34 различных кДНК гименоптецина , кодирующих 13 пептидов гименоптецина. Что касается западной медоносной пчелы, всего 5 генов кДНК дефенсина (содержащих полные последовательности cds, GenBank: NM_001011616, NM_001011638, AY333923, AY588474 и U15955), кодирующих 3 пептида дефенсина (AmDe1∼AmDe3), 2 59 генов содержащие полные последовательности cds, GenBank: NM_001011617 и U15954), кодирующие один пептид 1 абаецина (AmAba1) и 1 непосредственно представленный пептид абэцина (AmAb2, GenBank: AAL35348), 7 генов кДНК апидецина (содержащие полные зрелые нуклеотидные последовательности, GenBank: EU38 NM_001011642, NM_001011613, X72577, X72576, X72575 и AF442148), кодирующих 5 пептидов апидецина, и 2 гена кДНК гименоптаецина (содержащих полные последовательности cds, GenBank: NM_001011615 и U15956, как сообщается), кодирующий 1 пептид.Вероятно, что у западной медоносной пчелы существуют дополнительные антимикробные пептиды и гены кДНК, которые могут кодировать те же зрелые пептиды, о которых здесь сообщается. Однако нет сомнений в том, что у азиатской медоносной пчелы обнаружено больше антимикробных пептидов и их генов кДНК, чем у западной медоносной пчелы, особенно пептидов гименоптецина (13 против 1). Эти результаты предполагают, что долгая история одомашнивания A. mellifera могла привести к более низкому постоянному разнообразию антимикробных пептидов в их последовательностях.Вдобавок и / или альтернативно взрослые особи азиатской медоносной пчелы могут находиться под более сильным давлением отбора со стороны патогенов и паразитов, что приводит к более позитивному и разнообразному отбору по последовательностям антимикробных пептидов, чем у западной медоносной пчелы.

Материалы и методы

Насекомые

Колонии китайской медоносной пчелы, Apis cerana cerana Fabricius, содержались в кампусе Чжэцзянского университета с 2003 года. Взрослым пчелам вводили жизнеспособные пчелы E.coli (TG1), как описано ранее [21]. Жировые тела взрослых особей осы собирали через 24 ч после инъекции.

ОТ-ПЦР

Образцы жирового тела собирали и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS: 140 мМ NaCl, 27 мМ KCl, 8 мМ Na ₂ HPO4, 1,5 мМ KH ₂ PO4, pH 7,4). Суммарную РНК экстрагировали из 40 живых взрослых рабочих с использованием набора RNeasy® Mini Kit (Qiagen Gmbh, D-40724 Hilden). Библиотеки кДНК были сконструированы с использованием набора для синтеза кДНК Clontech, SMART ™ PCR.После синтеза двухцепочечной кДНК ее разводили в 100 раз в качестве матрицы. Все праймеры были сконструированы из четырех типов семейств генов антимикробных пептидов A. mellifera . Использовали следующие праймеры: P1 (для abaecin ): GAT CTG CAC ACT CGA GGT CTG (созданный из короткого участка последовательности непосредственно перед стартовым кодоном гена A. mellifera abaecin ), условия ПЦР были 94 ° C, 2 мин, 40 × (94 ° C, 20 с; 54 ° C, 30 с; 72 ° C, 30 S), 72 ° C, 10 мин; P2 (для apidaecin ): TAA TCA TGA AGA ATT TTG CCT (созданный из короткого участка последовательности непосредственно перед стартовым кодоном A.mellifera apidaecin , условия ПЦР: 94 ° C, 2 мин, 40 × (94 ° C, 20 с; 54 ° C, 30 с; 72 ° C, 40 S), 72 ° C, 10 мин; P3 (для hymenoptaecin ): GAA ATC GAT CAG CTC TAC AG (созданный из короткого участка последовательности непосредственно перед стартовым кодоном гена A. mellifera hymenoptaecin ), условия ПЦР: 94 ° C, 2 мин, 40 × (94 ° C, 20 с; 50 ° C, 30 с; 72 ° C, 40 S), 72 ° C, 10 мин; P4, P5 и P6 для амплификации полных последовательностей CDS дефенсина , P4: TGT CGG CCT TCT CTT CAT GG (разработан из короткого участка последовательности после стартового кодона A.mellifera defensin ), условия ПЦР: 94 ° C, 2 мин, 40 × (94 ° C, 20 с; 58 ° C, 30 с; 72 ° C, 30 S), 72 ° C, 10 мин; P5 (для 5’RACE): GAA ACG TTT GTC CCA GAG ATC (созданный из короткого участка последовательности сразу после последовательности, амплифицированной с помощью P4), условия ПЦР: 94 ° C, 2 мин, 40 × (94 ° C, 20 с; 56 ° C, 30 с; 72 ° C, 30 S), 72 ° C, 10 мин; P6 (для 3’RACE): GCC AAT ATG AAG ATC TAT TT (созданный из короткого участка рядом с стартовым кодоном последовательности, амплифицированной с помощью P5), условия ПЦР: 94 °, 2 мин, 40 × (94 ° C, 20 ° C). с; 50 ° C, 30 с; 72 ° C, 30 S), 72 ° C, 10 мин.Праймер 5’PCR в наборе использовали в качестве прямого праймера, а P5 в качестве обратного праймера для 5’RACE дефенсина . Праймер CDS (ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG) в наборе использовали в качестве обратного праймера во всех других реакциях ПЦР. Продукты ПЦР очищали в геле и клонировали с помощью вектора TaKaRa pMD19-T (TaKaRa Biotechnology, Далянь, Китай). Положительные клоны сначала подвергали скринингу синих / белых колоний, затем положительные клоны снова тестировали с векторными праймерами M13, чтобы избежать, насколько это возможно, ложноположительных клонов.Мы каждый раз отправляли 5 ~ 10 протестированных положительных клонов для каждого семейства генов антимикробных пептидов в Invitrogen Biotechnology Company (Invitrogen, Шанхай, Китай) для секвенирования до тех пор, пока не было обнаружено новой последовательности кДНК (кодирующей другой зрелый пептид). В целом, 156 клонов, которые дали положительный результат, были отправлены в последовательность, 56 клонов для дефенсина , 23 клона для абаецина , 25 клонов для апидецина и 52 клонов для гименоптецина .

Анализ последовательностей

Сайты расщепления сигнального пептида были предсказаны с использованием SignalP 3.0 серверная программа [34]. Несинонимичные замены (NS) и синонимичные мутации (SS) анализировали с помощью программного обеспечения Dambe [35]. Множественное выравнивание последовательностей выполняли с использованием Clustal_X [36] и редактировали с помощью программного обеспечения GeneDoc [37]. Филогенетическое дерево было построено с помощью анализа Neighbor-Joining (NJ) с использованием Mega4 [38] на основе данных последовательностей, перечисленных в таблице 1.

