Мед генетика это: Медицинская генетика — это… Что такое Медицинская генетика?

Краткий словарь генетических терминов

Краткий словарь основных понятий и терминов, использующихся в генетике

Для понимания того, с чем работает наша компания и зачем эта работа нужна, какие результаты мы получаем и что они вам расскажут, можно прийти на консультацию к специалистам ЦГРМ «ГЕНЕТИКО». А для того, чтобы Вы не забыли, о чем был разговор, и не утонули в море новой информации, мы составили для Вас небольшой словарик основных понятий и терминов, использующихся в генетике.

Основным положением биологической науки является то, что клетка – это самое маленькое из возможных проявление жизни и что новая клетка может появиться только от уже существующей и никак не может возникнуть сама по себе. Конечно, это приводит к большому количеству вопросов о том, как зародилась жизнь и каким образом могла сформироваться самая первая клетка. Но для удобства будем считать обозначенные положения верными в современной реальности планеты Земля, где мы живем. Несмотря на невообразимо огромное разнообразие живых существ, все они состоят из клеток. И у всех клеток есть схожие черты, которые обусловлены самыми простыми жизненными необходимостями. Во-первых, клетка должна как-то отделяться от внешнего пространства – для этого есть специальная оболочка.

Во-вторых, клетка должна питаться – для этого есть разные системы, способные преобразовать энергию света или химических связей в необходимые для жизни вещества и удобную для использования энергию. И еще клетка умеет размножаться. Для выполнения всех этих функций необходимы механизмы, основу которых составляют белки и РНК. А вот инструкция, как эти молекулы должны выглядеть и работать, хранится в специальном отсеке клетки – ядре – в виде ДНК. Ошибки в этой инструкции, которая разрабатывалась миллионы лет, приводят к смерти клетки. А в многоклеточном организме, таком, как у человека, например, клетки взаимодействуют друг с другом, поэтому нарушение в работе одной или нескольких клеток может привести не к смерти всего организма, а к нарушениям его работы – заболеваниям. Также необходимо помнить, что человеческий организм огромная система, ансамбль миллионов разнообразных маленьких организмов, которые выросли из одной единственной клетки – зиготы – результата слияния яйцеклетки и сперматозоида.

ДНК – ДезоксиРибонуклиновая Кислота – полимер, то есть молекула с большим количеством последовательно повторяющихся структурных элементов, который несет всю информацию о генах и белках, необходимых для жизни всего организма. ДНК является картотекой, библиотекой и матрицей, с которой считывается информация в определенной последовательности и определенных условиях, разъяснения о которых записаны как в самой ДНК, так и с помощью различных дополнительных модификаций этой молекулы. Каждой хромосоме соответствует 1 молекула ДНК. Структурными блоками этого полимера являются дезоксирибонуклеотиды (=нуклеотиды), которые бывают 4х видов (А, Т, Г, Ц).

Последовательность ДНК – это то, в каком порядке в молекуле ДНК идут ее структурные элементы – нуклеотиды. Таким образом, генетической информацией является именно последовательность ДНК, а молекула ДНК является ее физическим носителем.

Хромосома – это молекула ДНК, специальным образом обернутая различными белками, которые помогают управляться с такой длинной молекулой, чтобы она не порвалась, не перепуталась с другими ДНК-молекулами и была физически доступна для белков, осуществляющих работу всего генетического аппарата.

РНК –РибоНуклиновая Кислота – полимер, который выполняет функциональную роль переносчика информации, то есть копии, которая делается с ДНК и используется для создания функциональных молекул: специальных РНК или белков. Специальные молекулы РНК могут не являться матрицами, на базе которых синтезируется белок, а сами выполняют структурные, ферментативные или транспортные функции. Главное, что последовательность структурных блоков в молекуле РНК всегда определена последовательностью ДНК соответствующего участка.

Белок – основная функциональная единица живой клетки с самым широчайшим спектром функций и возможностей. Как ДНК и РНК, является полимером, однако имеет химически иные структурные блоки – аминокислоты. Их последовательность, с одной стороны, напрямую зависит от соответствующей последовательности ДНК и может изменяться только в ограниченных и предусмотренных в ДНК инструкций, с другой стороны является основой структуры, в том числе пространственной, возможностей и функции белков разных типов.

Ген – определение гена включает два аспекта: теоретический и физический. Теоретически, то есть умозрительно, геном называют последовательность ДНК (слово, записанное на языке генетики), обладающее определенными свойствами. Как и слово в языке, ген является основой наследственной информации, в то время как различные другие структуры можно отнести к знакам препинания или вспомогательным элементам. Ген является подробной инструкцией для синтеза белка или специфической РНК, которую он кодирует. Причем эта инструкция описывает не только последовательность молекул, но и то в каких условиях и как они должны работать и выполнять свои функции. С физической, то есть материальной, точки зрения, ген – это часть молекулы ДНК с определенными структурными элементами. Как внутри слова есть приставка, корень, суффикс и окончание, позволяющие слову адаптироваться для каждой конкретной фразы, так и у гена есть промотор, экзоны и интроны. Первый обозначает начало гена, экзоны – это ключевая информация о последовательности РНК или белка, а интроны необходимы для регуляции и тонкой настройки работы гена в условиях разных тканей, органов и изменяющейся окружающей среды.

Экспрессия гена – это эффективность работы гена, так как для его функционирования недостаточно его наличия в геноме – с него должна считываться информация. Именно то, как часто и в каком объеме считывается информация с гена, выражают термином экспрессия.

Локус – участок молекулы ДНК, содержащий различный структурные элементы, в том числе один или несколько генов.

Геном– это последовательность всех молекул ДНК организма. Важно помнить, что в каждой клетке одного организма в норме содержатся одинаковые по количеству и последовательностям молекулы ДНК, а различается экспрессия конкретных генов.

Экзом – это последовательности ДНК экзомных участков генов, то есть так называемая основная кодирующая составляющая. Это то, с чем работает организм, в то время как остальная часть генома объясняет, как работать и в каких условиях как применять и настраивать кодирующую часть генома.

Мутация – изменение последовательности ДНК по сравнению другими клетками организма или другими представителями вида. Мутации могут возникать как из-за воздействия внешних неблагоприятных условий, так и из-за того, что наши ферменты работают пусть с редкими, но ошибками. Так как происходит физическое изменение в носителе информации – ДНК, такое изменение может передаваться из поколения в поколение.

Частота мутаций — относительное значение, показывающее у какой доли людей в геноме есть конкретная мутация. Частоту мутации можно рассчитать, как среднюю для всех людей, так и отдельно по расовым или национальным, или любы другим группам. В медицинской генетике под мутацией подразумевают изменение ДНК, которое может быть связано с каким-то заболеванием, и противопоставляют ее полиморфизму. Хотя по общей логике полиморфизм – это частный случай мутации.

Полиморфизм – нейтральная, а точнее безвредная, мутация, которая сравнительно часто встречается у какой-то группы организмов одного вида. Некоторые мутации встречаются часто у всех людей, некоторые – только среди представителей определенных рас или народностей.

Аллель – вариант последовательности гена в разном виде: от различия в одной букве последовательности до отсутствия целого куска последовательности или вставке лишнего. Эти различия возникают из-за мутации, которая могла произойти у далекого предка и передаться потомству через поколения. Таким образом, каждый ген у отдельного человека может быть представлен конкретным вариантом – аллелем. Для понимания аллелизма необходимо объяснить, что, например, различия в цвете глаз, волос, росте, чувствительности к алкоголю объясняются именно разными аллельными состояниями соответствующих генов.

Генотип – это все гены конкретной особи с указанием аллельного состояния каждого гена и наличия/отсутствия мутаций в межгенных участках ДНК.

Доминантный аллель. В геноме человека содержится по 2 копии каждой хромосомы. Это означает, что в каждом геноме есть две очень похожие по длине и последовательности генов молекулы ДНК, которые отличаются аллельными состояниями генов и мутациями/полиморфизмами в межгенных участках этих молекул ДНК. Из этого следует, что и каждый ген представлен в геноме 2 копиями, каждая из которых может быть определенным вариантом (аллелем) этого гена. Доминантным аллелем называется тот, одной копии которого достаточно для проявления его особенностей. То есть если хотя бы на одной из хромосом ген находится в состоянии доминантного аллеля, то ген будет работать по тому варианту, который описывается именно этим аллелем. Важно, что так как у одного гена может быть более двух вариантов (аллелей), то и доминантность аллеля определяется по отношению к каждому из вариантов, хотя есть и те, которые доминантны по сравнению со всеми другими. Встречаются варианты с одинаковой предпочтительностью для работы, тогда проявляется совместное влияние этих вариантов.

Рецессивный аллель – по аналогии с доминантным аллелем, это такое состояние гена, которое наименее предпочтительно для проявления. Поэтому если в геноме есть другая копия гена, доминантная, то задавать темп работы гена будет именно она, но если и вторая копия гена представлена рецессивным аллелем, то будет работать этот, хотя менее предпочтительный, но в такой ситуации единственно имеющийся вариант. Хотя в большинстве случаев связанные с возникновением заболевания аллели рецессивны, это вредность/полезность не является единственным определяющим фактором рецессивности/доминантности аллеля.

Гомозигота. Гомозиготой по определенной мутации/полиморфизму/аллелю называют такую клетку или организм, в генотипе которой/которого обе копии гена на двух хромосомах представлены одним вариантом, то есть не отличаются по этой мутации/полиморфизму/аллелю.

Гетерозигота. Гетерозиготой по определенной мутации/полиморфизму/аллелю называют такую клетку или организм, в генотипе которой/которого две копии гена на двух хромосомах представлены разными вариантами, то есть отличаются по этой мутации/полиморфизму/аллелю.

Секвенирование – это группа методов, позволяющая узнать последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК. Этот метод обладает некоторыми особенностями. Во-первых, пока что ни один способ секвенирования не позволяет прочитать всю последовательность одной хромосомы, чтение идет сравнительно небольшими отрезка от 50 до несколько тысяч нуклеотидов. Во-вторых, почти все методы устроены так, что из кусочка ДНК делается много одинаковых и читаются они все. Эта особенность проявляется в таком параметре секвенирования, как глубина секвенирования, обозначаемая 10Х, 20Х, 50Х. Чем больше это значение, тем больше раз прочитан один и тот же кусок молекулы, тем точнее можно выявить ошибки секвенирования и особенности участка, например, его гетерозиготность по какой-либо мутации/полиморфизму.

Гаплотип — совокупность состояний/вариантов определенных локусов, которые расположены на одной хромосоме, и вследствие структурных особенностей эти состояния всегда наследуются вместе. То есть, например, если в одном локусе (1) гаплотипа имеется мутация (1А), а в другом (2) имеется уже другая мутация (2M), то именно в таком составе они будут наследоваться (1А2М), а смешанных вариантов (1B2M или 1A2N) не бывает или они относятся к другому гаплотипу.

Гаплогруппа — совокупность особей, имеющих сходный гаплотип по определенным локусам, которые задаются в соответствии с тем, какую задачу нужно решить, определяя гаплогруппу

Митохондриальная ДНК. Если разбираться подробнее и глубже, то генетическая информация одного человека находится не только в 46 хромосомах, располагающихся в специальном отсеке клетки – ядре, но и в клеточных органах митохондриях. У митохондрий в клетке своя задача – преобразовывать энергию, заключенную в химической связи определенных атомов, в более удобную для клетки, то есть они готовят эффективные питательные запасы из разного сырья. Митохондрии довольно сложны, их оболочка хитро устроена, чтобы опасные побочные продукты готовки не могли попасть в остальную часть клетки, поэтому все время таскать туда нужные для их работы белки не слишком продуктивно. Таким образом, у них есть своя ДНК, которая несет информацию о разных особенных белках и РНК, которые нужны именно для работы митохондрии. Такую ДНК называют митохондриальной и она является неотъемлемой и обязательной частью нашего генотипа. Передается она только от мамы, так как сперматозоид для возможности быстро перемещаться и долго оставаться живым несет самый минимум необходимой генетической информации – 23 хромосомы. А вот яйцеклетка, которой для выполнения основной функции не нужно находится в агрессивной окружающей среде, может позволить себе бОльшую массу и дополнительные запасы в виде готовых к работе станций приготовления питания – митохондрий и заранее синтезированных белков и РНК.

Гены половой дифференцировки – группа генов, играющая ведущую роль в определении будет эмбрион развиваться как девочка или как мальчик. В геноме человека основой проявления мужских или женских половых признаков является наличие/отсутствие половой хромосомы Y, а именно особо локуса этой хромосомы – SRY (Sex-determining Region on the Y chromosome). Важно отметить, что нарушения в этом локусе могут приводить не к внешним проявлениям, а к сниженной репродуктивной способности мужчины или ее полному отсутствию. Процесс дифференцировки пола у человека можно представить тремя стадиями: 1) какой набор хромосом получается при слиянии яйцеклетки (всегда несет хромосому X) и сперматозоида (с хромосомой X или Y), 2) формирование женских или мужских половых органов в зависимости от работы генов локуса SRY, 3) развитие вторичных половых органов в соответствии с типом половых органов. Нарушения на разных этапах приводят к разным проявлениям и разным заболеваниям.

Локус AZF – это участок Y-хромосомы, на котором располагаются так называемые факторы азооспермии (AZF — AZoospermia Factors). Это особые участки, которые названы так, потому что если какой-то из них отсутствует из-за мутации, то развивается азооспермия (отсутствие сперматозоидов) или олигозооспермия (малое количество сперматозоидов). Всего обнаружено три таких фактора AZFa, AZFb и AZFc. В норме наличие всех трех является минимальным необходимым условием нормального формирования сперматозоидов. Если в геноме отсутствует один из AZFa и AZFb или оба, то нарушается созревание сперматозоидов и, как следствие, полностью отсутствует репродуктивная функция. При отсутствии локуса AZFc нарушения могут быть не столь сильными, поэтому деторождение остается возможным в некоторых случаях.

Хромосомные аномалии – это крупные мутации, которые связаны с изменением последовательности ДНК не в рамках отдельного гена или нескольких, а в масштабе хромосомы или генома. Например, отсутствие (делеция) большой части или всей хромосомы, лишняя хромосома, или часть одной хромосомы соединена с частью другой хромосомы и т.д.

Наследственное заболевание – это заболевание, вызванное нарушениями в геноме, то есть мутациями, которые либо мешают формированию нормального белка (так как ген – инструкция по его построению – поврежден), либо изменяют регуляцию, то есть условия, когда, в каком месте или с кем такой белок или ген должен работать.

Моногенное заболевание – это наследственное заболевание, вызванное мутацией в одном только в одном гене. Несмотря на то, что все остальные почти 30000 генов могут быть в порядке, изменение последовательности ДНК в этом гене вызывает нарушения функционирования всего организма.

Хромосомное заболевание – наследственное заболевание, вызванное хромосомными аномалиями.

Носительство мутации – это состояние гетерозиготы по аллелю, обладающему какими-то негативными клиническими проявлениями, если он находится в геноме в виде гомозиготы.

Пробанд – человек, с которого начинается составление генеалогического дерева (родословной). Обычно пробанд – это носитель или пациент с наследственным заболеванием, проявление которого и вызвало необходимость генеалогического анализа.

Сиблинг – в генетике таким термином обозначают потомков одних родителей, то есть братьев и сестер, но не близнецов.

Автор: Жикривецкая Светлана

Биолог-исследователь

Лаборатория наследственных болезней обмена веществ

Лаборатория наследственных болезней обмена веществ была создана в Медико-генетическом научном Центре более 30 лет назад. Первые работы в лаборатории были связаны с разработкой тестов для выявления фенилкетонурии и программ селективного скрининга наследственные болезни обмена веществ (НБО). Постепенно лаборатория перешла к применению сложных биохимических и молекулярно-генетических методов точной диагностики наследственных заболеваний. Именно здесь под руководством профессора Ксении Дмитриевны Краснопольской были разработаны подходы к биохимической диагностике болезней клеточных органелл. Сегодня это единственная в России лаборатория, где проводится постнатальная и пренатальная диагностика подавляющего большинства заболеваний из этой группы.