Благодарности

Мы благодарим доктора Р. Лая (Институт зоологии, Куньмин, Китай) за его помощь во время исследования.Мы также благодарим доктора М. Шарки (Университет Кентукки, США) за улучшение рукописи ранней версии и доктора Н.Э. Пирсу (Гарвардский университет, США) за рецензирование окончательной версии рукописи. Мы также благодарим двух анонимных рецензентов за их бесценные комментарии и предложения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: PX MS. Проведены эксперименты: PX. Проанализированы данные: PX MS. Написал бумагу: PX. Интеллектуальный вклад во время разработки и реализации этого исследования, а также во время написания рукописи: X-XC.Предоставленное финансирование в поддержку этого исследования: X-XC.

Ссылки

1. 1. Пойнар, Данфорт Б.Н. (2006) Ископаемая пчела из бирманского янтаря раннего мелового периода. Наука 314 (5799): 614
2. 2. Консорциум по секвенированию генома медоносной пчелы (2006). Анализ социальных насекомых из генома медоносной пчелы Apis mellifera . Nature 443: 931–949.
3. 3. Breed MD, Guzmán-Novoa E, Hunt GJ (2004) Защитное поведение медоносных пчел: организация, генетика и сравнение с другими пчелами.Ежегодный обзор энтомологии 49: 271–298.
4. 4. Чен Ю.П., Эванс Д.Д. (2007) Историческое присутствие израильского вируса острого паралича в Соединенных Штатах. Американский пчелиный журнал 147: 1027–1028.
5. 5. Chen YP, Evans JD, Smith IB, Pettis JS (2008) Nosema ceranae — это давно существующая и широко распространенная микроспоридиальная инфекция европейской медоносной пчелы ( Apis mellifera ) в Соединенных Штатах. Журнал патологии беспозвоночных 97: 186–188.
6. 6. Хигес М., Мартин Р., Меана А (2006) Nosema ceranae , новый паразит микроспоридий у медоносных пчел в Европе. Журнал патологии беспозвоночных 92: 93–95.
7. 7. Клее Дж., Бесана А.М., Генерш Э., Гисдер С., Нанетти А. и др. (2006) Широкое распространение микроспоридий Nosema ceranae , эмерджентного патогена западной медоносной пчелы, Apis mellifera . Журнал патологии беспозвоночных 961: 1–10.
8. 8.Сантильян-Галисия М.Т., Карзанига Р., Болл Б.В., Олдерсон П.Г. (2008) Иммунолокализация частиц вируса деформированного крыла внутри клеща Varroa destructor . Журнал общей вирусологии 89: 1685–1689.
9. 9. Ян Г.Х. (2005) Вред от интродукции западной медоносной пчелы Apis mellifera L. китайской пчеле Apis cerana F. и ее экологические последствия. Acta Entomologica Sinica 48: 401–406.
10. 10. Из Википедии, бесплатной энциклопедии.http://en.wikipedia.org/wiki/Apis_cerana.
11. 11. Kasprzak S, Topolska G (2007) Nosema ceranae (Eukaryota: Fungi: Microsporea) — новый паразит западной медоносной пчелы Apis mellifera L. Wiad Parazytol 53: 281–284.
12. 12. Williams GR, Shafer AB, Rogers RE, Shutler D, Stewart DT (2008) Первое обнаружение Nosema ceranae , микроспоридиевого паразита европейских медоносных пчел ( Apis mellifera ), в Канаде и центральных США.Журнал патологии беспозвоночных 97: 189–192.
13. 13. Souza RM, de Souza MC, Patitucci ML, Silva JF (2007) Оценка антиоксидантной и антимикробной активности и характеристика биоактивных компонентов двух образцов бразильского прополиса с использованием фракционирования под контролем pKa. Zeitschrift fur Naturforschung C-A Journal of Biosciences 62: 801–807.
14. 14. Фонтана Р., Мендес М.А., де Соуза Б.М., Конно К., Сезар Л.М.М. и др. (2004) Jelleines: семейство антимикробных пептидов из маточного молочка медоносных пчел ( Apis mellifera ).Пептиды 25: 919–928.
15. 15. Girardin SE, Sansonetti PJ, Philpott DJ (2002) Внутриклеточное и внеклеточное распознавание патогенов — общие концепции у млекопитающих и мух. Тенденции в микробиологии 10: 193–199.
16. 16. Локер ES, Adema CM, Zhang SM, Kepler TB (2004) Иммунная система беспозвоночных — неоднородная, непростая, недостаточно изученная. Immunological Reviews 198: 10–24.
17. 17. Мюллер У., Фогель П., Альбер Г., Шауб Г.А. (2008) Врожденная иммунная система млекопитающих и насекомых.Вклад в микробиологию 15: 21–44.
18. 18. Boman HG (1995) Пептидные антибиотики и их роль в врожденном иммунитете. Ежегодный обзор иммунологии 13: 61–92.
19. 19. Bulet P, Hetru C, Dimarcq J-L, Hoffmann D (1999) Противомикробные пептиды у насекомых: структура и функция. Развитие и сравнительная иммунология 23: 329–344.
20. 20. Hoffmann JA, Kafatos FC, Janawey CA, Ezekovitz RAB (1999) Филогенетические перспективы врожденного иммунитета.Наука 284: 1313–1323.
21. 21. Casteels P, Ampe C, Jacobs F, Vaek M, Tempst P (1989) Apidaecins: антимикробные пептиды медоносных пчел. EMBO Journal 8: 2387–2391.
22. 22. Casteels P, Ampe C, Riviere L, Damme JV, Elicone C и др. (1990) Выделение и характеристика абаецина, основного антимикробного пептида медоносной пчелы ( Apis mellifera ). Европейский журнал биохимии 187: 381–386.
23. 23. Casteels P, Ampe C, Jacobs F, Tempst P (1993) Функциональная и химическая характеристика гименоптаецина, антимикробного пептида, индуцируемого инфекцией у медоносной пчелы ( Apis mellifera ).Журнал биологической химии 268: 7044–7054.
24. 24. Casteels-Josson K, Zhang W, Capaci T, Casteels P, Tempst P (1994) Острый транскрипционный ответ репертуара гена пептид-антибиотик медоносной пчелы и требуемая пост-трансляционная конверсия структур-предшественников. Журнал биологической химии 269: 28569–28575.
25. 25. Klaudiny J, Albert Š, Bachanová K, Kopernický J, Šimúth J (2005) Два структурно разных гена дефенсина, один из которых кодирует новую изоформу дефенсина, экспрессируются у пчелы Apis mellifera .Биохимия и молекулярная биология насекомых 35: 11–22.
26. 26. Фудзивара С., Имаи Дж., Фудзивара М., Яешима Т., Кавасима Т. и др. (1990) Мощный антибактериальный белок маточного молочка. Журнал биологии и химии 265: 11333–11337.
27. 27. Eipper BA, Mains RE, Glembotski CC (1983) Идентификация в ткани гипофиза активности α-амидирования пептидов, которая действует на пептиды с удлиненным глицином и требует молекулярного кислорода, меди и аскорбиновой кислоты. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 80: 5144–5148.
28. 28. Casteels-Josson K, Capaci T, Casteels P, Tempst P (1993) Структура мультипептидного предшественника апидецина: предполагаемый механизм усиления антибактериального ответа насекомых. EMBO Journal 12: 1569–1578.
29. 29. Casteels P, Romagnolo J, Castle M, Casteel-Josson K, Erdjument-Bromage H и др. (1994) Биоразнообразие пептидных антибиотиков апидецинового типа: перспективы изменения антибактериального спектра и борьбы с приобретенной резистентностью. Журнал биологической химии 269: 26107–26115.
30. 30. Zhou X, Wang Y, Pan Y, Li W (2008) Низин-контролируемое внеклеточное производство апидецина в Lactococcus lactis . Прикладная микробиология и биотехнология 78: 947–953.
31. 31. Эванс Дж. Д., Петтис Дж. С. (2005) Влияние иммунной реакции у медоносных пчел на уровне колоний, Apis mellifera . Эволюция 59: 2270–2274.
32. 32. Из Википедии, бесплатной энциклопедии. http://en.wikipedia.org/wiki/Propolis.
33. 33.Ли В.Ф., Ма GX, Чжоу XX (2006) Пептиды апидецинового типа: биоразнообразие, взаимосвязь между структурой и функцией и механизм действия. Пептиды 27: 2350–2359.
34. 34. Сервер SignalP 3.0. http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/.
35. 35. Xia X, Xie Z (2001) DAMBE: программный пакет для анализа данных в молекулярной биологии и эволюции. Журнал наследственности 9: 371–373.
36. 36. Томпсон Дж. Д., Гибсон Т. Дж., Плевняк Ф., Жанмугин Ф., Хиггинс Д. Г. (1997) Интерфейс окна CLUSTAL_X: гибкие стратегии для множественного выравнивания последовательностей с помощью инструментов анализа качества.Исследование нуклеиновых кислот 25: 4876–4882.
37. 37. Николас КБ, Николас HBJ, Дирфилд DW (1997) GeneDoc: Анализ и визуализация генетической изменчивости. EMBNEW Новости 4: 14.
38. 38. Тамура К., Дадли Дж., Ней М., Кумар С. (2007) MEGA4: версия 4.0 программного обеспечения для молекулярно-эволюционного генетического анализа (MEGA). Молекулярная биология и эволюция 24: 1596–1599.

Редактирование РНК A-to-I у пчел показывает сигналы адаптации и конвергентной эволюции

ВВЕДЕНИЕ

Редактирование РНК от аденозина (A) до инозина (A-to-I), катализируемое ферментами ADAR (аденозиндезаминаза, действующая на РНК). ) семья (Савва и др.2012b), представляет собой эволюционно законсервированный механизм, который увеличивает разнообразие РНК на котранскрипционном или посттранскрипционном уровне у многоклеточных животных (Bass 2002; Nishikura 2010; Eisenberg and Levanon 2018). Два каталитически активных гена Adar кодируются у большинства многоклеточных животных. Однако насекомые утратили ADAR1 и кодируют только один ген Adar (Keegan et al. 2011). Из-за структурного сходства между инозином (I) и гуанозином (G) обычно считается, что I распознается как G во многих клеточных процессах, таких как сплайсинг мРНК (Rueter et al.1999; Flomen et al. 2004; Jin et al. 2007; Лев-Маор и др. 2007), биогенез микроРНК (miRNA) или распознавание мишени (Liang and Landweber 2007; Borchert et al. 2009; Alon et al. 2012) и трансляция мРНК (Basilio et al. 1962; Licht et al. 2019). Следовательно, редактирование РНК A-to-I обычно имеет такой же эффект, как и замена ДНК A-to-G. Редактирование от A до I играет важную роль во многих биологических и физиологических процессах (Keegan et al. 2001; Nishikura 2010), а нарушение регуляции редактирования от A до I может быть связано с раком, аутоиммунными нарушениями или другими заболеваниями человека (Gallo и другие.2017).

В течение последних двух десятилетий сайты редактирования РНК A-to-I были систематически охарактеризованы у различных видов многоклеточных животных (Ramaswami and Li 2016). Большинство сайтов редактирования РНК расположены кластерами в некодирующих областях человека (Athanasiadis et al. 2004; Blow et al. 2004; Kim et al. 2004; Levanon et al. 2004; Picardi et al. 2017), обезьяны (Chen et al. 2014; Yang et al. 2015), мыши (Neeman et al. 2006; Danecek et al. 2012), черви (Morse and Bass 1999; Zhao et al. 2015; Goldstein et al.2017), кораллы (Porath et al. 2017b) и многие другие виды (Porath et al. 2017a). У большинства видов лишь малая часть правок приходится на кодирующую последовательность. Заметными исключениями являются Drosophila (Graveley et al.2011; Rodriguez et al.2012; St Laurent et al.2013; Mazloomian and Meyer 2015; Yu et al.2016; Buchumenski et al.2017; Duan et al.2017; Zhang et al.2017) и виды головоногих моллюсков (Alon et al.2015; Liscovitch-Brauer et al.2017). Несмотря на глубокую сохранность механизма редактирования от A до I, целевые ландшафты редактирования значительно изменились в ходе эволюции многоклеточных животных.Известно, что только один сайт редактирования сохраняется практически у всех млекопитающих, Drosophila и головоногих моллюсков (Porath et al.2019), и, таким образом, кажется, что редактирование РНК модулирует разнообразие транскриптомов и протеомов в зависимости от происхождения.