Одним из научных направлений работы подразделения является поиск новых биохимических маркеров для наследственных болезней, разработка новых методов их эффективной диагностики.

Спектр биохимических методов, используемых в лаборатории, исключительно широк и включает: электорофорез гликозаминогликанов мочи, изоэлектрофокусирование трансферинов, хромато-масс-спектрометрию, высокоэффективную жидкостную хроматографию, анализ активности лизосомных и митохондриальных ферментов с применением хромогенных и флуорогенных субстратов, окисграфии. Некоторые из форм НБО, ранее не выявляемые в нашей стране, в лаборатории были диагностированы впервые.

Существенным прорывом в диагностике НБО стало внедрение метода тандемной масс-спектрометрии, который позволяет в микроколичествах биологического материала (пятно высушенной крови или плазмы) выявлять около 30 форм наследственных заболеваний из групп самых распространенных НБО: аминоацидопатий, органическиих ацидурий и дефектов митохондриального β-окисления.

Последние годы в лаборатории активно развиваются имолекулярно-генетические методы. Для некоторых заболеваний из группы НБО созданы протоколы ДНК-диагностики, позволяющие сократить время установления диагноза и избежать применения трудоемких и инвазивных биохимических методов. С 2015 года в лаборатории применяют секвениование нового поколения для одновременного анализа множества генов. Такие панели разработаны для митохондриальных заболеваний, наследственных болезней с преимущественным поражением печени , лейкодистрофий/ лейкоэнцефалопатий.

На сегодняшний день используемые биохимические и молекулярно-генетические методы позволяют диагностировать более 200 различных форм наследственных болезней обмена веществ.

В лаборатории ведется работа по характеристике спектра и частоты мутаций при наследственных мукополисахаридозах, сфинголипидозах, нейрональных цероидных липофусцинозах, разрабатываются алгоритмы диагностики заболеваний, протекающих с поражением белого вещества головного мозга, а также других наследственных нейрометаболических нарушений.

МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА

МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА

Горбунова В. Н.

УЧЕБНИК

для студентов медицинских вузов и слушателей последипломного образования

Оглавление

Предисловие Введение. Предмет медицинской генетики

Часть I. ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА

Глава 1.1. Законы Менделя Глава 1.2. Хромосомная теория наследственности

Глава 1.3. Спонтанный и индуцированный мутагенез Глава 1.4. Цитогенетические карты генов Глава 1.5. Типы наследования признаков Глава 1.6. Генетика популяций

Глава 1.7. Структура вещества наследственности – ДНК Глава 1.8. Центральная догма молекулярной генетики Глава 1.9. Структура и экспрессия генов эукариот Глава 1.10. Мутации генов Глава 1.11. Обратная генетика, генная инженерия

Глава 1.12. Генетические основы развития Глава 1.13. Структура генома эукариот, мобильная генетика Глава 1.14. Эпигенетическая изменчивость Глава 1.15. Геномика, проект «Геном человека»

Глава 1.16. Молекулярно-генетические основы эволюции

Часть II. МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНЕТИКА

Глава 2.1. Наследственные болезни, общая характеристика

2.1.1.Хромосомные болезни

2.1.2.Моногенные болезни

2.1.3.Мльтифакториальные болезни Глава 2.2. Методы медицинской генетики

2.2.1.Клинико-генеалогический метод

2.2.2.Близнецовый метод

2.2.3.Популяционный метод

2.2.4.Цитогенетический метод

2.2.5.Биохимический и иммунологический методы

2.2.6.Молекулярно-генетические методы

Глава 2.3. Хромосомные болезни 2.3.1. Трисомии

2.3.1.1.Синдром Дауна

2.3.1.2.Синдром Патау

2.3.1.3.Синдром Эдвардса

2.3.2. Аномалии половых хромосом

2.3.2.1.Болезнь Клейнфелтера

2.3.2.2.Болезнь Шерешевского-Тернера

2.3.3. Структурные аномалии хромосом

Глава 2.4. Менделирующие признаки человека

2.4.1. Наследование групп крови (системы АВ0, MN, Rh) Глава 2.5. Аутосомно-доминантные заболевания

2.5.1. Наследственные дисплазии соединительной ткани

2.5.1.1.Наследственные коллагенопатии

2.5.1.2.Болезнь Марфана 2.5.1.3.Нарушения морфогенеза соединительной ткани

2.5.2.Аутосомно-доминантные болезни нервной системы

2.5.2.1.Моторно-сенсорные полинейропатии

2.5.2.2.Боковой амиотрофический склероз

2.5.2.3.Наследственные факоматозы

Глава 2.6. Аутосомно-рецессивные заболевания

2.6.1. Муковисцидоз

2.6.2. Проксимальная спинальная амиотрофия

2.6.3. Наследственные болезни обмена

2.6.3.1. Фенилкетонурия

2.6.3.2. Галактоземия 2.6.3.3. Ганглиозидозы и сфинголипидозы 2.6.3.4. Мукополисахаридозы

2.6.3.5. Адреногенитальный синдром 2.6.3.6. Гепатолентикулярная дегенерация

Глава 2.7. Сцепленные с полом заболевания

2.7.1.Фосфатдиабет

2.7.2.Гемофилия А и В

2.7.3. Миодистрофия Дюшенна/Беккера 2.7.4. Отцовский или голандрический тип наследования

Глава 2. 8. Нетрадиционные типы наследования 2.8.1. Митохондриальный или цитоплазматический тип

наследования 2.8.2. Однородительские дисомии и геномный импринтинг 2.8.3. Болезни экспансии

2.8.3.1. Синдром Мартина-Белл

2.8.3.2. Мтоническая дистрофия

2.8.3.3. Хорея Гентингтона

2.8.4. Миодистрофия Ландузи-Дежерина как пример заболевания, обусловленного нарушением эпигенетической регуляции экспрессии генов

Глава 2.9. Примеры биохимической классификации моногенных заболеваний

2.9.1. Наследственные болезни мышц 2.9.2. Наследственные кардиомиопатии

Глава 2.10. Генетический контроль предрасположенности к мультифакториальной патологии

2.10.1.Генетические факторы риска сердечно-сосудистой патологии

2.10.2.Другие примеры использования генетических факторов риска

2.10.3.Роль генов детоксикации в формировании наследственной предрасположенности

2.10.4.Проблемы генетической паспортизации

Глава 2.11. Фармакогенетика Глава 2.12. Генетические основы канцерогенеза

2.12.1.«Рак – болезнь генов»

2.12.2.Наследственные опухолевые синдромы Глава 2.13. Врожденные пороки развития

2.13.1.Дефекты заращения нервной трубки

2.13.2.Врожденные пороки сердца

2.13.3.Расщелина губы и/или неба

Глава 2.14. Медико-генетическое консультирование 2.14.1. Цели и задачи медико-генетического

консультирования

2.14.2.Кто «виноват» в рождении детей с моногенной патологией?

2.14.3.Показания для направления на консультацию к врачуГенетику

2.14.4.Организация медико-генетической службы

Глава 2.15. Скрининрующие программы как профилактика врожденной и наследственной патологии

2.15.1.Биохимический скрининг маркерных белков при беременности

2.15.2.Неонатальный биохимический скрининг

Глава 2.16. Пренатальная диагностика наследственных заболеваний

2.16.1.Пренатальная диагностика хромосомных болезней

2.16.2.Пренатальная диагностика моногенных болезней Глава 2.17. Молекулярная диагностика инфекций Глава 2.18. Геномная дактилоскопия

Глава 2.19. Лечение больных с врожденной и наследственной патологией

2.19.1. Симптоматическое лечение

2.19.2. Патогенетическое лечение

2.19.3. Этиологическое лечение

Заключение Рекомендуемая литература

Предисловие

Введение. Предмет медицинской генетики

Фундаментальными свойствами живой природы, отличающими ее от неживой материи, являются способность к размножению и наследственность,

которая заключается в том, что особи любых видов рождают только себе подобных и их потомки, в среднем, более похожи на своих родственников,

чем на других представителей того же вида. При этом каждый вид характеризуется определенным уровнем изменчивости, и даже братья и сестры никогда не являются точными копиями друг друга и своих родителей.

Генетика это наука о наследственности и изменчивости. Как любая другая биологическая наука генетика состоит из общих и частных разделов. Общие разделы посвящены изучению материальных основ наследственности и изменчивости. Они включают анализ вещества наследственности, которым являются молекулы ДНК, изучение способа упаковки генетического материала в клетках и его наследственной передачи в ряду поколений,

структуры и мутаций генов, типов наследования, основных информационных процессов, а также многие другие вопросы. В частных разделах генетики исследуются особенности проявления общих теоретических закономерностей у разных видов организмов. Среди них ведущее положение занимает генетика человека. Те ее направления, которые посвящены патологии человека, являются предметом медицинской генетики.

Основной целью медицинской генетики является изучение роли генетических составляющих в этиологии и патогенезе различных заболеваний человека. Эти болезни делятся на два класса: собственно

наследственные болезни, куда входят хромосомные и генные заболевания, и

болезни с наследственной предрасположенностью, которые называют

мультифакториальными заболеваниями. Хромосомными являются болезни,

вызванные нарушением числа, либо структуры хромосом. Генные болезни обусловлены присутствием мутаций в генах. Моногеннными называются болезни, обусловленные присутствием мутаций в одном гене. В этиологии мультифакториальных заболеваний наряду с действием неблагоприятных внешних факторов существенное влияние оказывают состояния не одного, а

многих генов. Количество этих генов, формирующих наследственную предрасположенность к заболеванию, иногда исчисляется десятками или даже сотнями. К мультифакториальным относятся большинство наиболее распространенных болезней человека.

В задачи медицинской генетики входят: диагностика наследственных заболеваний, анализ их распространенности в различных популяциях и этнических группах, медико-генетическое консультирование семей больных,

профилактика наследственных заболеваний на базе пренатальной

(дородовой) диагностики, изучение молекулярно-генетических основ этиологии и патогенеза наследственных заболеваний, выявление генетических факторов риска мультифакториальных заболеваний.

В последние десятилетия произошел огромный прогресс в области медицинской генетики, значение которого трудно переоценить. Основой для этого послужили успехи в области молекулярной генетики, завершившиеся расшифровкой структуры генома человека, идентификацией всех его генов и определением молекулярной природы подавляющего большинства белков. В

настоящее время происходит интенсивное изучение ассоциации различных генов человека с моногенными и мультифакториальными заболеваниями.

Эти исследования являются основой для планомерной разработки совместно со специалистами различных медицинских профилей новых патогенетических и этиологических методов лечения наследственных

заболеваний, а также предупреждения развития тех заболеваний, к которым у человека имеется генетическая склонность.

Для эффективного внедрения в клинику этих достижений необходимо,

чтобы каждый врач был знаком с основными законами наследственной передачи признаков и владел навыками их практического использования.

Выявить больного с наследственной патологией, определить ее характер и направить в соответствующий центр для оказания специализированной медико-генетической помощи – вот те минимальные задачи, которые должен решать любой врач и, в первую очередь, участковый.

Часть I. ОБЩАЯ ГЕНЕТИКА

Глава 1.1. Законы Менделя

Основополагающие законы наследования были открыты во второй половине XIX века Грегором Менделем. В своих знаменитых опытах Г.

Мендель скрещивал различные сорта гороха, различающиеся по семи стабильно наследующимся морфологическим признакам, касающимся,

главным образом, формы и окраски семян или цветков. Затем на протяжении нескольких последующих поколений он проводил количественный учет растений отдельно по каждому из этих признаков. Оказалось, что при этих условиях все гибриды первого поколения были похожи на одного из родителей. Эти наблюдения явились основой для формулировки первого закона Менделя – закона единообразия гибридов первого поколения. Тот признак, который проявлялся у гибридов первого поколения, был назван Менделем доминантным, а не проявляющийся признак – рецессивным. В

дальнейшем было показано, что этот закон относится к разряду общебиологических закономерностей. Следует подчеркнуть, что доминирование не всегда является абсолютным. Так, например, при скрещивании растений с красными и белыми цветками у гибридов может наблюдаться промежуточная, розовая окраска цветков. В этом случае говорят о неполном доминировании.

Во втором поколении при самоопылении гибридов появлялись растения, как с доминантным, так и с рецессивным признаком, в среднем, в

соотношении 3:1. Это второй закон Менделя – закон расщепления признаков.

Конечно, этот закон реализуется только на больших выборках. Если мы ограничимся анализом одной семьи, то есть исследуем потомство от скрещивания всего лишь двух гибридных растений, то соотношения по признакам могут оказаться любыми. Для получения этой закономерности необходимо суммировать результаты анализа потомства от скрещивания многих гибридных растений, причем, чем больше будет исследованная выборка потомков, тем точнее реальное распределение по признакам будет приближаться к гипотетическому значению 3:1. Для обнаружения этой закономерности Менделю пришлось подсчитать более 10 000 растений.

Заметим, что при неполном доминировании во втором поколении будут наблюдаться все формы растений: первая родительская, гибридная и вторая родительская, в среднем, в соотношении 1:2:1 соответственно.

Наблюдаемые закономерности позволили Менделю высказать гипотезу о существовании двух дискретных наследственных факторов, ответственных за каждый из исследуемых признаков – доминантного, который он обозначил заглавной буквой А, и рецессивного – а. Следующее предположение заключалось в том, что только один из этих факторов попадает в зародышевые клетки или гаметы. Таким образом, исходные сорта гороха несут два одинаковых наследственных фактора, ответственных за изучаемый признак, в одном сорте это АА, а в другом – аа. Гибриды первого поколения несут оба наследственных фактора – Аа. И хотя рецессивный фактор (а) не проявляется в присутствии доминантного (А), но он и не исчезает. Эти два дискретных наследственных фактора не сливаются друг с другом, и каждый из них с равной вероятностью попадает в различные половые клетки. Более того, гаметы как с доминантным, так и с рецессивным факторами в равной степени участвуют в оплодотворении. В результате образуются растения трех типов: АА, Аа и аа в соотношении 1:2:1.

В дальнейшем для упрощения понимания закономерностей наследования было предложено использовать так называемую решетку Пеннета – таблицу, в первой строке и первом столбце которой записываются типы женских и мужских гамет, а на их пересечении типы образующихся

потомков. В нашем случае эта таблица выглядит следующим образом:

Таблица 1.

Решетка Пеннета для моногибридного скрещивания

Гаметы ♀/♂		А			а
А		АА			Аа
а		Аа			аа

Поскольку рецессивный наследственный фактор не проявляется в присутствии доминантного, растения АА и Аа внешне будут идентичны друг другу, и по признаку будет наблюдаться расщепление 3:1. Эти гениальные предположения Менделя получили название гипотезы чистоты гамет.

Заметим, что при неполном доминировании распределения по наследственным факторам и по признакам совпадают.

При описании схемы скрещивания в генетике используются следующие обозначения: родители – P (от лат. parentes – родитель), особи женского пола – ♀ (зеркало Венеры), мужского – ♂ (щит и копье Марса),

скрещивание – х (знак умножения), потомство от скрещивания – F (от лат. filialis – сыновний) с цифровым индексом: F1 – первое поколение, F2 – второе и т.д. Черточка, стоящая справа от доминантного фактора, (A_) означает то,

что на этом месте может стоять как доминантный, так и рецессивный фактор.