Силы, управляющие эволюцией редактирования от A к I между видами на макроэволюционном уровне, не совсем понятны. Было высказано предположение, что редактирование РНК облегчает адаптивную эволюцию за счет увеличения протеомного разнообразия во времени или пространстве более гибким образом, чем геномные мутации (Gommans et al.2009; Nishikura 2010; Klironomos et al. 2013; Розенталь 2015; Нисикура 2016). Однако у большинства изученных видов отношение несинонимичных сайтов редактирования (N) к синонимичным ( S ) сайтов редактирования ( N / S ) ниже, чем ожидалось для случайных сайтов, что позволяет предположить, что события перекодирования могут быть в целом неадаптивными ( Сюй и Чжан 2014). Здесь также Drosophila и головоногие моллюски выделяются как исключения, демонстрируя высокие отношения N / S , указывающие на положительный выбор перекодирования.Кроме того, было показано, что сотни сайтов перекодирования сохраняются в линии Drosophila (Graveley et al. 2011; Rodriguez et al. 2012; St Laurent et al. 2013; Mazloomian and Meyer 2015; Yu et al. 2016; Buchumenski et al. др., 2017; Дуан и др., 2017; Чжан и др., 2017), и тысячи головоногих моллюсков со сложным поведением (Гарретт и Розенталь, 2012; Алон и др., 2015; Лискович-Брауэр и др., 2017), что подтверждает функциональную важность эти события редактирования. Однако только на нескольких примерах был явно продемонстрирован положительный эффект, предоставляемый редактированием РНК (см., Например, (Garrett and Rosenthal 2012)), и даже пока не ясно, в какой степени редактирование действительно используется для диверсификации протеома.

Социальные насекомые, в том числе пчелы и муравьи, обладают обширной фенотипической пластичностью. Морфологически и поведенчески дифференцированные социальные касты, такие как королевы, рабочие и дроны, имеют одинаковый набор диплоидного или гаплоидного генома. Социальные насекомые предоставляют нам модельную систему для изучения того, как регулируется фенотипическое разнообразие (Page et al. 2012; Yan et al. 2014). Редактирование РНК хорошо подходит для изменения поведения генетически похожих людей. Действительно, дифференциальное редактирование было продемонстрировано для нескольких участков у муравьев-листорезов и у рабочих шмелей (Li et al.2014; Porath et al. 2019).

Здесь мы хотим изучить вклад редактирования РНК в кастовую дифференциацию медоносной пчелы ( Apis mellifera ), важного опылителя и модели сложного социального поведения у насекомых (Page et al. 2012). В отличие от шмелей, медоносные пчелы имеют четкую специализацию по выполнению своих задач с четко выраженными кастами рабочих. Генетическое картирование продемонстрировало, что фенотипическая пластичность медоносных пчел связана со сложными эпистатическими и плейотропными генетическими сетями, которые влияют на репродуктивную регуляцию и поведение при кормлении (Page et al.2012). Мы хотим проверить, может ли редактирование РНК A-to-I вносить вклад в протеомное разнообразие, лежащее в основе этой фенотипической пластичности. Мы исследуем аддому РНК A-to-I в различных тканях четырех трутней медоносной пчелы и обнаруживаем более четырехсот участков A-to-I во многих тканях. Редактирование обогащено заголовком и демонстрирует признаки положительного отбора и особенно высокое отношение N / S . Мы показываем, что редактирование у собирателей выше, чем у медсестер. Сохраняются пять участков редактирования между пчелой, шмелем и Drosophila .Интересно, что мы находим значительно большое количество случаев, когда один и тот же ген редактируется и у пчел, и у мух, даже если не в одном месте. Одним из примеров является автоматическое редактирование мРНК Adar у пчел и мух, которое может играть саморегулирующую роль в двух кладах. Это открытие может дополнительно поддержать возможную конвергентную эволюцию и адаптацию.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Editome медоносной пчелы

Мы глубоко секвенировали геномную ДНК и РНК из головы, грудной клетки и брюшной полости для каждого из четырех отдельных дронов (12 образцов последовательностей РНК) (рис. 1A).Библиотеки транскриптомов дронов 1 и 2 были сконструированы путем отбора мРНК с полиА-хвостами, в то время как библиотеки дронов 3 и 4 были сконструированы с использованием набора Ribo-Zero для истощения рибосомных РНК (прозрачные методы). Самец-дрон гаплоиден, что упрощает идентификацию его геномных SNP. Считывания ДНК-Seq были сопоставлены с эталонным геномом для идентификации 826 890-858 949 SNP в каждом из четырех дронов и 1 303 225 уникальных сайтов вместе (прозрачные методы; таблица S1). Медиана охвата секвенированием на сайтах SNP составила 39 и 96.6% сайтов, все считывающие ДНК, поддерживали SNP (дополнительный рисунок S1). Идентифицированные SNP затем использовались для создания замаскированной версии генома, в которой референсный аллель заменяется индивидуально-специфическими аллелями, идентифицированными для каждого дрона, для облегчения точного обнаружения сайтов редактирования РНК (рисунок 1B; прозрачные методы).

(A) Рабочий процесс сбора образцов, анализа и построения библиотеки.(B) Идентификация сайтов редактирования РНК A-to-I облегчается путем сопоставления как с эталонным геномом, так и с замаскированным геномом. (C) Распределение типов несоответствия ДНК-РНК, обнаруженных у пчел. (D) Распределение обнаруженных сайтов редактирования A-to-I по различным генным регионам. (E) Редактирование уровней при обнаружении, измеренном в трех тканях каждого из четырех человек (D1-D4). Уровни редактирования выше в голове (голова по сравнению с объединенными грудной клеткой и животом, тест суммы рангов Вилкоксона; ***: P <0.001. Точные значения P , слева направо: 2.1e-35, 5.7e-20, 4.0e-29 и 3.9e-38). (F) Профили редактирования для двенадцати тканей сгруппированы в соответствии с их тканью происхождения.

Для каждого из 12 образцов RNA-Seq 9,2–21,5 миллиона считываний были однозначно сопоставлены с эталонным геномом, и аналогичное количество считываний было сопоставлено с замаскированными последовательностями генома (прозрачные методы; таблица S2). Анализируя объединенные данные для каждой из трех тканей отдельно, мы идентифицировали (FDR = 0,05) 376 (84.3%) сайтов A-G среди 446 вариантов головы, 106 (66,7%) сайтов A-G среди 159 вариантов грудной клетки и 137 (67,5%) сайтов A-G среди 203 вариантов брюшка ( Рисунок S2). В совокупности мы получили 407 (80,1%) уникальных сайтов A-to-G среди 508 вариантов (рис. 1C). Эти 407 сайтов считаются сайтами редактирования РНК A-to-I (таблица S3, информация о сайтах-кандидатах для редактирования, выявленных в этом исследовании, относится к рисунку 1). Нуклеотидный контекст вокруг этих предполагаемых сайтов редактирования согласуется с известным мотивом связывания ADAR (Рисунок S3).Среднее покрытие ДНК (по 407 сайтам редактирования A-to-I) составило 25 чтений, что достаточно для исключения возможных SNP (рис. S4).