Запишем в этих обозначениях схему скрещивания, использованную Менделем, которая в дальнейшем получила название моногибридного

скрещивания – рис. 1.
P:	AA	х	aa
гаметы:	А		а
потомство F1:		Aa

F1:		Aa	х	Aa
гаметы:		А а		А а
F2,	расщепление по генотипу:
		1AA : 2Aa		: 1 aa
F2,	расщепление по признаку:
		3A_ :	1aa

Рисунок 1. Моногибридное скрещивание Подчеркнем еще раз, что успех этих опытов в значительной степени

был предопределен тем, что Мендель вел количественный учет растений отдельно по каждому из признаков. Подобная методология скрещиваний,

позволяющая получать и анализировать гибриды называется

гибридологическим анализом. При изучении наследования сразу двух признаков (дигибридное скрещивание), оказывалось, что каждый из них ведет себя независимо друг от друга. Это приводит к тому, что во втором поколении наблюдаются 4 группы растений: имеющих одновременно оба доминантных признака или только один из двух доминантных признаков или не имеющих доминантных признаков, в соотношении 9:3:3:1. Разберем эту ситуацию более подробно. Обозначим доминантный и рецессивный наследственный фактор, ответственный за первый признак — А и а, а за

второй признак –		B и b,	соответственно. В этих обозначениях исходные
родительские сорта будут			иметь	наследственные факторы ААBB и aabb, а
схема дигибридного скрещивания будет выглядеть следующим образом:
P:	AABB		х	aabb
гаметы:	АB			аb
потомство F1:			AaBb
F1:	AaBb		х	AaBb
гаметы:	АB Ab	аB ab	АB Ab аB ab

F2, расщепление по генотипу:

1AABB : 2 AABb : 2AaBB : 4AaBb : 1AAbb : 2Aabb : 1aaBB : 2aaBb :1aabb

F2, расщепление по признакам:

9A_ B_ : 3A_ bb : 3aa B_ : 1aabb

Рисунок 2. Дигибридное скрещивание

Таблица 2.

Решетка Пеннета для дигибридного скрещивания

Гаметы ♀/♂

AB

Ab

aB

ab

AB

AABB

AABb

AaBB

AaBb

Ab

AABb

AAbb

AaBb

Aabb

aB

AaBB

AaBb

aaBB

aaBb

ab

AaBb

Aabb

aaBb

aabb

При тригибридном скрещивании количество различных комбинаций признаков в F2 увеличивается до 8, и соотношения становятся еще более сложными (27:9:9:9:3:3:3:1). Попробуйте нарисовать схему тригибридного скрещивания и решетку Пеннета для этой схемы, и Вы убедитесь в

справедливости этих соотношений.

На основании своих наблюдений Мендель сформулировал закон независимого комбинирования признаков. Однако этот закон оказался справедлив далеко не для всех признаков, определяемых одним наследственным фактором. Он соблюдается только в том случае, если эти наследственные факторы находятся в разных хромосомах. Но об этом речь

будет идти позднее.

К сожалению, работы Грегора Менделя остались незамеченными современниками, и его законы были независимо вновь открыты в самом начале XX века тремя исследователями, один из которых В. Иогансен предложил назвать постулированные Менделем наследственные факторы

генами, совокупность генов – генотипом, а совокупность признаков

организма – фенотипом. Варианты наследственных факторов или

Генетика (Медицинский институт, аспирантура, очная)

О профессии

Генетика, предметом которой являются наследственность и изменчивость организмов, представляет собой молодую и динамично развивающуюся науку, которая разделяется на большое число специализированных дисциплин (цитогенетика, фармакогенетика, популяционная генетика, генетика вирусов, генетика человека и др.). Вместе с тем, все специализированные генетические дисциплины базируются на фундаментальной научной информации, которая накапливается и систематизируется в рамках общей генетики. В последнее время чрезвычайно активно развивается медицинская генетика, чьи задачи заключаются в изучении генетических основ наследственной патологии человека. Особенностью современной генетики является широкое использование молекулярно-генетических, биохимических, цитогенетических и других новейших методов исследования. Это привело к значительному прогрессу в знаниях о наследственности и изменчивости человека, в том числе о молекулярных механизмах генетических процессов, лежащих в основе формирования нормальных и патологических признаков. Научные достижения в этой области открывают принципиально новые возможности для решения ряда практических задач, связанных, прежде всего, с ранней диагностикой, профилактикой и лечением наследственных болезней.

Учебный процесс

Обучение длится 4 года, трудоемкость программы составляет 240 зачетных единиц. Уже на первом курсе происходит интенсивное погружение в профессию. Аспиранты на современном уровне изучают строение и функции нуклеиновых кислот, экспрессию генетической информации и ее регуляцию, закономерности наследования генов и их цитологические основы, методы генетики человека, наследственные болезни человека и принципы их диагностики, профилактики и лечения; приобретают компетенции, необходимые как для проведения научных исследований, так и для осуществления учебно-воспитательного процесса в образовательных организациях высшего образования.
В учебный план включены дисциплины базовой части (Иностранный язык, История и философия науки) и дисциплины вариативной части, к которым относятся Педагогика высшей школы, Методология научных исследований, Общая генетика, а также дисциплины по выбору (Методы изучения наследственности человека, Наследственные болезни человека, Молекулярные основы наследственности, Иностранный язык в сфере профессиональной коммуникации, Русский язык в сфере профессиональной коммуникации).

Практика

Научно-исследовательская практика аспирантов проходит в межкафедральной учебно-научной лаборатории молекулярно-биологических методов исследования. В рамках педагогической практики предусмотрено проведение занятий по дисциплине «Биология» у студентов 1 курса медицинского института РУДН.

Карьера

Успешно освоив образовательную программу, Вы сможете проводить генетические исследования фундаментального и прикладного характера, разрабатывать и совершенствовать необходимые для этого лабораторные методы.
В сфере преподавательской деятельности Вы научитесь разрабатывать учебные курсы, в том числе на основе результатов проведенных теоретических и эмпирических исследований; готовить методические материалы и учебники; преподавать генетические дисциплины в высших учебных заведениях; руководить научно-исследовательской работой студентов.

Медицинская генетика в России

А. М. Полищук,
доктор медицинских наук
«Химия и жизнь» №2, 2010

А. М. Полищук закончил 1-й Ленинградский медицинский институт им. И. П. Павлова в 1963 году — как раз тогда, когда генетика в нашей стране выходила из подполья. Учился в аспирантуре в лаборатории радиационной генетики Института цитологии и генетики СО АН СССР в Новосибирске под руководством Ю. Я. Керкиса. С 1978 по 1982 год заведовал кафедрой биологии и генетики Томского мединститута, откуда ушел под давлением КГБ (подозревался в хранении и распространении антисоветской литературы). Непосредственный участник восстановления медицинской генетики. Статья дана в сокращении.

Возникновение и расцвет

И в России, и на Западе медицинская генетика возникла из евгеники — той ее части, которая ставила своей задачей предотвращать рождение людей с физическими и психическими наследственными дефектами. В начале 30-х годов прошлого века эта наука достигла пика популярности в обществе, отражаясь даже в законодательстве многих стран мира. Однако в конце 30–40-х годов в нацистской Германии ее подменили доктриной об избранности арийской расы, чистота которой должна была поддерживаться благодаря расовой политике. В рамках этой политики проводились насильственная стерилизация и массовые умерщвления людей, считавшихся малоценными. Все это дискредитировало евгенику, и само ее название долго ассоциировалось с понятиями «нацизм» и «фашизм». Вместе с тем стремительное развитие генетики показало реальную возможность диагностики и профилактики наследственных заболеваний человека, что, по существу, и было целью той части евгеники, которая называлась негативной. Поэтому она продолжала развиваться в качестве самостоятельного направления, но уже под названием «медицинская генетика». <…>

В России начало евгенического движения следует датировать 1865 годом. Тогда в журнале «Русская старина» были опубликованы очерки В. М. Флоринского, в которых развивались идеи усовершенствования человеческой породы. Евгеника в России и СССР была особо тесно связана с генетикой, поскольку ими занимались одни и те же люди. Они были созданы в основном усилиями двух молодых талантливых ученых: Н. К. Кольцова в Москве и Ю. А. Филипченко в Петрограде. В 1920 году Н. К. Кольцов создал в Москве Русское евгеническое общество, при котором издавался «Русский евгенический журнал». В 1920 году в Институте экспериментальной биологии (ИЭБ), руководимом Н. К. Кольцовым, был организован евгенический отдел, развернувший исследования по генетике человека. Здесь были начаты первые работы по наследованию групп крови, содержанию каталазы в крови, наследованию цвета волос и глаз, изменчивости и наследственности сложных признаков с использованием близнецового метода. При отделе работала первая медико-генетическая консультация.

В 1921 году Ю. А. Филипченко организовал в Петрограде Бюро по евгенике, где, в частности, было выполнено уникальное популяционно-генетическое исследование творческих способностей человека. <…> Подавляющее большинство ученых, внесших решающий вклад в формирование и развитие медицинской генетики в нашей стране, были либо учениками Кольцова и Филипченко, либо учениками их учеников.

Официальной датой возникновения медицинской генетики как самостоятельной дисциплины в России следует считать 15 мая 1934 года. В этот день на конференции в Медико-биологическом институте его директор Григорий Соломонович Левит выступил с докладом «Антропогенетика и медицина», в котором определил новую дисциплину. Историк генетики В. В. Бабков так охарактеризовал его значение: «Левит стал основоположником российской медицинской генетики, сформулировал ее ключевые принципы и идеи». <…> В 1928 году он организовал Кабинет наследственности и конституции человека при Медико-биологическом институте в Москве. В 1930 году Кабинет был расширен до Генетического отделения Медико-биологического института, а Левит назначен его директором, что позволило ему переориентировать тематику института на генетику человека. В 1935 году учреждение было переименовано в Научно-исследовательский медико-генетический институт имени М. Горького. Работы здесь развивались по трем направлениям: клинико-генетическому, близнецовому и цитологическому. <…>

В области клинико-генетических исследований важное значение имели работы С. Н. Давиденкова о генетике бокового амиотрофического склероза и Левита о различных проявлениях большинства патологических мутантных генов человека. Принципиально важным было замечательное теоретическое исследование В. П. Эфроимсона, выполненное в 1932 году, о равновесии между накоплением мутаций и интенсивностью отбора. В ней ученый оценил темп мутационного процесса у человека. Успешно развивалось «близнецовое» направление. К 1933 году исследованием были охвачены 600 пар близнецов. Были получены интересные результаты о роли наследственности и среды в физиологии и патологии ребенка, в изменчивости электрокардиограммы, в проявлении некоторых психических признаков. В цитологическом направлении нужно назвать исследования, проводимые в лабораториях П. И. Живаго и А. Г. Андреса в Институте экспериментальной биологии и в Медико-генетическом институте. К ним относятся разработка Г. К. Хрущевым и Е. А. Берлиным метода культивирования клеток крови для кариологического анализа (анализа количества и внешнего строения хромосом. — Примеч. ред.), а также проведенный впервые в мире А. Г. Андресом и М. С. Навашиным анализ тонкого морфологического строения хромосомы человека. Подчеркивая значение этих работ, президент III Международного конгресса по генетике человека Л. С. Пенроз в 1966 году сказал: «Если бы эти лаборатории в СССР продолжали работать, то большинство открытий по кариотипу человека, сделанных в течение последних девяти лет, могли бы появиться на двадцать лет раньше».

В Ленинграде медицинская генетика развивалась благодаря деятельности крупного специалиста по нервным болезням С. Н. Давиденкова. <…> Он начал заниматься генетикой нервных болезней в Москве в институте, возглавляемом Левитом. В 1932 году переехал в Ленинград, где возглавил кафедру нервных болезней в Ленинградском институте усовершенствования врачей. Здесь были выполнены замечательные работы по генетике болезней нервной системы. <…>

К концу 30-х годов медицинская генетика в Советском Союзе и в теории, и в практике соответствовала самым высоким мировым стандартам. Но как раз в тот момент, когда был подготовлен ее мощный взлет, развитие медицинской генетики в СССР было резко оборвано.<…>

Разгром

Пик разгрома медицинской генетики пришелся на годы Большого террора (1936–1939), но начался он гораздо раньше, а «недобитых» в этот период репрессировали после августовской 1948 года сессии ВАСХНиЛ (Всесоюзной академии сельскохозяйственных наук им. В. И. Ленина). <…>

Трагически сложилась судьба многих генетиков, в том числе и С. Г. Левита. В 1936 году он был исключен из партии «за связь с врагами народа, за протаскивание враждебных теорий в трудах института и за меньшевистствующий идеализм». В вину ему поставили и то, что он подписался под письмом в защиту арестованного друга, и за попытку на собрании критиковать работу Т. Д. Лысенко. В 1937 году Левита уволили с должности директора, а институт закрыли. Спустя год он был арестован, приговорен к смертной казни за терроризм и шпионаж и расстрелян. Левит был реабилитирован посмертно в 1956 году. <…> Трижды арестовывали В. П. Эфроимсона. Гонениям подвергся и профессор С. Н. Давиденков. Его научные работы по медицинской генетике не публиковались, а доцентура в Ленинградском институте усовершенствования врачей была закрыта. Кольцов был уволен с должности директора ИЭБ и в том же 1940 году умер от инфаркта миокарда. <…>

Во время Великой Отечественной войны репрессии заметно утихли, но вновь усилились уже в 1946 году. <…> Разгром произошел в августе 1948 года на сессии ВАСХНиЛ, где генетику заклеймили как «буржуазную лженауку». Августовская сессия ВАСХНиЛ послужила сигналом к широкомасштабной кампании по разгрому «идеалистической» биологии в Советском Союзе. Уже 24–26 августа состоялось расширенное заседание Президиума Академии наук СССР, 4 сентября — президиума Академии педагогических наук РСФСР, 9–10 сентября — Президиума Академии медицинских наук СССР. На этом заседании Президиум АМН СССР официально запретил медицинскую генетику. Все эти заседания высших научных учреждений страны были посвящены внедрению «единственно верной», «материалистической» «мичуринской» биологии. Последовали оргвыводы: увольнения генетиков и замена их сторонниками Лысенко (были уволены или понижены в должности около 3 тысяч ученых), пересмотр программ по биологии и генетике в университетах, медицинских и педагогических вузах, научных планов в научно-исследовательских институтах и лабораториях. На генетику был наложен официальный запрет, который держался до 1964 года. <…>

Восстановление

<…> Развитие ядерной энергетики, ядерного оружия и космонавтики, несмотря на запреты, стимулировало возобновление работ по цитогенетике человека. Для этих отраслей требовалось уметь оценивать опасность радиоактивного излучения и разработать методы радиационной защиты. В 1956 году в Москве в Институте биологической физики АН была организована лаборатория радиационной генетики. Заведующим был приглашен известный генетик Н. П. Дубинин, который после сессии ВАСХНиЛ работал орнитологом на Урале. Он собрал генетиков, отлученных от науки после погрома 1948 года, и развернул работы по радиационному мутагенезу. В лаборатории проводилось также цитогенетическое обследование испытателей, готовящихся стать космонавтами.

В 1957 году в составе Сибирского отделения АН СССР (Новосибирск) был организован Институт цитологии и генетики (ИЦиГ СО АН СССР). Директором был назначен Н. П. Дубинин. Как и в Москве, он начал собирать изгнанных из науки генетиков. В частности, на должность заведующего лабораторией радиационной генетики он пригласил ученика Ю. А. Филипченко — Ю. Я. Керкиса. Керкис и его сотрудники одними из первых в мире использовали в качестве объекта исследования культуру клеток человека для определения дозы радиоактивного излучения, удваивающей частоту спонтанных мутаций, и показали, что эта доза равна 8–10 рентгенам.

В 1958 году в Президиуме АМН СССР была создана комиссия по медицинской генетике, но во главе ее был поставлен верный лысенковец, академик АМН Н. Н. Жуков-Вережников. Микробиолог по специальности, он, мягко говоря, не был крупным специалистом в области медицинской генетики. Поэтому руководимая им комиссия включила в Государственный план развития науки на ближайшую пятилетку проблему «Исправление испорченной генетической информации у человека путем направленного воздействия на испорченные гены». Только вопиющим невежеством можно было объяснить такую постановку проблемы: в те годы не существовало даже подходов для ее решения. Специалистам потребовалось много усилий, чтобы убедить Президиум АМН распустить эту комиссию. Вместо нее, во многом благодаря стараниям А. А. Прокофьевой-Бельговской и В. П. Эфроимсона, был создан Совет по общей и медицинской генетике под председательством академика АМН И. Д. Тимакова. <…>

Еще в 1958 году С. Н. Давиденков организовал в Ленинграде Медико-генетическую лабораторию АМН, которую после его смерти в 1961 году возглавила Е. Ф. Давиденкова. Другим центром возрождения медицинской генетики в Ленинграде стал Институт экспериментальной медицины АМН СССР. В начале 60-х годов в этом институте С. А. Нейфах организовал одну из первых в стране лабораторию биохимической генетики, где начались исследования молекулярных механизмов наследственных болезней. <…> С. А. Нейфах одним из первых в мире высказал мысль о роли мутаций митохондриальной ДНК в этиологии болезней, наследуемых по материнской линии. В результате изучения биохимических и генетических аспектов фенил-пировиноградной олигофрении его ученик А. М. Шапошников в 1967 году создал первую в стране диету для лечения фенилкетонурии. <…>

Наиболее бурно возрождение медицинской генетики происходило в Москве, во многом благодаря активности А. А. Прокофьевой-Бельговской. В конце 50 — начале 60-х годов за рубежом появились публикации о новых методах анализа хромосом, позволяющих оценить их роль в патологии человека, а также тестировать мутагенную активность различных воздействий на культивируемых клетках человека. Кадров, владеющих такими методиками, в СССР практически не было. А. А. Прокофьева-Бельговская внесла огромный вклад в ликвидацию этого пробела. Она возглавила две лаборатории: лабораторию кариологии в Институте молекулярной биологии АН СССР (1962) и Лабораторию цитогенетики в Институте морфологии человека АМН СССР (1964). На базе первой исследовали хромосомы испытателей, готовящихся к космическим полетам. Здесь же В. М. Гиндилис оценил количественные параметры хромосом человека и получил количественные характеристики индивидуальных хромосом. До появления методов дифференциального окрашивания это был единственный метод идентификации хромосом человека. Другой сотрудник этой лаборатории, А. В. Микельсаар, впервые в СССР исследовал корреляцию генотип-фенотип у человека, изучая хромосомы детей с множественными пороками развития. Там же Прокофьева-Бельговская организовала курсы для обучения врачей методам цитогенетики. За 1962–1964 годы эти курсы прошли десятки врачей.

Примерно в то же время похожие курсы проводила в Ленинграде профессор Е. Ф. Давиденкова. Они были частью программы по созданию медико-генетической службы, над проектом которой работали А. А. Прокофьева-Бельговская, Е. Е. Погосянц, В. П. Эфроимсон при участии молодых коллег, К. Н. Гринберга и В. М. Гиндилиса.

Во второй лаборатории, куда в качестве заместителя Прокофьевой-Бельговской был приглашен молодой генетик из Института атомной энергии АН К. Н. Гринберг, развернулись интенсивные исследования в области хромосомной природы ряда заболеваний и дефектов развития у человека. В этой лаборатории были воспитаны первые специалисты по медицинской генетике, ставшие известными и учившие уже следующее поколение: О. Подугольникова, В. Кухаренко, А. Ревазов, Г. Мирзаянц, Ю. Селезнев, А. Синкус, А. Кулиев. В 1963 году в Институте экспериментальной и клинической онкологии АМН была организована Лаборатория цитогенетики, в которой под руководством Е. Е. Погосянц началось изучение цитогенетики лейкемий у человека. Как видно, восстановление медицинской генетики начиналось преимущественно с цитогенетики человека и происходило в рамках АМН и АН.

Началом восстановления «клинической части» медицинской генетики можно считать выход в свет книги В. П. Эфроимсона «Введение в медицинскую генетику», опубликованной в 1964 году после трехлетней борьбы с лысенковцами. Эта книга долгие годы была единственным пособием по медицинской генетике для тысяч отечественных врачей.

В сентябре 1965 года на заседании Президиума АН СССР впервые открыто подверглись критике методы и результаты деятельности Лысенко, и запрет на генетику был снят. <…>

В 1967 году Г. И. Лазюк организовал в Минске Лабораторию тератологии и медицинской генетики, которая со временем стала крупнейшим в стране учреждением по изучению причин возникновения и эпидемиологии врожденных пороков развития. Позже лаборатория была преобразована в филиал ИМГ АМН СССР. В том же году В. П. Эфроимсон стал заведовать отделом генетики Московского института психиатрии РСФСР. Здесь развернулись работы по генетике олигофрении, психозов, эпилепсии, шизофрении. В 1969 году под руководством и при авторском участии Прокофьевой-Бельговской вышла книга «Основы цитогенетики человека», ставшая важным учебным пособием для врачей и биологов, занявшихся медицинской генетикой.<…>

Важнейшим событием стало создание в 1969 году Института медицинской генетики (ИМГ). Директором института был назначен Н. П. Бочков, ученик выдающегося генетика Н. В. Тимофеева-Ресовского. Этот институт стал ведущим и координирующим учреждением страны по медицинской генетике. В него перешла Лаборатория цитогенетики человека, руководимая А. А. Прокофьевой-Бельговской, были организованы Лаборатория общей цитогенетики под руководством А. Ф. Захарова и Лаборатория мутагенеза и популяционной цитогенетики, возглавляемая Н. П. Бочковым. Кроме того, в состав института влился коллектив Московской медико-генетической консультации, который стал основой Лаборатории клинической генетики.

В первые годы существования института тон задавали цитогенетические лаборатории. В Лаборатории цитогенетики человека исследования сосредоточились на трех направлениях: феногенетика хромосомных аномалий на клеточном уровне, цитогенетика спонтанных абортов и полиморфизм гетерохроматиновых районов хромосом человека (разнообразие уплотненных, малоактивных участков хромосом. — Примеч. ред.). В ходе этих исследований в институте был создан музей культивируемых клеток человека с хромосомными и генными мутациями, который вскоре стал основой Всесоюзной коллекции клеточных культур. Другое направление — популяционную цитогенетику человека — возглавил Н. П. Бочков. Еще в 1967 году он организовал в Москве обследование новорожденных, чтобы определить частоту аномалий Х-хромосомы. Эти исследования были продолжены в ИМГ. К началу 70-х годов было цитогенетически обследовано 6000 новорожденных и оценены частоты различных хромосомных аномалий, а также частоты возникновения хромосомных и генных мутаций у человека. <…> В институте начались разработка скрининг-программ для ранней диагностики и профилактики наследственных заболеваний, исследования по генетике развития (В. И. Иванов) и популяционной генетике наследственных болезней (Е. К. Гинтер).

В 1982 году по инициативе Н. П. Бочкова был открыт Томский отдел ИМГ. Он включал Лабораторию популяционной генетики человека и Лабораторию цитогенетики. Руководителем отдела был приглашен молодой энергичный доцент Новосибирского мединститута В. П. Пузырев. Через пять лет он возглавил НИИ Медицинской генетики в составе Томского научного центра Сибирского отделения АМН, организованного на базе отдела. <…>

Медицинская генетика в Ленинграде получила новый импульс к развитию в 1987 году, когда в Институт акушерства и гинекологии АМН им. Д. О. Отта пришел В. С. Баранов, создавший и возглавивший Лабораторию пренатальной диагностики наследственных и врожденных болезней. Там быстро наладили все известные в то время методы инвазивной пренатальной диагностики наследственных болезней. Одним из основных направлений стала разработка научных основ генодиагностики распространенных наследственных болезней, в частности методы ДНК-диагностики муковисцидоза и миодистрофии Дюшенна. Уже через два года на базе лаборатории был открыт Федеральный центр по пренатальной диагностике муковисцидоза.

С появлением в стране отечественных компьютеров начал развиваться генетический анализ количественных признаков человека, главным образом мультифакториальных болезней (определяемых совокупностью многих факторов, как наследственных, так и факторов среды. — Примеч. ред.). В 1969 году В. М. Гиндилис возглавил группу медицинской генетики в Институте психиатрии АМН СССР. Здесь он и его сотрудники разработали метод многомерного анализа генетически детерминированных признаков, позволяющий количественно оценить вклад генетических факторов в развитие эндогенных психозов. Чуть позже, в середине 80-х годов, известный специалист в области генетического анализа количественных признаков Э. Х. Гинзбург из ИЦиГ СО АН обратился к изучению генетики мультифакториальных болезней. <…>

Из теоретических достижений следует отметить гипотезу М. Д. Голубовского о существовании у мужчин доминантной мутации, обусловливающей двойное (двумя сперматозоидами) оплодотворение яйцеклетки. Это может привести либо к триплоидии и последующему выкидышу, либо к пузырному заносу, либо к образованию химер. Гипотеза <…> предсказывала существование третьего, доселе неизвестного, типа близнецов — полуторазиготных, у которых материнские геномы одинаковы, а отцовские — разные. Спустя 20 лет такой тип близнецов был обнаружен в независимом исследовании.

Генетика — практике

Медленнее всего восстанавливалась медико-генетическая служба в системе практического здравоохранения. Одна из причин этого заключалась в ужасающей генетической необразованности врачей. Уже в те годы было известно, что в медико-генетическом консультировании нуждается не менее 8% населения. Для оказания им помощи необходимы широкая сеть медико-генетических консультаций и хорошая генетическая образованность врачей, так как именно они направляют пациентов на консультацию. Однако после почти 30-летнего запрета генетики о компетентности медиков в этом вопросе говорить не приходилось. Так, в конце 60-х годов в Московском детском психоневрологическом диспансере собрался консилиум для обсуждения тяжело больного ребенка со множественными пороками развития. Присутствующий цитогенетик сообщила, что у ребенка обнаружена делеция короткого плеча хромосомы 18. На это одна из врачей заметила: «Ну, знаете, делеция делецией, но не надо забывать, что ребенок перенес операцию по поводу грыжи под общим наркозом». <…>

Результаты опроса, проведенного в 1978 году в двух районах Москвы, можно считать типичными для того времени: из 530 врачей на вопросы по медицинской генетике ответили только два. Лишь в конце 80 — начале 90-х годов стали создаваться профильные кафедры в медицинских вузах. В 1988 году Н. П. Бочков организовал кафедру медицинской генетики в 1-м Московском медицинском институте. В 1989 году Е. И. Шварц создал аналогичную кафедру в Ленинградском педиатрическом институте в составе научно-учебного комплекса, включающего Лабораторию молекулярной генетики человека ЛИЯФ АН СССР. Студентов обучали не только общей медицинской генетике и частным разделам молекулярной медицины, но и практическим методам ДНК-диагностики. Позднее кафедры медицинской генетики стали возникать в других медицинских институтах. <…>

Первые медико-генетические консультации возникали по инициативе и под патронажем академических учреждений. Так, специалистов по медицинской цитогенетике стали готовить в начале 60-х годов на базе лабораторий в Москве под руководством А. А. Прокофьевой-Бельговской и в Ленинграде под руководством Е. Ф. Давиденковой. В 1964 году Ю. Я. Керкис в Новосибирске (ИЦиГ СО АН) организовал один из первых в стране практикумов по кариологии человека, где врачей Сибири и Дальнего Востока обучали метафазному анализу хромосом. Он же инициировал создание в Новосибирске Медико-генетической консультации (МГК) и приложил много усилий для ее становления, в частности для организации цитогенетической лаборатории при МГК. <…>

В апреле 1967 года был издан приказ министра здравоохранения СССР о медико-генетической помощи населению. Первые консультации появились в Москве при детском психоневрологическом диспансере № 6 и в Ленинграде, на базе 11-й детской поликлиники. Затем возникли консультативные кабинеты по медицинской генетике при республиканских, краевых и областных больницах. К 1979 году в стране работало 45 таких кабинетов, однако этого не хватало, и было создано три медико-генетических центра. <…> За последующие пять лет число консультативных кабинетов достигло 85. В Москве, Ленинграде, в Белорусской и Литовской ССР была внедрена массовая диагностика фенилкетонурии у новорожденных, организовано их лечение и диспансеризация. Более 700 врачей, включая врачей-лаборантов, прошли подготовку по медицинской генетике на кафедре Института усовершенствования врачей МЗСССР. <…>

Очевидный прогресс все же не соответствовал нуждам практического здравоохранения. <…> Методы пренатальной диагностики наследственных болезней с помощью амниоцентеза и биопсии ворсин хориона проводились только в отдельных НИИ и так и не были внедрены в широкую практику здравоохранения. В стране не была создана система организации помощи больным с наследственными заболеваниями и их семьям. Поэтому прежние медико-генетические центры были упразднены, а вместо них образованы республиканские и межобластные медико-генетические центры. <…> Ко времени распада СССР в стране действовало 85 медико-генетических консультаций и кабинетов, включая 10 межобластных. В семи медицинских вузах организованы кафедры медицинской генетики. Широко использовался ультразвуковой скрининг беременных, начато обследование новорожденных на врожденный гипотиреоидоз.

Отставание и новые препятствия

Несмотря на успехи, медицинская генетика в СССР к концу XX века все же сильно отставала от западной. В 1964–1995 годах наука там шагнула далеко вперед. К средине 90-х годов были картированы гены шестидесяти новых болезней человека, идентифицированы гены предрасположенности к раку молочной железы у женщин, разработаны и внедрены в практику методы флуоресцентной гибридизации in situ. <..> Советская медицинская генетика не заняла того места в мировой науке, на котором она находилась в 30-е годы, и в этом смысле она так и не восстановилась после разгрома. Основными причинами были недостаточная материальная поддержка, волюнтаристский характер распределения средств и неудовлетворительная подготовка кадров в вузах. <..> Инакомыслие подавлялось, не всегда можно было опубликовать работу по истории генетики, генетике поведения и генетическому подходу к социальным явлениям. Так, М. Д. Голубовского за статью, опубликованную в 1966 году в популярном журнале «Радио и телевидение», обвинили в том, что его утверждения идут «вразрез с программой партии, с основополагающими высказываниями В. И. Ленина, с коренными положениями советской юридической науки». Голубовский же всего лишь утверждал, что интеллект, а также антисоциальное поведение формируются как под влиянием наследственности, так и воспитания, и усомнился в том, «что изменением социальных условий можно добиться полной ликвидации преступности».

Три года спустя А. А. Прокофьева-Бельговская и К. Н. Гринберг опубликовали в журнале «Здоровье» (1969, №11) статью под названием «Наследственность». Статья рассматривалась специальной комиссией Президиума АМН, созданной по поручению ЦК КПСС. Приказом по АМН СССР авторам было поставлено на вид за то, что у них отсутствует «критическая оценка взглядов Ф. Гальтона и других буржуазных ученых на определяющую роль наследственности в формировании умственных способностей и форм социального поведения человека».

В 1971 году в журнале «Новый мир» появилась статья В. П. Эфроимсона «Родословная альтруизма». Автор утверждал, что столь сложная сфера человеческого духа, как этика, формируется под совместным влиянием наследственности и воспитания и что естественный отбор внес свой вклад в формирование этических принципов современного человека. Статья сопровождалась комментариями академика Б. Л. Астаурова (тоже ученика Кольцова), в которой он поддерживал и разъяснял основные положения работы Эфроимсона. Обе статьи обсуждались на заседании Отдела науки ЦК КПСС, на котором академик Н. П. Дубинин охарактеризовал статьи как рецидив буржуазной евгеники в худших ее формах. Книга Эфроимсона «Генетика этики и эстетики», написанная в конце 70-х, была издана только в 1995 году. Такая же судьба постигла его книгу «Генетика гениальности», которая более 20 лет не могла пробиться в печать и вышла лишь в 1998 году. В 1976 году лаборатория В. П. Эфроимсона в Институте психиатрии была закрыта. Магнитофонная запись доклада Прокофьевой-Бельговской о своей научной жизни, прочитанного вдень 80-летия (в 1983 году) на заседании ученого совета ИМБ, была «арестована», и ее удалось опубликовать только через десять лет, так как в докладе юбиляр коснулась вопросов истории медицинской генетики.

Горбачевская перестройка, распад СССР и запрет на деятельность КПСС в 1991 году имели двоякие последствия для науки. С одной стороны, прекратился идеологический диктат КПСС, и ученые получили свободу творчества. С другой стороны, финансирование науки государством практически прекратилось. Начался процесс «утечки мозгов». С этой проблемой российская наука вступила в XXI век.