Для повышения точности картирования мы отбросили варианты в повторяющихся областях и потребовали найти сайт вариации путем картирования как на эталонный геном, так и на замаскированный геном (прозрачные методы). Чтобы проверить, являются ли эти критерии слишком строгими, мы проверили варианты сайтов, отброшенные двумя этапами фильтрации. Сначала мы посмотрели на сайты вариаций, расположенные в повторяющихся регионах.Без какого-либо фильтра мы обнаружили 19573 уникальных сайта вариаций, которые перекрывались с повторяющимися областями, только 3694 (19%) из которых были вариантами от A до G. После биномиального теста и множественной коррекции тестирования (для удаления случайных ошибок секвенирования) было сохранено 1277 сайтов вариаций, из которых только 324 (25%) вариации от A до G. Таким образом, фильтрация повторяющихся областей действительно вносит заметный вклад в точность нашего обнаружения. Соответственно, анализ гиперредактирования не выявил нескольких сайтов в повторяющихся областях (прозрачные методы).

Что касается фильтра замаскированного генома, то только 38% (98/256) сайтов вариаций, обнаруженных при картировании с замаскированным геномом, но не с эталонным геномом, являются несоответствиями A-G. После биномиального теста на ошибку секвенирования и множественной коррекции тестирования для значений P был сохранен только 41 сайт вариации, ни один из них не был вариацией от A до G. Напротив, только 31% (82/268) сайтов вариаций, обнаруженных при картировании с эталонным геномом, но не с замаскированным геномом, являются несовпадениями A-G.Из этих 268 сайтов вариаций 82 были сохранены после многократной тестовой коррекции, 20 из них были вариациями от A до G. Таким образом, большинство сайтов, поддерживаемых только одним методом картирования, скорее всего, не связано с редактированием РНК A-to-I.

Среди 407 сайтов редактирования, которые мы идентифицировали, 199 сайтов расположены в областях генов, включая 111 несинонимичных ( N ) сайтов, 9 синонимичных ( S ) сайтов и несколько сайтов в UTRs и интронах (рисунок 1D). Остальные 208 сайтов помечены как межгенные.Как и ожидалось от различных стратегий построения библиотеки, доля сайтов в кодирующих областях выше, а межгенная фракция ниже для сайтов, наблюдаемых в дронах 1 и 2 по сравнению с дронами 3 и 4 (23,2 ± 2,6% в CDS в дронах 1 и 2. против 14,5 ± 5,1% в CDS у дронов 3 и 4; 54,9 ± 2,2% в межгенных регионах у дронов 1 и 2 против 70,5 ± 5,4% в межгенных регионах у дронов 3 и 4). Количество сайтов, редактирование которых наблюдается в каждой выборке (уровень редактирования для каждой выборки> 0), значительно варьируется (40–278 сайтов в выборке; Таблица S4).Частичное перекрытие между этими наборами сайтов в основном связано с тем, что сайты не обнаруживаются в данной выборке из-за низкого охвата выборкой (рисунок S5).

Интересно, что редактирование вроде бы обогатилось головами. Количество обнаруженных сайтов (рисунок S6), уровни редактирования (рисунок 1E) и доля кодирующих сайтов (рисунок S7) — все выше в заголовках. Группируя образцы по их профилю редактирования, три типа тканей образуют отдельные кластеры (рис. 1F). Соответственно, экспрессия Adar также выше в головах, чем в других тканях (Рисунок S8).Если посмотреть на конкретные сайты, 78 сайтов (из 378 сайтов с достаточным охватом, см. «Прозрачные методы») редактируются по-разному в голове, по сравнению с тканями, не относящимися к голове. На всех этих 78 сайтах редактирование стоит выше (таблица S3, информация о сайтах-кандидатах для редактирования, выявленных в этом исследовании, относящаяся к рисунку 1).

Сигналы адаптации

Отношение несинонимичных к синонимичным ( N / S ) для сайтов в кодирующей области составляет 111/9 = 12,3 (Таблица S4) по сравнению с отношением 2.26 наблюдалось для случайных замен аденозина на гуанозин (см. «Прозрачные методы»). Это убедительно свидетельствует о том, что несинонимичные события редактирования у медоносных пчел в целом адаптивны. Примечательно, что N / S исключительно высоки даже по сравнению с соотношениями, которые мы ранее обнаружили в мозге Drosophila (Duan et al., 2017) или у головоногих моллюсков (Alon et al.2015; Liscovitch-Brauer et al. al.2017). Если посмотреть на каждый образец отдельно, на объединенные данные о тканях или сосредоточиться на участках, которые появляются по крайней мере у двух человек на ткань, то соотношение N / S особенно велико в головах (рис. 2A и таблица S4).Кроме того, уровень редактирования несинонимичных сайтов значительно выше, чем уровень редактирования синонимичных сайтов в головах пчел (рис. 2B).

(A) Наблюдаемое количество несинонимичных ( N ) и синонимичных ( S ) сайтов редактирования в каждой ткани. Значения P получены с помощью точного теста Фишера, сравнивающего наблюдаемые значения N и S со всеми аденозинами в кодирующей последовательности A.mel ( N = 4 492 737 сайтов, где замена A-G несинонимична, и S = 1 986 130 для синонимичных). «Все сайты» представляет собой количество сайтов, которые появляются хотя бы у одного человека. Также показаны сравнения для сайтов, появляющихся как минимум у двух человек. (B) Уровни редактирования несинонимичных и синонимичных сайтов в голове. Данные с четырех дронов были объединены для увеличения статистической мощности. Значения P рассчитываются с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона.(C) Доля сайтов в предсказанных стабильных шпилечных структурах. Наблюдаемые участки редактирования сравнивали с неотредактированными аденозинами ( P — значения с использованием точного критерия Фишера). (D) Плотность SNP в непосредственной близости от несинонимичных сайтов редактирования (зеленый), других сайтов редактирования (голубой) или неотредактированных аденозинов (серый).

Предыдущее исследование головоногих предполагало, что колеоиды массово редактируют свои РНК, чтобы разнообразить транскриптом за счет ограничения эволюции геномных последовательностей (Liscovitch-Brauer et al.2017). Поддержание полезного редактирования требует сохранения геномной последовательности геномной последовательности, кодирующей структуры дцРНК, которые позволяют ADAR связывать и дезаминировать аденозин. Чтобы проверить это, мы сначала подтвердили, что участки редактирования у медоносных пчел обогащены шпильками (рис. 2C). Затем мы продемонстрировали, что SNP истощаются в непосредственной близости от несинонимичных сайтов (рис. 2D), что дополнительно подтверждает идею избирательного преимущества для несинонимичных событий редактирования, что оправдывает компромисс между разнообразием транскриптомов и эволюцией генома.