Автор благодарен В. С. Ахунову, М. М. Гинзбургу, М. Д. Голубовскому,
Н. М. Горенштейн, Э. Д. Крупникову и О. А. Подугольниковой
за помощь, критические замечания и интерес к работе.

Медицинская генетика реферат по медицине

Кировский физико-математический лицей Реферат по биологии Медицинская генетика Составил Сухих Константин 10а класс Проверила Лусникова Н. А. Киров, 1999 2 §1. Генетика и этапы её развития. Итак, что такое генетика? Генетика – это наука о наследственности и изменчивости организмов, она раскрывает сущность того, каким образом каждая живая форма воспроизводит себя в следующем поколении, и как в этих условиях возникают наследственные изменения, которые передаются потомкам, участвуя в процессах эволюции и селекции. Наследственность и изменчивость – это две стороны одних и тех же основных жизненных процессов. В противоположности наследственности и изменчивости заключена диалектика живого. В настоящее время она является фундаментом новых методов селекции, познания биологических основ человека и современной теории эволюции. Больших успехов добились молекулярная генетика, цитогенетика, популяционная генетика и др. В начале развития генетики как науки ее целью было выявление общих законов передачи признаков от одного поколения другому. Затем перед генетикой встала новая задача — выявить механизмы, лежащие в основе этих законов, и связать их с микроструктурами клетки. Далее возник вопрос: как и каким образом физико-химические свойства наследственного вещества и содержащаяся в нем генетическая информация могут перевоплощаться в признаки развивающегося организма? Генетика классическая породила генетику молекулярную. Содержащаяся в оплодотворенном яйце генетическая информация охватывает весь комплекс признаков и особенностей, которые организм проявляет в течение всего онтогенеза, т.е. от момента оплодотвореня до смерти. Этими сложными биохимическими процессами, лежащими в основе развития всех признаков морфологических, физиологических и любых других, вплоть до поведенческих, занимается другая отрасль генетики — феногенетика. Как организм не может существовать вне окружающей среды, так и формирование его признаков в результате активности наследственного вещества происходит в строго определенных условиях, и каждый признак зависит не только от наследственного фона, но и от условий, в которых он развивается. исследования взаимосвязей наследственного вещества и окружающей среды является чрезвычайно важной проблемой феногенетики. Генетика изучает явления наследственности и изменчивости на различном уровне организации живой материи; молекулярная генетика исследует ее на молекулярном уровне, другие отрасли генетики занимаются этими проблемами на уровне клетки, организма и ,наконец, на уровне коллектива особей, населяющих общую территорию, принадлежащих к одному виду, объединенных потенциальной возможностью обмена наследственными факторами и действием отбора. Последнее — задача популяционной генетики. Каждая из этих отраслей генетики имеет свои методы исследований и цели, хотя все они взаимосвязаны. Если феногенетика доводит развитие какого-либо признака в организме до уровня молекулярных изменений, то и 5 популяционная генетика сводит генетические изменения, которым подвергается популяция, к молекулярным изменениям наследственного вещества под действием мутаций и отбора. В начале своего развития генетика была изолирована от других наук. Эта изоляция, однако, была быстро преодолена. Для исследования природы явлений наследственности и изменчивости генетические методы сочетались с методами цитологии, физики, химии, математики, биохимии, иммунологии и ряда других наук. Было показано, что материальной основой наследственности и изменчивости при их специфике для разных категорий системы организмов в принципе едины для всего живого: человека, животных, растений, микроорганизмов и вирусов. На рубеже 18-19 веков были сделаны первые попытки верно оценить наследование ряда патологий у людей. Мопертьи в 1750 году описал, что полидактилия может передаваться по аутосомнодоминантному типу любым из родителей. Причем сделанные выводы предвосхитили идеи Грегора Менделя. Адамс в “Трактате о предполагаемых наследственных свойствах болезней” сделал следующие заключения о наличии “семейных” (рецессивных) и “наследуемых” (доминантных) факторов у человека: отметил проявления семейных заболеваний у близких родственников и др., руководствуясь которыми можно было прогнозировать появление некоторых болезней у родственников. В начале 19-го века были выявлены некоторые закономерности наследования гемофилии при исследовании ряда родословных, в которых встречались лица, страдающие этой болезнью. Об опасности этой болезни при обряде обрезания у новорожденных указывалась ещё в Талмуде: “Женщины в таких семьях передают эту склонность от отцов к своим детям, даже когда они замужем за мужчинами из других семей, не подверженных кровотечениям…” В 1865 г. Ф. Гальтон предположил, что способности человека зависят от наследственных факторов. В 1889 г. он предложил изучать влияние качеств, которые могут улучшить здоровье человека. В дальнейшем его идеи способствовали развитию евгеники. Он разработал генеалогический и близнецовый методы исследований человека. Описание наследования дальтонизма (сцепленное с полом, рецессивное наследование) приведено офтальмологом Горнером (Швейцария, 1876). О. Гертвиг в 1875 г. описал процесс оплодотворения. А. Вейсман указал, что носителями наследственных свойств являются ядра клеток, лежащих в основе процессов роста и размножения клеток у человека. В 1882 г. Э. Ван Беден показал, что в половых клетках число хромосом в два раза меньше, чем в соматических. При оплодотворении число хромосом увеличивается вдвое. Термин “хромосомы” был предложен В. Вальдеером в 1888 г. для обозначения постоянных элементов ядра клетки. Законы наследования моно-, ди- и полигенных признаков, установленные Г. Менделем в 1865 г., определили развитие генетики как науки на весь последующий период. 6 Официальной датой рождения генетики принято считать весну 1900 г., когда независимо друг от друга Г. де Фриз (Голландия), Корренс Германия), Чермак (Австрия) переоткрыли законы Менделя, что дало толчок к развитию генетических исследований. В 1910 г. Т. Морганом и его сотрудниками была показана роль хромосом в наследственности и установлены законы сцепленного наследования, которые вместе с законами независимого Г. Менделя составляют фундамент классическом генетики. Работы А. С. Серебровского по антропогенетике (1922 – 1929) способствовали становлению медико-генетического института, который был создан в 20-х годах под руководством профессора С. Г. Левита. В 1924 году Г. А. Левитский применил термин “кариотип” для обозначения ядерных особенностей организма. Термин “идиограмма” (типичный для вида состав ядра) был предложен С. Г. Навашиным, но распространения не получил. Лишь после уточнения Левитским в 1931 году идиограмма стала предполагать графическое изображение совокупности признаков хромосом (диаграммно-схематическое изображение). Часть работ по генетике человека публиковалась тогда в популярном журнале “Annals of Eugenics”. После окончания второй мировой войны он стал называться “The Journal of Human Genetics”. С тех пор развитие генетики человека шло в других направлениях: • изучение наследования патологий; • изучение факторов возникновения и распространения таких болезней, как диабет, злокачественные опухоли, шизофрения. На основании родословных А. С. Пушкина, С. Рахманинова, Л. Н. Толстого, А. М. Горького, П. И. Чайковского изучали наследование одаренности известные генетики Н. К. Кольцов и Ю. А. Филипченко. Филипченко опубликовал цикл работ по наследственности человека и евгенике. В 1921 г. Ю. А. Филипченко организовал бюро по евгенике при Российской Академии наук, впоследствии реорганизованное в лабораторию генетики, ставшую в 1933 г. институтом генетики, который возглавил Н. И. Вавилов. Клинико-генеалогический метод получил дальнейшее развитие в работах С. Н. Давиденкова, который анализировал различные клинические формы (полиморфизм) и особенности течения болезней течения болезней нервной системы. В 1925 году выходит в свет книга “Наследственные болезни нервной системы”, положившая начало почти тридцатилетней тематике исследований известного клинициста-генетика С. Н. Давиденкова. По существу, он первый отчётливо сформулировал принцип генетической гетерогенности наследственных болезней. “Единая” миопатия распалась на семь форм. Давиденков высказал идею о необходимости создания каталогов генов для классификации наследственных патологий. 7 Генетика человека не только использует достижения, полученные в исследованиях на других организмах, но и сама обогащает наши теоретические познания. Выбор нового объекта или применение новых методов, вызывающих расцвет генетики, каждый раз лишь на короткое время, сменяется периодом стабилизации, за которым следует новый подъем, появление новой области генетических исследований. Каждая новая фаза развития генетики не снимает предыдущих достижений, а, наоборот, расширяет и углубляет их. Генетические исследования постоянно расширяются, ибо именно генетика призвана осветить проблемы жизни, ее возникновения и развития. 10 §2. Клонирование и генная инженерия. Синтез идей и методов общей, молекулярной генетики и физико- химической биологии создал новое направление в современной биологии, получившее название генетическая инженерия. Генетическая инженерия представляет собой область современной биотехнологии, которая обладает новыми методами создания генотипов, нужных практике и науке. Эти методы позволяют целенаправленно изменять наследственные основы при помощи манипуляций на клеточном, хромосомном и на генном уровнях. В последнем случае принят термин — генная инженерия. Метод генетической инженерии в дальнейшем может быть перспективен в животноводстве для создания стад-клонов от высокопродуктивных животных, имеющих ценный генотип. На этом пути следует ожидать новых успехов в селекции растений. Наибольших успехов генетическая инженерия достигла на уровне генов, что связано с развитием новых методов, в первую очередь, разработанных для клеток бактерий и вирусов. Основанием работы по генной инженерии является, во-первых, возможность выделения отдельных генов и, во-вторых, их внесение в избранную клетку. На ряде примеров показано, что человеческие белки, например ИНСУЛИН, ИНТЕРФЕРОН, могут быть получены микробиологическим синтезом в клетках бактерий, несущих соответствующий ген человека. Свойства самих бактерий могут быть изменены в сторону сверх синтеза нужного микробного препарата. На этих основах создается новая биотехнологическая промышленность, которая в недалеком будущем окажет большое влияние на успехи сельского хозяйства и медицины. Успешное развитие методов генетической инженерии перспективно для ряда направлений практики. Разрабатывается проблема генотерапии, т.е. лечения людей с наследственными дефектами обмена веществ, путем введения в их клетки нормальных генов. Естественно, что возможность манипуляции с индивидуальными генами человека и животных еще недостаточна для понимания функции всего генома, его организации в целом, взаимодействия его частей в обеспечении всего многообразия механизмов онтогенеза, то есть развития одной клетки до целого организма. Если добавить к этому, что в геноме любого вида записана не только программа индивидуального развития, но закодирована вся эволюция вида, то есть филогенез, становиться понятным насколько логичной и методически своевременной явилась Международная научная программа » Геном человека». Программа » Геном человека» уже к 2000 году позволит полностью расшифровать первичную структуру ДНК, то есть идентифицировать все гены человека, их регуляторные элементы. Захватывающая «Одиссея» о наследственности, которой и является эта программа, безмерно расширит наши представления о структуре и функции генома, его эволюции, откроет горизонты столь увлекательного, а возможно, и не менее опасного направленного воздействия человека на геном растений, 11 животных и, что особенно рискованно, на свой собственный геном. Важно осознать, что это не завтрашний день фундаментальной науки, не отдаленные абстракции, а день сегодняшний. Он уже наступил и стал реальным независимо от нас, и, если не быть готовым концептуально и методически, то может пройти мимо. Не только современный врач и специалист-биолог, но и каждый образованный человек сегодня должен знать о триумфе Международного Научного сообщества в выполнении программы «Геном человека», в результате которой успешно расшифровываются все гены человека, каждый из которых, будучи выделенным из организма и проклонированным, может выступить в качестве лечебного препарата для генотерапии; о том, что уже сегодня идентифицировано на генетических картах более 5000 структурных генов, о том, что всего за 5 лет после первых успешных попыток введения чужеродных маркеров гена в клетки человека число уже одобренных для клинических испытаний программ по генной терапии наследственных заболеваний достигло более 200! Эти итоги представляются особенно впечатляющими, если учесть, что согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения, около 2,4% всех новорожденных на земном шаре страдают теми или иными наследственными нарушениями; около 40% ранней младенческой смертности и инвалидности с детства обусловлены наследственной патологий. Вместе с тем и в сегодняшних исследованиях по генной терапии необходимо учитывать, что последствия манипулирования генами изучены недостаточно. При разработке программ генной терапии принципиальное значение имеют вопросы безопасности предлагаемых схем лечения, как для самого пациента, так и для популяции в целом. Важно, что при проведении испытаний ожидаемый лечебный эффект или возможность получения дополнительной полезной информации превосходили потенциальный риск предлагаемой процедуры. Важнейшим элементом в программе генной терапии является анализ последствий проводимых процедур. Этот контроль проводят на всех этапах терапии. Проводится оценка клинического (терапевтического) эффекта; изучаются возможные побочные последствия и способы их предупреждения. НО! Всякое эпохальное открытие науки (а именно таковым и является расшифровка генома человека) может использоваться не только во благо, но и во вред человечеству (печальный пример тому открытие расщепления ядра урана, породившее атомную бомбу)! Неразумные эксперименты с геномом человека могут привести к еще более страшным последствиям! До сих пор не утихают споры и дискуссии по вопросу клонирования. Термин «клонирование» стремительно вошел в широкий лексикон год назад: тогда ученые Рослинского института в Шотландии сообщили о существовании овечки Долли, появившейся на свет методом бесполого размножения. Долли появилась на свет так, как ни одно млекопитающее за миллионы лет существования жизни на земле, — путем клонирования. Ученые 12 §3. Причины генных мутаций. В естественных условиях мутация появляется под влиянием факторов внешней и внутренней среды и обозначается термином «естественные (или спонтанные) мутации». Причиной генных, или так называемых точечных, мутаций является замена одного азотистого основания в молекуле Д.Н.К. на другое, потеря, вставка, или перестановка азотистых оснований в молекуле Д.Н.К. Отсюда следует — ген мутирующий у человека могут развиться патологические состояния, патогенез которого различен. На факторы вызывающие мутации на генном уровне оказало соответствующее влияние окружающей среды (подагру, некоторые формы сахарного диабета). Подобные заболевания чаще проявляются при постоянном воздействии неблагоприятных или вредных факторов окружающей среды (нарушение режима питания и др.). Мутация гена может повлечь за собой нарушение синтеза белков, выполняющих пластические функции. Вероятная причина таких заболеваний синдром Элерса — Данлоса. В стадии изучения находится заболевания, в основе которых лежит недостаточность механизмов восстановления измененной молекулы Д.Н.К. Генная мутация может привести к развитию иммунодефецитных болезней (аплазия вилочковой железы в сочетании агаммагло-булинемией). Причиной аномальной структуры гемоглобина является замена в молекуле остатка глутаминовой кислоты на остаток валина. Известен ряд мутаций генов, контролирующих синтез факторов свертывания крови. Генные мутации могут быть причиной нарушения транспорта различных соединений через клеточные мембраны. Они связаны с нарушением функций мембранных механизмов и с дефектами в некоторых системах. Если мутация на генном уровне возникает при действии различных физических, химических, биологических факторов, то это называют мутагенезом. Основой мутации являются первичные повреждения в молекуле Д.Н.К. 15 §4. Генетика пола. В кариотипе человека из 46 хромосом 44 одинаковы у всех особей, независимо от пола (эти хромосомы называют аутосомами), а одной парой хромосом, называемых половыми, женщины отличаются от мужчин. Это общебиологическая закономерность для всех живых организмов, размножающихся половым путем. У женщин 2 половые хромосомы одинаковы (гомологичны), из называют X-хромосомами. У мужчин пара половых хромосом представлена гетерохромосомами, так как они неодинаковы: одна из них X-хромосома (т.е. такая же, как у женщин), другая У – хромосома. В основе определения пола у человека лежит хромосомный механизм, реализующийся в момент оплодотворения. Поскольку у женщин половые хромосомы одинаковы, то каждая яйцеклетка несет Х-хромосому, такой пол называют гомогаметным. У мужчин в процессе гаметогенеза формируется два типа гамет в равной пропорции: Х – сперматозоиды и У – сперматозоиды. Это биологическая закономерность, обусловленная механизмом мейоза. Мужской пол называется гетерогаметным. Хочется отметить, что теоретически соотношение полов должно быть 1:1. Это статистическая закономерность, обеспечиваемая условием равновероятной встречи гамет. Пол будущего потомка всегда определяет гетерогаметный пол (т.е. мужской). При патологии не расхождения половых хромосом в гаметогенезе решающим фактором в определении пола у человека является наличие У – хромосомы или ее фрагмента. В таких случаях при любом числе Х–хромосом будет формироваться мужской пол. В случае отсутствия У-хромосомы или ее фрагмента будет формироваться женский пол (табл. 1). Таблица 10. Хромосомный механизм определения пола у человека в норме и при нерасхождении Х-хромосом Х ХХ О Х ХХ Нормальная женщина ХХХ Трисомия по Х- хромосоме ХО синдром Шерешевского- Тернера У ХУ Нормальный мужчина ХХУ Синдром Клайнфельтера УО гибнет на эмбриональном уровне В настоящее время принято различать следующие уровни половой дифференцировки: 1. Хромосомное определение пола – 46, ХХХ или 46, ХУ. 2. Определение пола на уровне гонад (яичники или семенники) 3. Фенотипическое определение пола (мужчина или женщина, формирование вторичных половых признаков). 4. Психологическое определение пола. 5. Социальное становление пола. 16 Анализ нарушений числа и структуры половых хромосом позволил понять не только хромосомный механизм определения пола, но и получить информацию о ганадном и фенотипическом уровнях становления. Было показано, что инициализация роста и созревание тестикул, их дифференцировка и сперматогенез связаны с эухроматиновым районом У — хромосомы (Эйчвальд и Силсмер, 1955), контролирующим трансплантационный антиген (Н-У антиген). Миграция первичных клеток зародышевого пути в гонады не зависит от пола. В норме направление развития определяется наличием У-хромосомы (мужской пол) или ее отсутствием (женский пол). Это развитие зависит от Н-У антигена. В настоящее время существует гипотеза, подтвержденная экспериментальными данными (Ohio, 1976), о том, что Н-У рецепторы имеются на поверхности клеток гонад обоих типов. Совместная инкубация с Н-У антигеном индуцирует семенники, но если активность Н-У антигена подавлена, то индуцируются яичники. Предполагается, что Н-У антиген кодируется не У-хромосомой, как думали ранее, а структурным аутосомным геном, находящимся под контролем У-хромосомы. У всех организмов, не имеющих У-хромосомы, этот структурный аутосомный ген не активируется. Экспрессия этого гена индуцируется факторами, которые в норме определяются У-хромосомой. Следовательно, возможны мутации, при которых будет синтезироваться Н-У антиген, даже в случаях, когда клетки лишены У-хромосомы. Наблюдения показали, что для превращения зачатка в семенники необходима определенная минимальная концентрация Н-У антигенов. Развитие вторичных половых признаков обусловлено дифференцировкой гонад. Человек по своей природе биссексуален. Половые органы формируются из мюллеровых и вольфовых каналов. У женщин мюллеровы протоки развиваются в фаллопиевы трубы и матку, а вольфовы – атрофируются. У мужчин вольфовы каналы развиваются в семенные протоки и семенные пузырьки. Под влиянием хорионического гонадотропина матери в эмбриональных семенниках клетки Лейдига синтезируют стероидные гормоны (тестостерон). В клетках Сертоли синтезируется гормон, называемый мюллеровым ингибирующим фактором (MIF). Эти гормоны действуют на зачатки внешних и внутренних половых органов. Нормальные особи мужского пола развиваются только в случае, если все элементы “срабатывают” в определенное время в заданном месте. Незначительные отклонения в работе на различных уровнях становления вторичных половых признаков приводят к неполному развитию мужского фенотипа в организме с мужским генотипом (мужской псевдогермафродитизм). При полном отсутствии всех элементов становления мужского пола формируются женские половые признаки, следовательно, становление женских половых признаков не нуждается в специальных регуляторных механизмах и является “конститутивным”. В связи с этим Джост писал: “Становление мужского организма – это длительное, нелегкое и рискованное 17 инфекционных болезней. У большинства – наследственная этиология. Признак может проявляться у обоих полов, но чаще и выраженнее проявляться у мужчин. Основоположником изучения признаков, контролируемых полом, является Бернштейн, который проанализировал наследование певческих голосов у взрослых европейцев. Если вывод – шесть различных певческих голосов (бас, баритон, тенор, сопрано, меццо-сопрано и альт) контролируются одной парой аллелей. Более поздние исследования показали, что тип голоса контролируется половой конституцией, начиная с периода полового созревания, находится под влиянием половых гормонов. §4.3. Предопределение пола у человека. В прошлом веке индейцы племени Хавасупаи обладали удивительной способностью влиять на пол своих будущих детей. Сходный эффект неслучайного распределения полов известен у филиппинцев, индейцев Венесуэлы, аборигенов Австралии. Они не испытывали влияния цивилизации и практически не пользовались контрацепцией. Во Франции и Англии сразу после каждой из двух мировых войн наблюдалось странное возрастание числа мальчиков из числа новорожденных, отцы которых были солдатами. Отмечено, что профессия родителей или их заболевания могут влиять на пол детей. Например, среди детей водолазов, анестезиологов, пилотов и священников чаще встречаются девочки. Как и у мужчин, больных лимфомой Ходжкинса. У женщин с гепатитом A или шизофренией чаще рождаются дочери, чем сыновья. Существуют несколько гипотез, объясняющих, как происходит предопределение пола у человека. Гипотеза Мартина: среди сперматозоидов выделяют “зайцев” – У- сперматозоиды и “черепах” – Х-сперматозоиды. У-сперматозоиды активнее, чем Х-сперматозоиды, но быстрее погибают. Если яйцеклетка готова к оплодотворению, то первыми ее оплодотворяют У-сперматозоиды, а если нет, то вероятность оплодотворения Х-сперматозоидом возрастает т.к. У- сперматозоиды быстро погибают. У молодоженов, часто занимающихся сексом, У-сперматозоиды постоянно присутствуют в половых путях женщины и оплодотворяют яйцеклетку. Спустя несколько лет ситуация меняется (когда секс становится эпизодическим) и яйцеклетки оплодотворяются более долгоживущими Х-сперматозоидами. Поэтому первые дети после свадьбы – обычно мальчики, а более поздние – девочки. Аналогично в ситуациях в семьях вернувшихся с фронта солдат. Другая гипотеза была предложена Джеймсом (Лондонский университетский колледж), утверждавшим, что закономерности распределения полов обусловлены гормональными изменениями в организме родителей. Он считает, что повышение уровня тестостерона и эстерогенов у обоих родителей увеличивает вероятность рождения мальчиков, а возрастание уровня 20 гонадотропина – девочек. Предложения основаны на клинических наблюдениях: лечение бесплодия гонадотропинами у женщин приводило к рождению дочерей, а у мужчин – сыновей. Джеймс, как и Марти, считает, что при быстром оплодотворении чаще рождаются мальчики, но связывает с соотношением половых гормонов в момент зачатия. В первой половине менструального цикла до момента готовности яйцеклетки к оплодотворению уровень тестостерона и эстрогенов высок, что приводит к рождению мальчиков. Далее по циклу возрастает уровень гонадотропинов, которые обуславливают зачатие девочек. Доминирование в поведении и агрессивность связывают с высоким уровнем тестостерона в крови. Предварительные данные говорят о положительной зависимости между высоким социальным статусом женщины и рождением у нее сыновей, хотя исследования по выявлению влияния уровня тестостерона на пол будущего ребенка не приводилось. Третья гипотеза выдвинута Триверсом и Виллардом (Гарвард). Они предположили, что соотношение полов у млекопитающих объясняется адаптивными механизмами (особенно у полигамных, проявляющих заботу о потомстве). Если самка ослабленная, то пол, скорее всего, будет женским (будущая самка, даже не очень сильная, сможет найти себе супруга). Если же у матери прекрасное физическое здоровье, то, скорее всего, это будет самец (сильный самец сможет иметь много детенышей, а слабый у полигамных видов часто не имеет потомства). Гипотеза была подтверждена при изучении паукообразных обезьян. В применении к человеческому обществу эта гипотеза позволяет найти определенную взаимосвязь между социальным статусом человека и полом его детей. Мюллер (Германия) собрал данные о статистически достоверном преобладании сыновей среди детей, рожденных в семьях с высоким социальным статусом. Обратная тенденция наблюдается среди людей низкого социального положения. Лоррен и Столковский (Франция) предложили метод, с помощью которого можно планировать пол будущего ребенка. Его суть в особом режиме питания, при котором в течение 6 недель, предшествующих зачатию, необходимо отдавать предпочтение некоторым пищевым продуктам. Им была обследована экспериментальная группа женщин, из которых 87% родили ребенка запланированного пола. Оказалось, что женщины, которые хотят иметь сыновей, должны употреблять острые продукты с повышенным содержание солей (натрия и калия). Женщины, желающие иметь дочерей, должны есть больше молочных продуктов, богатых кальцием и магнием. Женщины обязаны придерживаться установленного рациона. Те, кто уже имеет несколько дочерей, но хотят сына, должны выдержать рацион в течение 3-4 месяцев. Пока не ясно, каким образом рацион влияет на пол эмбриона. Возможно, в будущем человечество сумеет влиять на баланс своего потомства. 21 §5. Диагностика генетических болезней. Аристотель в своей “Истории животных” упоминает о возможности предсказать пол неродившегося плода с помощью таких критериев, как учет стороны, на которой ощущается движение плода, или даже оценка общего состояния матери. В действительности только в сравнительно недавнее время были разработаны точечные методы для изучения плода человека in utero. В середине 1950-х годов несколько лабораторий почти одновременно сообщили, что пол плода может быть определен исследованием полового хроматина в клетках амниотической жидкости. Около 10 лет спустя несколько групп исследователей почти одновременно сообщили о том, что путем изучения клеток амниотической жидкости можно не только определить пол плода, но и, выращивая клетки в культуре, исследовать их хромосомы. Таким образом могут быть оценены особенности хромосом плода. Позднее Надлер (1968) показал, что культивируемые клетки амниотической жидкости могут быть также использованы для дородовой диагностики некоторых биохимических нарушений. Эти публикации проложили путь последующим исследованиям, в результате чего в последние 3-4 года в этой области достигнуты значительные успехи. Методы, которые используются или могут быть полезны в дородовой диагностике генетических болезней, можно разделить на те, при помощи которых изучают непосредственно плод, и методы, по результатам которых плод изучают косвенно, например, по изменениям в крови и моче матери: §5.1. Методы дородовой диагностики А. Прямые (плодные) 1. Рентгенография: 1) скелета 2) мягких тканей (амниография, фетография) 2. Сонография (исследование ультразвуком) 3. Электрокардиография 4. Фетоскопия 5. Биопсия 1) амниона 2) плаценты 3) плода Б. Косвенные (материнские) 1. Кровь, например, лимфоциты плода. 2. Моча, например, экскреция эстриола. Так, было установлено, что в материнском кровотоке имеется небольшое количество лимфоцитов, содержащих ХУ половые хромосомы, если развивается плод мужского пола. Какое значение имеют эти данные и могут ли 22 для окружающих таких больных людей и становится дорогостоящим для общества. Если дефект может быть исправлен хирургически, как при трещине губы (с наличием трещины или без нее), то расходы при этом невелики, но некоторые косметические дефекты остаются у индивидуума на всю жизнь. При тяжелых заболеваниях, выводящих из строя, таких, как мышечная дистрофия Дюшенна и синдром Дауна, отягощенность для индивидуума и семьи, расходы невелики, если ребенок остается дома, и значительны, если он помещается в лечеюное учереждение. Аналогично сказанному тяжесть поздно проявляющихся болезней таких, как хорея Гентингтона и шизофрения, вызывающих значительные отягощения для пораженных индивидуумов, одинакова для их семей и общества. §5.2. Степень риска Основной статистический показатель в дородовой диагностике – степень риска поражения плода. Этот показатель может определить, есть ли медицинские показания для дородовой диагностики и приемлема ли она для родителей. Во многих случаях степень риска может быть легко получена на основе только знаний типа наследования данного состояния. Однако же для простых менделирующих состояний степени риска могут быть не всегда точно установлены. Для оценки риска неменделирующих состояний может быть использован эмпирический подход, но имеются новые способы для сочетания эмпирического подхода и анализа родословной, чтобы измерить степень специфического риска для каждой обследуемой мемьи. §5.3. Аутосомные нарушения Традиционно установленная степень риска в 25 и 50% обычно относится соответственно у рецессивным и доминантным состояниям. Однако могут быть отклонения из-за наличия генетической гетерогенности, неполной пенетрантности, фенокопий, начала болезни в различном возрасте, случаев мутаций и скрещиваний пораденных родителей. Общая проблема, которая возникает в анализе поздно проявляющихся доминантных состояний, состоит в том, что неизвестно, нормален ли индивидуум, имеющий пораженного родителя, или болезнь у него еще проявится. Возможность быть носителем можно установить по графику, на котором показано, как распределяется в популяции возраст, характерный для начала болезни. §5.4. Нарушения, сцепленные с Х-хромосомой. Если мать знает, что является носителем нарушения, сцепленного с Х- хромосомой, риск появления пораженного сына, конечно, 25%. Однако, если статус матери сомнителен, предсказать степень ее риска может быть очень 25 сложно. Сведения из родословной (включая данные о нормальных мужчинах) и о каких-либо носителях, обнаруженных среди женщин-родственниц, могут позволить более точно измерить степень риска. Мерфи (1969) показал, как методы Беезина могут быть использованы для вычисления степени риска, в 1970 году он формализовал методы в вычислительную систему ENSU (Equivalent Normal Son Unit – эквивалентный показатель нормального сына). Могут быть также использованы сведения о биохимических исследованиях матери–носителя и других женщин-родственниц, а формулы и графики полезны для вычисления степени риска летальных состояний, сцепленных с Х-хромосомой. Очевидно, что дородовая диагностика имеет значительные возможности в предупреждении генетического заболевания как в отдельных семьях, так и в популяции в целом. В настоящее время ее использование ограничено, а ее влияние небольшое, но так как исследования углубляются, и создаются новые методики для дородовой диагностики большого количества генетических болезней, она может быть использована шире, и ее влияние на генетические болезни может увеличиться. Важно, что клиницисты установили природу и степень любых рисков, вызванных различными методами и способами дородовой диагностики, так что теперь можно определить только воздействие этой процедуры на здоровье. Регистр амниоцентеза уже создан. В общем дородовая диагностика, вероятно, оказывает целебное (евгеническое) воздействие на генофонд. Только, если имеется полная репродуктивная компенсация при потере пораженных плодов, и если больные индивидуумы не будут давать потомство, будет оказано вредное (дисгеническое) воздействие на популяцию, но даже тогда оно будет небольшим, могущим измениться. Чтобы внедрить дородовую диагностику в практику, должны быть разработаны методы для установления степени риска либо в отдельных семьях, либо путем скринирования всех родителей. Это изменит назначение медицинской генетики от генетики, консультирующей ретроспективно, к службе генетического предупреждения на перспективной основе. Может возникнуть новое отношение к ответственности родителей к воспроизводству потомства, которое вместе с одобрением планирования семьи обеспечит насколько это возможно благополучие их детей и генетическое, и со стороны внешней среды. Полезно заметить, что дальнейшая либерализация законодательства, позволяющая осущетсвлять легкую гибель больным новорожденным, сделает дородовую диагностику в основном ненужной. Однако это маловероятно в ближайшее время, так что дородовая диагностика должна остаться полезным методом по предупреждению генетических заболеваний. 26 §6. Генетические болезни. Середина и вторая половина XX столетия ознаменовались значительным уменьшением частоты и даже полной ликвидацией ряда инфекционных заболеваний, снижением младенческой смертности, увеличением средней продолжительности жизни. В развитых странах мира центр внимания служб здравоохранения был перемещен на борьбу с хронической патологией человека, болезнями сердечно-сосудистой системы, онкологическими заболеваниями. Стало очевидным, что прогресс в области медицинской науки и практики тесно связан с развитием общей и медицинской генетики, биотехнологии. Потрясающие достижения генетики позволили выйти на молекулярный уровень познания генетических структур организма, и наследования, вскрыть сущность многих серьезных болезней человека, вплотную подойти к генной терапии. Получила развитие клиническая генетика – одно из важнейших направлений современной медицины, приобретающих реальное профилактическое значение. Выяснилось, что множество хронических болезней человека есть проявление генетического груза, риск их развития может быть предсказан задолго до рождения ребенка на свет, и уже появились практические возможности снизить давление этого груза. Генетический груз включает, с одной стороны, патологические генные мутации, наследуемые от родителей и прародителей, и называемые серегационным грузом, если в виде болезни проявляются рецессивные или нелетальные доминантные мутации генов (от латинского segregatio – выщепление). С другой стороны, определенную часть этого груза составляют новые, вновь возникшие генные мутации (в результате мутагенных влияний внешней среды). Они не прослеживаются в восходящих поколениях и составляют так называемый мутационный генетический груз. Согласно данным Н.П.Дубинина, частота спонтанных генных мутаций установлена в пределах 10-10 на геном на поколение. В геноме человека имеется около 100000 генов. Расчеты показывают, что примерно у 10% людей возникают новые мутации, вызванные мутагенным воздействием факторов окружающей среды (радиационный фон Земли, действие продуктов сжигания топлива, влияния вирусов). Безусловно, частота мутаций будет значительно выше в условиях антропогенного загрязнения внешней среды. Каждый человек наследует, как минимум, 10 скрытых мутаций, опасных для здоровья. В целом по А. Кнудсону (1986), величина постнатального генетического груза составляет 0.2 т.е. у 20% членов популяции существует вероятность развития наследственных болезней (моногенных, полигенных или связанных с мутациями генов соматических клеток). Генетический груз проявляется, как бесплодие и спонтанные аборты, выкидыши и мертворождения, врожденные пороки и умственная отсталость. 27 В связи с этим необходимы справочно-диагностические системы, хранящие в памяти ЭВМ огромный объем сведений о признаках наследственных болезней. Конечно, ЭВМ не должна ставить диагноз, но может реально помочь в выборе тактики обследования больного. В Московском НИИ педиатрии и детской хирургии разработана справочно-диагностическая система “ДИАГЕН” – диагностика генетических болезней. В память мшины введены признаки около 1400 синдромов и болезней моногенной и хромосомной природы. Система ориентирована на выделение узкого дифференциально-диагностического ряда и отдельных заболеваний. В ней предусмотрена возможность расширения и дополнения перечня болезней. В последней версии она включает не только описания, но типичные фотографии больных, демонстрируемые на дисплее персонального компьютера. 30 §7. Генная терапия. Не подлежит сомнению, что радикальным методом лечения наследственных моногенных болезней должна стать генная терапия, однако, лишь в самые последние годы появились реальные предпосылки для ее практического применения. Значительно раньше появились эффективные методы консервативной терапии – они не изменяют генотип, но направлены на коррекцию метаболических или иммунологических дефектов, возникающих под влиянием мутантных генов. При раннем распознавании болезни с помощью этих методов удается моделирование нормального фенотипа путем целенаправленной диетотерапии, введения витаминов, гормонов, недостающих белков, микроэлементов. Генная терапия – это метод введения фрагмента ДНК в клетки больного человека с целью замещения функции мутантного гена и лечения наследственных болезней. Еще в конце 60-х годов выяснилось, что клетки животных и человека способны поглощать экзогенную ДНК, встраивать ее в свой геном, после чего проявляются экспрессия введенных генов, в частности, в виде синтеза отсутствовавших ранее белков и ферментов. Были разработаны методы доставки ДНК в клетки с помощью вирусов и других носителей. Впервые попытка генной терапии в клинике была предпринята М.Клайном в 1983 году., когда им было осуществлено введения нормального бета-глобинового гена больным бета-талассемией. Позднее была разработана методика генной терапии наследственной недостаточности аденозин- деаминазы (тяжелый иммунодефицит): нормальный ген был введен в клетки костного мозга больного и после их ретрансплантации восстановилась активность фермента, состояние больного улучшилось. Проведены клинические эксперименты по генотерапии рака. В лейкоциты больных злокачественной меланомой и поздними стадиями рака были введены гены, маркирующие злокачественные клетки (чтобы их могла узнавать имунная система). У половины больных размеры опухолей уменьшились в два раза и более. В настоящее время насчитывается более 40 заболеваний, при которых испытывается генная терапия – от редких форм (недостаточность аденозин- деманиазы) до распространенных, таких как рак, болезни сердечно-сосудистой системы и иммунодефициты. Весьма важно, что фрагменты ДНК и соответствующие гены были введены в клетки-мишени, которые были бы способны к последующему делению (клетки печени, стволовые клетки костного мозга и т.п.). Самая сложная проблема – перенос фрагмента ДНК (гена) в клетку. В большинстве случаев для этих целей используются генетически модифицированные вирусы или вирусные векторы, и чаще всего мышиные ретровирусы. Они способны инфицировать любую и вместе с желаемым фрагментом ДНК легко включаются в геном клетки-хозяина ДНК для того, чтобы превратить ретровирусы-векторы, из них с помощью генно-инженерных 31 методов удаляются нуклеотиды, ответственные за их размножение, однако введенный с вирусом-вектором ген передается дочерним клеткам при клеточном делении. Однако, эти векторы не годятся для введения ДНК- фрагментов в неделящиеся клетки человека, например, в нейроны. Они мало пригодны для переноса генов в клетки, отличающиеся низкой митотической активностью в клетки эпителия дыхательных путей. Эти обстоятельства обусловили поиск других вирусных векторов, среди которых внимание привлекли аденовирусы. Из них также удаляются нуклеотиды, ответственные за репликацию. Аденовирусы могут переносить ДНК в неделящиеся клетки, чем отличаются от ретровирусов. Но в этом случае переносимая аденовирусом ДНК не встраивается в геном клетки хозяина, она остается вне хромосом, хотя и проявляет генную активность. В силу эписомальной локализации она не передается дочерним клеткам. Но с другой стороны, аденовирусные векторы позволяют вводить гены в клетки нервной системы, аденовирусные векторы позволяют вводить гены в клетки нервной системы и эпителий дыхательных путей. В качестве вектора генов используется также вирус простого герпеса — тип 1. Этот вектор легко встраивает экзогенную ДНК в нейроны, клетки печени. Как и другие вирусы-векторы, герпес-вирус подвергается генно- инженерной обработке, ведущей у утрате его способности к размножению (деления части вирусной ДНК). Испытываются в качестве векторов ДНК парвовирусы. Наряду с биологическими применяют физико-химические методы введения экзогенной ДНК в клетки хозяина. Для таких целей используется конъюганты ДНК с трансферрином или асиалогликопротеином, для которых на многих клетках имеются рецепторы (лиганд-рецепторный принцип). После связывания с рецептором конъюганты ДНК поглощаются клеткой, хотя вероятность встраивания введенной ДНК в геном хозяина очень невелика. Все же такой ген может временно выполнять свои функции. Разработана технология микроинъекций ДНК в клетки (миоциты), а также введение генов с помощью липосом. Методы генной терапии постепенно входят в арсенал современных эффективных методов лечения наследственных заболеванийчеловека, что особенно важно в тех случаях, когда других возможностей просто не существует. Семейная гиперхолестеринемия – еще одно заболевание – кандидат для генной терапии. Как известно, это заболевание представляет высокий риск для жизни молодых людей, т.к. отличается ранним инфарктом миокарда и ранним атеросклерозом. Оно связано с отсутствием на мембранах клеток рецепторов для липопротеинов низкой плотности, что обуславливает очень высокий уровень холестерина в крови. Так как рецепторы отсутствуют на клетках печени, то пока для введения генов прибегают к частичной гепатоэктомии. С помощью ретровирусного вектора в клетки печени вводится ген рецептора липопротеинов низкой плотности, после чего гепатоциты инъецируются в 32 35 §8.2. Близнецовый метод. У человека в среднем в одном проценет случаев рождаются близнецы. Они могут быть однояйцевыми и разнояйцевыми. Разнояйцевые, или неидентичные, близнецы рождаются в результате оплодотворения двух яйцеклеток двумя сперматозоидами. Они поэтому похожи друг на друга не более чем братья и сестры, рожденные неодновременно, и могут быть разнополыми. Но иногда одна оплодотворенная яйцеклетка дает начало не одному, а двум (или нескольким эмбрионам). Такие эмбрионы-близнецы развиваются всегда из единственной яйцеклетки и одного сперматозоида, они всегда либо мальчики, либо девочки. И сходство у таких близнецов почти абсолютное, так как они имеют один и тот же генотип. Таких близнецов называют однояйцевыми или идентичными, поскольку они развивались из одной яйцеклетки. Идентичные близнецы представляют собой большой интерес для изучения наследственности человека, так как различия между ними объясняются не различными генотипами, а влиянием условий развития т.е. среды. §8.2. Цитогенетический метод. Этот метод основывается на микроскопическом исследовании структуры хромосом у здоровых и больных людей. Исследования хромосом человека показали, что многие врожденные уродства и ненормальности связаны с изменением числа хромосом или изменением морфологии отдельных хромосом. У человека известно очень много различных аномалий, связанных с изменением числа или формы хромосом. Эти заболевания называются хромосомными болезнями. В последнее время совместными усилиями медиков и генетиков разработаны методы, позволяющие диагносцировать наличие у плода хромосомных и многих биохимических аномалий даже в период беременности. §8.3. Биохимические методы В последние годы показано, что очень многие наследственные патологические состояния у человека связаны с нарушением обмена веществ. Так, известны аномалии углеводного, аминокислотного, липидного и других типов обмена. 36 Заключение. Итак, адекватно воспринимать происходящую на наших глазах революцию в биологии и в медицине, уметь воспользоваться ее заманчивыми плодами и избежать опасных для человечества соблазнов — вот что необходимо сегодня и врачам, и биологам, и представителям других смежных специальностей, и просто образованному человеку. Уберечь генофонд человечества, всячески защищая его от рискованных вмешательств, и при этом извлечь максимальную выгоду из уже полученной бесценной информации в плане диагностики, профилактики и лечения многих тысяч наследственно обусловленных недугов — вот задача, которую необходимо решать уже сегодня и с которой мы войдем в новый 21-й век. 37 Код генетический – единая система записи наследственной информации в ДНК. Кодон (триплет) – проследовательность трех нуклеотидов в молекуле ДНК (или мРНК), кодирующая одну из аминокислот в молекуле белка или определяющая “знаки пунктуации” при считавании информации. Кодоминирование – проявление у гетерозиготных особей признаков обоих аллелей. Компауд – генотип, состоящий из двух различных аллелей одного локуса, встречается в случае множественного аллелихма. Комплементарность – последовательность соответствующих оснований в противоположных цепях ДНК (А-Т, Г-Ц). Локус – место положения гена в хромосоме. Мейоз – процесс деления клетки, приводящий к уменьшению числа хромосом в дочерних клетках вдвое (п). Митоз – тип деления клетки, при котором дочерние ядра несут такле же число хромосом, что и дочерняя клетка. Модификация – фенотипические наследственные изменения, возникающие пдо действием различных факторов среды. Мутаген – фактор, вызывающий мутацию. Мутации – изменения в структуре генетического материала данного организма. Неоплазма – опухолевая ткань. Нуклеотид – мономер ДНК ил РНК, в состав которого входят азотистые основания, углевод и остаток фосфорной кислоты. Онтогенез – индивидуальное развитие организма. Полиморфизм – одновременное присутствие в популяции нескольких форм гена или признака. Половые хромосомы – хромосомы, различающиеся у двух полов, обычно обозначаются как Х и Y. Популяция – совокупность особей определенного вида, в течение достаточно длительного времени (большого числа поколений) населяющих определенный ареал, внутри которого практически осуществляется та или иная степень панмиксии и нет заметных изоляционных барьеров, которая 40 отдалена от соседних, таких же совокупностей данного вида, той или иной степенью давления тех или иных форм изоляции. Раса – группа людей, обладающих общими свойствами и признаками, обусловленными общими свойствами и признаками, обусловленными генетической конституцией, свободноскрещивающихся и дающих плодовитое потомство. Рецессивный ген – ген, проявление которого подавляется другими аллелями данного гена. Рибосома – органоид цитоплазмы, состоящий из большой и малой субчастиц, на которой происходит синтез полипептида. РНК – рибонуклеиновые кислоты – одноцепочные полимерные молекулы нуклеиновых кислот, участвующие в процессах биосинтеза белка. Сайт – участок молекулы нуклеиновой кислоты. Фенокопии – ненаследственное изменение фенотипа, сходное с проявлением определенных мутаций. Фенотип – совокупность внешних признаков организма на данном этапе онтогенеза, формирующихся в результате взаимодействия генотипа и внешней среды. Фертильность – плодовитость. Хроматин – представляет собой молекулу ДНК в комплексе с блоками- гистонами. В результате конденсации размеры ДНК уменьшаются, что приводит к образованию хромосом. Хроматиды – субъединицы редуплицированной хромосомы, будущие хромосомы. Хромосомы – суборганоиды ядра, видимые в период деления клетки, имеют определенную формулу и структуру, содержат большое число генов, способны к самовоспроизведению. Эукариоты – организмы, клетки которых имеют ядро, окруженное мембраной. Ядро – жизненно важный органоид эукариотических клеток, особенностью которого является наличие генетического материала (ДНК). Яйцеклетка – половая клетка, образующаяся в гаметогенезе у женщин. 41 42