Эволюционно консервативные и неконсервативные сайты редактирования

Редактирование четырех несинонимичных и одного синонимичного сайта сохраняется между Drosophila и медоносными пчелами (рис. 3). Три из этих сайтов находятся в транскрипте Shab ( шейкер, родственный b , два несинонимичных и один синонимичный), а два других находятся в qvr ( quiver ). Редактирование на этих участках также наблюдается у шмеля Bombus terrestris (Porath et al.2019), и уровни редактирования высоки для всех этих видов (Рисунок 3). Эти данные предполагают потенциальную функциональную роль этих широко консервативных сайтов редактирования. Однако большинство сайтов редактирования не используются совместно Drosophila и пчелами. Для некоторых сайтов редактируемый аденозин не сохраняется в геноме медоносной пчелы (Рисунок S9) и, таким образом, явно не редактируется, в то время как другие аденозины сохраняются, но редактирование не было обнаружено в данных RNA-Seq (Рисунок S9). В целом, из 639 сайтов редактирования Drosophila в CDS, для которых был идентифицирован ортологичный сайт у медоносных пчел, 349 были сохранены как A (55%), а 85, 127 и 78 (13%, 20% и 12%) были мутированы на C, G и T соответственно.

(A) Один синонимичный и два несинонимичных сайта редактирования в транскриптах Shab редактируются в головах двух пчел и четырех видов Drosophila . (B) Два несинонимичных сайта редактирования в транскриптах qvr редактируются в головах двух пчел и четырех видов Drosophila . Сайты редактирования окрашены в красный цвет. Уровни редактирования, измеренные в головах самцов мух (не опубликовано), объединенных головах трутней медоносных пчел и мозге шмелей (Porath et al.2019). D. ​​mel , Drosophila melanogaster ; D. ​​sim , Drosophila simulans ; D. ​​sec , Drosophila sechellia ; D. ​​ere , Drosophila erecta; D. pse, Drosophila pseudoobscura; D. wil, Drosophila willistoni; D. moj, Drosophila mojavensis; A. mel , Apis mellifera ; B. ter , Bombus terrestris .

Аналогичным образом, большинство участков даже не сохраняются у двух видов пчел.Исследование шмелей сообщило о 219 сайтах редактирования в CDS, 164 из которых не являются синонимами (Porath et al.2019). Из них мы нашли 9 сайтов редактирования в кодирующих областях, сохраненных между пчелами и шмелями (Таблица S5).

Одним из таких консервативных сайтов является сайт Ser> Gly в транскрипте tipE (температурно-индуцированный паралитический E; GB47375 ), уровни редактирования которого коррелируют с выполнением задач у шмелей (медсестры по сравнению с собирателями) (Porath et al. др.2019). Уровень редактирования на этом сайте в пчелиных головах ~ 0.7, аналогично тому, что наблюдается в мозге шмеля. В двух других тканях этот ген слабо экспрессируется и плохо редактируется. Ортологичный сайт в геномах Drosophila кодирует постредактированный кодон Gly GGC (фигура S10). Таким образом, перекодирование tipE , похоже, зависит от пчел и, возможно, связано с социальным поведением и выполнением задач.

Зависимое от пола и кастовое редактирование

Мы дополнительно искали потенциальную зависимость от пола и кастовое редактирование, сравнивая наши данные о голове медоносного дрона с ранее опубликованными данными РНК-секвенирования мозга, изучающими две подкасты женщин-рабочих, собирателей и возвращенные медсестры (Herb et al.2012) (Таблица S6). Во-первых, мы сравнили объединенные уровни редактирования между дронами и рабочими для каждого хорошо покрытого (> 10 чтений в каждом пуле) сайта редактирования отдельно. Двадцать шесть сайтов демонстрируют дифференциальное редактирование (тест суммы рангов Вилкоксона; FDR = 0,05) между рабочими (женщины) и дронами (мужчины), включая 4 сайта перекодирования, 2 сайта в 3’UTR, 3 интронных сайта и 17 межгенных сайтов (рис. 4A). и Таблица S7, Различно редактируемые сайты между дронами и рабочими, относящаяся к Рисунку 4). В большинстве случаев редактирование в дронах выше, но это может быть результатом просмотра сайтов, идентифицированных в данных дронов, с самого начала.Разница в экспрессии Adar не была статистически значимой (рисунок S11).

(A) Сравнение уровней редактирования между дронами (мужчины) и рабочими (женщины). Статистически значимые сайты (FDR <0,05) окрашены в красный цвет. (B) Уровень экспрессии Adar (количество считываний, нормализованное DESeq2) у медсестер и собирателей. Данные представлены как среднее значение ± SEM (стандартная ошибка среднего). Значение P рассчитывали с использованием критерия суммы рангов Вилкоксона.(C) Корреляция Спирмена между экспрессией Adar и индексом редактирования (сумма по всем аллелям G во всех участках, деленная на сумму всех покрытий на всех участках) для всех выборок медсестер (оранжевый) и собирателей (фиолетовый). (D) Сравнение уровней редактирования двух подкаст рабочих: медсестер и собирателей. Статистически значимые сайты (FDR <0,3; см. Результаты) окрашены в красный цвет. (E) PCA-анализ профиля редактирования показывает различное поведение медсестер и собирателей, в то время как (F) PCA профиля экспрессии (гены с RPKM> 1) не приводят к четкому разделению.

Сравнивая объединенные уровни редактирования между двумя подкастами (собиратели и медсестры), можно найти 230 из 407 участков с более низкими уровнями у медсестер, по сравнению с только 91, показывающими более высокие уровни у медсестер (равный уровень, в основном нулевой, наблюдался на 84 участках), что предполагает более высокую глобальную активность редактирования (на обнаруженных участках) у собирателей ( P = 1,3e-14, критерий пропорции). Доплата за участки, где собирают более высокие урожаи, сохраняется за различный охват и границы разницы при редактировании (Рисунок S12).Более того, выражение Adar (рис. 4B) и индекс редактирования (рис. 4C) выше у собирателей, а индекс редактирования коррелирует с выражением Adar . Однако надежное обнаружение конкретных участков с дифференциальным редактированием с доступным размером выборки (6 собирателей и 6 медсестер) является сложной задачей, и ни один участок не был идентифицирован с FDR = 0,05 (критерий суммы рангов Вилкоксона). Таким образом, мы ослабили статистический тест, допустив FDR = 0,3, и нашли 61 участок-кандидат, большинство из которых редактируются по-разному (Рисунок 4D и Таблица S8, Различно редактируемые сайты между сборщиками и медсестрами, относящиеся к рисунку 4).К ним относятся 10 несинонимичных, 16 3’UTR и 35 межгенных сайтов. Соответственно, 55 из этих участков демонстрируют более высокий уровень редактирования у фуражиров. Наконец, PCA-анализ профиля редактирования на разных сайтах приводит к выделению отдельных кластеров дронов, медсестер и собирателей, классификация, которая не достигается профилем экспрессии (рис. 4E и 4F). Взятые вместе, эти результаты показывают глобальное увеличение редактирования у собирателей по сравнению с медсестрами.