Страница не найдена |

Страница не найдена |

---

---

404. Страница не найдена

Архив за месяц

ПнВтСрЧтПтСбВс

27282930   

       

       

       

     12

       

     12

       

      1

3031     

     12

       

15161718192021

       

25262728293031

       

    123

45678910

       

     12

17181920212223

31      

2728293031  

       

      1

       

   1234

567891011

       

     12

       

891011121314

       

11121314151617

       

28293031   

       

   1234

       

     12

       

  12345

6789101112

       

567891011

12131415161718

19202122232425

       

3456789

17181920212223

24252627282930

       

  12345

13141516171819

20212223242526

2728293031  

       

15161718192021

22232425262728

2930     

       

Архивы

Метки

Настройки
для слабовидящих

Honey Bee Genetics — PerfectBee

Клоны без сыновей и самцы без отца

Давайте сразу перейдем к делу — пчелиная генетика просто странная !

Большинство из нас слышали о важности генов, о том, как мать и отец вносят свой важный элемент, и так далее. Мы безоговорочно принимаем, что мать вносит хромосомы из своей яйцеклетки, а отец — из своей спермы. Большая часть животного мира работает с этими принципами.

Но это не относится к медоносным пчелам .

Но это не относится к медоносным пчелам . Они используют совершенно другой подход к передаче хромосом с некоторыми странными последствиями. Например, рассмотрим эти факты о трутнях, пчелах-самцах.

• У них нет отца
• У них есть дедушка
• Они могут быть отцами дочерям, внучкам и внукам
• У них не может быть сыновей

Запутались? Читать дальше…

Диплоид и гаплоид

Причина всей этой странности — система определения пола под названием гаплодиплоидия . В старших классах биологии нас учили, что все яйца оплодотворяются и дают потомство женского или мужского пола. Так обстоит дело, например, с людьми.

Но в любопытном мире медоносных пчел самец создан из неоплодотворенной яйцеклетки — просто яйцеклетка, отложенная маткой, но не оплодотворенная спермой. Самец пчелы обозначается как hapliod .Процесс воспроизводства из неоплодотворенных яиц называется партеногенез .

Более знакомая ситуация, когда матка оплодотворяет яйцеклетку спермой, в результате получается самка пчелы. Значит, яйцу суждено быть либо рабочим, либо пчелиной маткой. Самки медоносных пчел обозначаются как диплоидные .