Конвергентная адаптация редактирования A-to-I?

Один из консервативных сайтов перекодирования между двумя видами пчел находится в транскрипте Adar (Таблица S5 и Рисунок 5A).У шмелей уровень перекодирования консервативного сайта I482M (от ATA до ATG) положительно коррелирует с глобальной активностью редактирования (Porath et al.2019), что указывает на возможный механизм саморегуляции. Интересно, что Drosophila Adar также автоматически редактируется в другом положении, где замена Ser (AGT) на Gly (GGT) приводит к менее активному белку ADAR, что приводит к отрицательной обратной связи активности редактирования (Palladino et al. 2000; Савва и др. 2012а). Интересно, что редактируемая мухами аминокислота Ser сохраняется у пчел и шмелей, но используется другой кодон (TCA, не редактируемый в первом положении кодона).Точно так же Ile, редактируемый пчелами, сохраняется у мух, но отредактированные аденозины (в третьей позиции ATA) синонимично мутированы на T, а редактируемый пчелиный кодон ATA заменяется кодоном ATT у мух, который не может быть отредактирован на третья позиция (рис. 5А). Таким образом, в то время как автоматическое редактирование S430G у мух отменено у пчел из-за нередактируемого кодона Ser, а авторедактирование I482M у пчел отменено у мух из-за нередактируемого кодона Ile. Однако механизм авторедактирования, возможно, используемый для глобальной регуляции ADAR, является общим для двух клонов, хотя и в разных положениях и, возможно, с разными эффектами на белок.Это может указывать на возможность конвергентной эволюции стратегии саморегуляции ADAR.

(A) Стенограммы Adar автоматически редактируются в Drosophila и пчелах. Сайт Ser> Gly высоко консервативен у видов Drosophila . У пчел Drosophila -редактируемый Ser-кодон AGT заменен на неотредактируемый Ser-кодон TCA. С другой стороны, сайт автоматического редактирования Ile> Met сохраняется между пчелами и шмелями.Редактируемый пчелами кодон Ile ATA (отредактированный в третьей позиции) появляется у мух как нередактируемый кодон Ile ATT. Сайты редактирования окрашены в красный цвет. Показаны уровни редактирования по головам самцов мух (не опубликовано), объединенным головам трутней медоносных пчел и мозгам шмелей (Porath et al.2019). D. ​​mel , Drosophila melanogaster ; D. ​​sim , Drosophila simulans ; D. ​​sec , Drosophila sechellia ; D. ​​ere , Drosophila erecta ; А.mel , Apis mellifera ; B. ter , Bombus terrestris . (B) Диаграмма Венна, демонстрирующая перекрытие между ортологичными генами с сайтами редактирования в кодирующих областях. (C) Наблюдаемое количество ортологичных генов с редактированием в кодирующих областях по сравнению с ожидаемым распределением. Для расчета ожидаемых чисел были выбраны гены с RPKM> 1 у обоих видов (результаты практически одинаковы для других пороговых значений экспрессии, рисунок S13). P — значения, рассчитанные методом рандомизации.(D) Соотношения несинонимичных и синонимичных ( N / S ) значительно выше, чем ожидалось, как для общих, так и для видоспецифичных участков (за исключением видоспецифичных участков в B. terrestris ). Здесь общие и видоспецифичные сайты относятся к сайтам в общих генах и видоспецифичных генах, как определено на приведенной выше диаграмме Венна в (B). Ожидаемое соотношение оценивается путем расчета эффекта предполагаемого редактирования на все аденозины в кодирующей области. P — значения по точному тесту Фишера.

Следуя этому примеру, мы задались вопросом, есть ли еще гены, редактирование которых наблюдается как у медоносных пчел, так и у Drosophila , даже если точное местоположение сайта редактирования не сохраняется. Исключая консервативные сайты, существует 53 гена, демонстрирующих редактирование CDS в головах медоносных пчел, 101 ген, демонстрирующих редактирование CDS в головах шмелей, и 312 генов, редактируемых в CDS в головном мозге самцов D. ​​melanogaster . Из них 21 ген подвергается редактированию у обоих видов пчел, 14 редактируются у пчел и Drosophila, 14 редактируются у шмелей и Drosophila , а шесть генов редактируются у всех трех видов (Рисунок 5B и Таблица S9. ).Эти числа значительно выше, чем ожидалось при случайной выборке (p <1e-6, рандомизационный тест), даже с учетом профиля экспрессии (прозрачные методы, рисунок 5C и рисунок S13). Таблица S9). Мы повторили анализ, используя более строгие критерии для характеристики сайтов, рассматривая как редактируемые только сайты с наблюдаемым уровнем редактирования> 10% (все образцы объединены) и биномом P <0,05 (исключая нулевую гипотезу об отсутствии редактирования), и считая сайт неотредактируемым, если бином P <0.05 для нулевой гипотезы о том, что сайт редактируется на 10%. Обнадеживает то, что результаты устойчивы к этому изменению определений (рис. S14 и S15). Эти результаты предполагают интересную конвергентную эволюцию редактирования «от А до Я». Сайты перекодирования редко сохраняются в разных кладах, но одни и те же гены в разных клонах имеют тенденцию приобретать событие перекодирования, по-видимому, независимо, что указывает на функциональную важность для перекодирования этого гена.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на более чем пятнадцатилетний опыт разработки, надежное обнаружение редактирования CDS остается проблемой.Систематический поиск часто приводит к высокому уровню ложноположительных результатов (что отражается в доле наблюдаемых несоответствий, не связанных с AG), особенно для транскриптомов млекопитающих, где объем перекодирования довольно низок. Важным исключением являются Drosophila и головоногие моллюски, у которых сигнал перекодирования более выражен и легче обнаруживается. Применяя новый подход строгого совмещения, мы смогли достичь здесь высокой точности обнаружения редактирования CDS (84,3% в головах), несмотря на общий скромный объем сайтов перекодирования.Другое сходство между медоносными пчелами Drosophila и головоногими моллюсками связано с важным вопросом, касающимся степени адаптивности перекодирования. Это часто оценивается по соотношению N / S , где Drosophila и головоногие моллюски демонстрируют паттерн, заметно отличающийся от паттерна, наблюдаемого у других изученных видов (включая человека). В то время как у большинства видов наблюдаемое соотношение N / S ниже или похоже на ожидаемое при нейтральности, оно значительно выше у Drosophila и головоногих моллюсков.Опять же, мы находим здесь, что пчелы показывают поразительно высокое отношение N / S , подобное двум вышеупомянутым кладам. Мы предлагаем соединить две последние точки между собой. Очевидно низкое соотношение N / S , наблюдаемое у многих видов (включая человека), может отражать низкую точность списков сайтов редактирования CDS, а не (отсутствие) адаптивного потенциала для перекодирования у этих видов.

Важность посттранскрипционных и посттрансляционных механизмов в создании протеомной сложности высших организмов была подчеркнута в последние десятилетия.Эти эпигенетические механизмы позволяют диверсифицировать протеом и функциональную гетерогенность в тканях, стадиях развития, областях мозга или даже среди отдельных клеток.

Перекодирование путем редактирования РНК A-to-I — это эпигенетический механизм, способный диверсифицировать протеом, создавая ряд белков из одного геномно-кодируемого гена регулируемым по времени, тканеспецифичным, зависимым от состояния способом и обеспечивая организм с новыми средствами акклиматизации и адаптации.Действительно, несколько исследований продемонстрировали, как уровни перекодирования в определенных местах действительно меняются в зависимости от состояния организма (Garrett and Rosenthal 2012; Robinson et al. 2016; Gallo et al. 2017; Porath 2017; Terajima et al. 2017; Yablonovitch et al. al.2017). Важно отметить, что многие исследования продемонстрировали изменение редактирования отдельных целей перекодирования при различных болезненных состояниях (Gallo et al., 2017). Однако, несмотря на эти интересные примеры, степень, в которой феномен перекодирования фактически используется как средство диверсификации протеома, все еще обсуждается.Фактически, несколько недавних исследований выявили возможность того, что несинонимичное редактирование может использоваться для компенсации вредных мутаций G-to-A, вместо того, чтобы допускать сосуществование двух аллелей (A и G) (Jiang and Zhang 2019; Май и Чуанг, 2019; Попич и др., 2020). Таким образом, высокого отношения N / S недостаточно, чтобы доказать, что редактирование служит для адаптации через диверсификацию протеома.

Поведенческая, физиологическая и морфологическая пластичность социальных насекомых предполагает важную роль эпигенетических механизмов.Дифференциальное редактирование РНК ранее было показано для разных каст высокообщественного муравья-листореза Acromyrmex echinatior (Li et al. 2014), а также для рабочих-шмелей (Porath et al. 2019). Наши результаты распространяют эти находки на другие виды, дополнительно подтверждая идею редактирования РНК как источника протеомной сложности, которая может быть задействована для обеспечения фенотипической изменчивости среди генетически идентичных особей.

Ферменты ADAR и феномен перекодирования широко консервативны у многоклеточных животных.Однако репертуар сайтов перекодирования значительно различается и, кажется, развивался почти независимо в разных кладах. Здесь мы отмечаем, что одни и те же гены-мишени редактируются у далеких видов, даже если точное расположение сайтов редактирования в транскрипте различается. Особенно интересным примером является несинонимичное авторедактирование Adar , которое, как было показано, влияет на активность ADAR у шмелей, мух и даже млекопитающих (Rueter et al. 1999; Savva et al. 2012a; Porath et al.2019), что, возможно, служит глобальным авторегулированием редактирования. Таким образом, представляется возможным, что избирательное преимущество наличия нескольких версий белкового продукта разделяется генами-мишенями, в то время как существует более чем один конкретный способ достижения этого разнообразия посредством перекодирования. Клады, разработанные по разным эволюционным маршрутам, сошлись на разных реализациях (с точки зрения конкретного сайта редактирования) одного и того же диверсифицирующего решения. Эти идеи следует дополнительно проверить в будущем с использованием более крупных наборов данных и по дополнительным видам и кладам.Более того, по мере получения биохимического и функционального понимания воздействия различных редакций появится возможность изучить возможный общий эффект для различных редакций общих мишеней.

Ограничения исследования

Подборки видов пчел, анализируемых здесь, основаны на ограниченном количестве образцов. Они, вероятно, представляют собой подмножество фактического репертуара редактирующих сайтов. Результаты следует проверить повторно, когда станет доступно больше данных. В частности, пчелиный зал был построен с использованием образцов дронов.Таким образом, при некотором индивидуальном дифференциальном редактировании между подкастами медсестер и собирателей могли пропустить сайты, посвященные конкретным работникам. Однако глобальное усиление редактирования у собирателей, поддерживаемое более высоким выражением Адара, вероятно, надежно.

Доступность ресурсов

Контактное лицо для потенциальных клиентов

Дополнительная информация и запросы на ресурсы должны направляться напрямую и выполняться ведущим контактным лицом, Цзянь Лу (luj {at} pku.edu.cn).

Доступность материалов

Это исследование не привело к созданию новых уникальных материалов.

Доступность данных и кода

Все данные глубокого секвенирования, полученные в этом исследовании, были депонированы в Архиве геномных последовательностей Китайского национального центра геномных данных (GSA) под регистрационным номером CRA002262. Другие проанализированные данные глубокого секвенирования были загружены из SRA следующим образом. Мозг рабочих пчел: инвентарные номера от SRR445999 до SRR446004 (возвращенная медсестра) и от SRR446005 до SRR446010 (собиратель) (Herb et al. 2012). Шмель: SRP166322 (Порат и др., 2019). D. ​​mel головка: SRP067542 (Zhang et al.2018). D. ​​sim head: SRP074828 (Duan et al.2017). D. ​​pse : DRR055250 и DRR055251 (Nozawa et al., 2016). D. ​​wil : SRR341127 и SRR341129 (Meisel et al. 2012). D. ​​moj : SRR037508-SRR037518 (создано проектом Drosophila modENCODE). Данные D. ​​sec и D. ​​ere — это неопубликованные данные, полученные в нашей собственной лаборатории. В качестве эталонных версий геномов, используемых для видов Drosophila , используются Dmel_r6.04 (http: // flybase.org /) для D. ​​mel и версии droSim1, droSec1, droEre1, dp4, droWil1 и droMoj3, загруженные из браузера генома UCSC (http://genome.