Гаплоид или диплоид

Самцы пчел называются гаплоидами, а самки — диплоидами.

Если вы хотите подробнее изучить эту тему, посмотрите это видео от Джона Завислака из Университета Арканзаса, Отдел сельского хозяйства.

Влияние на гены

Итак, что все это означает с точки зрения передачи генов от поколения к поколению? Давайте рассмотрим в качестве основы сравнение людей.

Наши гены содержатся в хромосомах. Мы получаем 46 хромосом — 23 от матери и 23 от отца. Передача генов из поколения в поколение означает, что характеристики обеих сторон нашей семьи очевидны в нас и представлены такими факторами, как цвет глаз, рост и так далее. Это все потому, что мы являемся результатом яйцеклетки, внесенной нашей матерью, и спермы, внесенной нашим отцом .

В отношении пчел существует тот же основной принцип — , но только у пчел-самок .

Самки пчел появляются, когда матка откладывает яйцо, которое она затем оплодотворяет. Хотя числа пчел различаются (по сравнению с людьми), каждая сторона семьи имеет одинаковое количество хромосом (16).

Но это становится немного страннее, когда мы обращаемся к гаплоиду — дрону. Пчелы-самцы включают только хромосомы из яйца , так как они не были оплодотворены. Таким образом, дронов имеют всего 16 хромосом, все от королевы.

Подсчет хромосом

16 хромосом от королевы + 16 от сперматозоидов трутня = женщина (рабочий или королева). 16 от королевы + 0 от спермы трутня = самец (трутень).

Смешивание и клонирование

Яйца королевы содержат 16 хромосом. Таким образом, поскольку она сама имеет 32 хромосомы (помните, как женщина, у нее есть хромосомы и от матери, и от отца), она не может «втиснуть» все свои 32 хромосомы в каждое яйцо.Это означает, что яйцеклеток от королевы имеют множество комбинаций хромосом от королевы и дрона-донора спермы.

Сравните это с дроном. У него 16 хромосом, и его сперма может содержать точно такое же количество. Итак, сперматозоидов, созданных дроном, идентичны , поскольку все они имеют одинаковые 16 хромосом. Это составляет клонов для создания! Дроны производят клонов.

Преимущества генетического разнообразия

На этом увлекательном фоне давайте обратимся к проблеме генетического разнообразия. Нельзя недооценивать важность разнообразия для пчел. Там, где генетическое разнообразие ограничено, все население потенциально уязвимо для одних и тех же болезней. Если один из них поразит население, это может иметь разрушительный эффект.

Для сравнения, в популяции со значительным генетическим разнообразием одно заболевание может поражать определенный процент популяции, но другие могут быть устойчивыми. Это означает, что генетическое разнообразие снижает вероятность катастрофического события, которое уничтожит всю колонию .

Распущенность королевы

Поведение королевы во время спаривания эволюционировало, чтобы способствовать такому разнообразию. Во время брачных полетов, в раннем возрасте, она будет спариваться со многими дронами . Поскольку эти дроны имеют различные генетические особенности, они предлагают генетическое разнообразие, которое хорошо послужит королеве и ее потомству.

Ее брачные полеты через несколько дней приведут к сбору спермы от 10-25 дронов . Она будет хранить эту сперму в своей сперматеке в течение многих лет.

Вернувшись домой — возможно, в ваш улей — она ​​начнет откладывать яйца, около 2000 в день. При этом она может оплодотворить каждую яйцеклетку, а может и не оплодотворить ее, таким образом определяя пол . Когда она оплодотворяет яйцеклетку, она черпает из большого «запаса» сперматозоидов свою сперматеку. Это означает, что у всех членов колонии одна и та же мать — королева, но у ее потомства женского пола разные отцы .

Ее беспилотное потомство будет иметь только мать, тогда как, если она оплодотворяет яйцеклетку, чтобы создать самку, она будет использовать сперму одного из множества различных потенциальных отцов.

Роль маточного молочка

При рассмотрении воспроизводства пчел интересно создание маток и рабочих. Оба, конечно же, самки, и поэтому у них есть хромосомы от матери (матки-яйцекладки) и отца (через сперму трутня).

Но что превращает плод оплодотворенного яйца в матку, а не в рабочую? Ответ заключался в кормлении маточным молочком — пищей, которой кормили всех личинок в течение первых трех дней.

В большинстве случаев кормление маточным молочком прекращается через три дня.В результате получится рабочий или дрон, в зависимости от того, было ли оплодотворено яйцо . Однако колония решит, когда ей понадобится новая королева. Когда это произойдет, личинка-самка будет продолжать кормиться маточным молочком после третьего дня.

Это меняет способ «маркировки» генов, то есть способ их развития. Вместо того, чтобы способствовать развитию генов, имеющих отношение к матке (как это часто предполагается), это происходит за счет ограничения рабочих генов.

Как пчелы делают матку?

Они продолжают кормить ее маточным молочком после третьего дня, когда она была личинкой! Постоянное кормление маточным молочком тормозит развитие генов, которые могут быть обнаружены у рабочей пчелы.Именно отсутствие этих генов у личинки женского пола приводит к появлению матки.

Как пчеловоды могут нанести вред популяции пчел

Как пчеловоды, нам нравится думать, что мы помогаем популяции пчел и, следовательно, всей планете. Однако рост числа пчеловодов сам по себе не означает улучшения ситуации. Без осознания это на самом деле может быть вредным .

Вот почему:

Как мы видели, генетическое разнообразие важно для любого вида. И все же пчеловоды — коммерческие или иные — нередко выращивают множество маток из одной генетической линии. Это сильно ограничивает генетическое разнообразие и, со временем, делает популяцию уязвимой перед неправильным заболеванием в неподходящее время, что может привести к опустошительным последствиям для населения .

Для более глубокого взгляда на эту тему, вот лекция Дебби Делани на Национальной выставке меда.

достижений и перспектив функционального анализа молекулярных и нейронных механизмов, лежащих в основе социального поведения

Abstract

Европейская медоносная пчела является модельным организмом для изучения социального поведения.Всесторонний анализ профилей дифференциальной экспрессии генов между мозгом пчел-кормилиц и собирателей или в грибовидных телах — структура мозга, связанная с обучением, памятью и мультимодальной сенсорной интеграцией — выявил гены-кандидаты, связанные с поведением медоносных пчел. Несмотря на накопление знаний о профилях экспрессии генов, связанных с поведением медоносных пчел, остается неясным, действительно ли эти гены регулируют социальное поведение медоносных пчел, отчасти из-за нехватки методов генетической манипуляции, доступных для применения к медоносным пчелам.В этом обзоре мы описываем генетические методы, применяемые для изучения медоносной пчелы, от классической прямой генетики до недавно разработанных методов модификации генов с использованием транспозона и CRISPR / Cas9. Затем мы обсудим будущий функциональный анализ с использованием этих генетических методов, нацеленных на гены, идентифицированные в предыдущем исследовании. Поскольку никаких конкретных генов или нейронов, уникальных для социальных насекомых, еще не обнаружено, дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, посредством всестороннего анализа грибовидных тел у остроконечных видов может предоставить интригующие цели для функционального анализа, а также понимание молекулярных структур. и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения.

Ключевые слова: медоносная пчела, генетика, социальное поведение, грибовидное тело, клетка Кеньона

1. Введение

Социальные животные живут группами и демонстрируют сложное социальное поведение, такое как разделение труда и общение между людьми [1]. Однако, как это поведение регулируется в мозгу социальных животных, остается в значительной степени неизвестным. Некоторые виды насекомых, называемые эусоциальными насекомыми, также демонстрируют весьма изощренное социальное поведение. В отличие от мозга млекопитающих, который относительно велик и имеет сложную структуру, у насекомых относительно небольшой и менее сложный мозг [2,3].Кроме того, социальный образ жизни насекомых легче наблюдать в лабораторных условиях, что позволяет проводить обширные исследования их поведения и лежащих в основе молекулярных механизмов. Европейская медоносная пчела ( Apis mellifera L.) — один из наиболее хорошо изученных видов с точки зрения взаимосвязи ген-поведение [4].

Как и другие эусоциальные насекомые, колония медоносных пчел содержит репродуктивные и не репродуктивные касты: только матка (репродуктивная каста) откладывает яйца, в то время как рабочие (не репродуктивная каста) — это произвольно бесплодные самки, занятые другими задачами, необходимыми для поддерживать активность колонии [5,6].В колонии рабочие заняты различными задачами, такими как очистка улья, уход за личинками, охрана улья от злоумышленников и добыча пищи, воды и смолы. Задачи, которыми заняты рабочие, частично меняются в зависимости от их возраста после выхода на работу [5,6]. Собиратели часто могут передавать информацию об источниках пищи (или новых местах гнезд в репродуктивном рое) своим товарищам по гнезду, используя танец виляния, символизированный инструмент коммуникации, который неизвестен другим животным [5,6,7].

Некоторые методы разведения были разработаны для использования в исследованиях медоносных пчел [8,9], что сделало медоносных пчел отличным экспериментальным животным для изучения социального поведения. Есть несколько исследований, которые продемонстрировали молекулярные механизмы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел [10,11,12,13]. Хотя в этих исследованиях эффективно использовались генетические и / или фармакологические методы, эффективность этих методов зависит от ткани, в которой экспрессируется ген-мишень, или от наличия агонистических или антагонистических лекарственных средств.Следовательно, для выяснения причинно-следственной связи между определенной молекулой, нейроном или областью мозга и социальным поведением медоносной пчелы были желательны эффективные, воспроизводимые и универсальные методы модификации генов, доступные для применения к медоносной пчеле. За последние несколько лет было разработано несколько эффективных методов манипуляции генами медоносных пчел. В этом обзоре мы описываем попытки выполнить функциональный анализ генов медоносных пчел, а также недавний прогресс в методах модификации генов, используемых в исследованиях медоносных пчел.Затем мы обсудим будущие перспективы анализа функций генов и нейронов медоносных пчел с использованием этих методов модификации генов.

2. Генетические методы, примененные к медоносной пчеле

2.1. Прямая генетика, использующая локусы количественных признаков

У плодовой мушки Drosophila melanogaster , установленного модельного организма, используемого в молекулярной биологии и нейробиологии, прямая генетика привела к идентификации генов, связанных с мутантными фенотипами [14]. В общем, идентификация генов, связанных с интересующими признаками, требует широкомасштабного фенотипического скрининга с использованием потомства животных, случайно мутировавших в результате химической или лучевой обработки.Однако у медоносной пчелы этот процесс затруднен, потому что в колонии только одна репродуктивная самка (матка) [5,6]. Эта уникальная, но вызывающая беспокойство характеристика делает сложным и трудоемким создание мутантных штаммов с применением методов прямой генетики, хотя после создания мутантных штаммов наличие одной репродуктивной самки может быть потенциально благоприятным, поскольку это может привести к созданию клона генетически идентичного мутантного потомства. .

В некоторых исследованиях предпринимались попытки идентифицировать области генома, связанные с количественными различиями в поведении между колониями [15,16,17,18,19,20,21].Путем строгого контроля спаривания эти исследования идентифицировали локусы количественных признаков (QTL), связанные с количественными различиями в интересующих признаках, например, предпочтение пыльцы [15,16,18], начало поиска пищи [17], защитное поведение [18]. , 19], бесплодие рабочих [20] и размер яичников [21]. Поскольку идентифицированные области генома содержат много генов, необходимо провести обратный генетический анализ, чтобы сделать вывод, что гены-кандидаты, присутствующие в предполагаемой области генома, действительно связаны с интересующим признаком.

2.2. Исследование генов-кандидатов с помощью транскриптомных подходов

В колонии медоносных пчел десятки тысяч рабочих демонстрируют социальное поведение. Поведение рабочих меняется примерно в соответствии с возрастом рабочего после взрыва, и их физиологическое состояние также изменяется в соответствии с их задачами [22,23,24,25]. Предполагая, что мозг пчел, занятых различными задачами, экспрессирует разные гены, связанные с регуляцией социального поведения, был проведен комплексный анализ с использованием микроматрицы кДНК для выявления дифференциально экспрессируемых генов в мозге рабочих, занятых выполнением различных задач или демонстрирующих разное поведение (недавно появившиеся , медсестра, охранник, строит ульи и собиратели) [26,27,28,29].Кроме того, выявлено сравнение генов, экспрессируемых в мозге во время развития у королевы, рабочего и трутня [30]. Эти гены могут, по крайней мере частично, способствовать разным поведенческим свойствам полов или женских каст. Использование этих всесторонних сравнительных анализов для идентификации дифференциально экспрессируемых генов полезно для изучения представляющих интерес генов-кандидатов, однако требуются дополнительные функциональные анализы, чтобы определить, действительно ли эти гены регулируют поведение медоносных пчел или индуцируются в результате такого поведения.

2.3. РНК-интерференция

Ингибирование экспрессии генов посредством РНК-интерференции (РНКи) применялось для анализа функции генов у многих видов животных, включая медоносную пчелу. Введение двухцепочечной РНК (дцРНК) или малой интерферирующей РНК (миРНК) в гемоцель взрослых рабочих снижает некоторое количество комплементарной мРНК. Например, экспрессия вителлогенина, предшественника белка желтка, который в основном экспрессируется в женском жировом теле у насекомых, ингибируется путем инъекции дцРНК в брюшную полость [31,32], и этот нокдаун побуждает рабочих рано кормиться [32]. .Предполагается, что взаимное подавление между вителлогенином и ювенильным гормоном (ЮГ), которое способствует поведенческому развитию [10,33,34], контролирует время смены поведения у медоносной пчелы [35]. РНКи также использовались для подавления экспрессии генов в мозге медоносной пчелы [36,37,38,39]. Эти исследования продемонстрировали, что нокдаун генов, связанных с нейронными функциями, нарушает формирование памяти и / или препятствует ее восстановлению. Однако эффективность индуцированного РНКи подавления экспрессии гена варьируется в зависимости от ткани, в которой экспрессируется целевой ген.Экспрессия вителлогенина в брюшной полости рабочих почти теряется после инъекции дцРНК [22,31,32], и это ингибирование длится в течение периода времени, достаточного для изменения экспрессии генов и поведения, регулируемых вителлогенином [12,22,32, 40]. С другой стороны, подавление экспрессии генов в головном мозге обнаруживается только в течение 24 часов после инъекции дцРНК или миРНК [36,37,38]. Торможение восстанавливается через 48 ч после лечения [37,38]. Хотя подавления достаточно для оценки функций генов в обучении и памяти у медоносной пчелы, уменьшение мРНК в мозге меньше (снижение уровня мРНК или белка примерно на 30–60%), чем в жировом теле.Различная эффективность подавления может быть обусловлена, по крайней мере частично, тканезависимым захватом дцРНК и миРНК [41]. Учитывая, что гетерозиготные мутанты, у которых один из двух аллелей дикого типа мутирован и, таким образом, количество соответствующей мРНК снижается примерно на 50%, обычно не обнаруживают какого-либо фенотипа у Drosophila [14], кажется сбивающим с толку то, что наблюдались поведенческие дефекты. у пчел, получавших РНКи, нацеливающие гены, экспрессируемые в головном мозге, даже когда эффективность РНКи-индуцированного подавления экспрессии генов составляла около 50%.Возможно, степень подавления различается в каждой ячейке; т.е. некоторые клетки демонстрируют фенотипы дикого типа с уровнем экспрессии целевого гена более 50%, в то время как другие клетки демонстрируют дефекты с уровнем экспрессии менее 50%, и в целом индивидуумы, обработанные РНКи, демонстрируют дефектные фенотипы.

Вместо инъекции РНК в гемоцели пероральное введение дцРНК (кормовая РНКи) использовалось для подавления экспрессии генов-мишеней у медоносной пчелы [42,43,44,45]. Хотя для кормления РНКи часто требуется большое количество дцРНК, этот метод является менее инвазивным и менее трудоемким, а также имеет относительно длительный эффект молчания у взрослых медоносных пчел [44,45].Кроме того, Maori et al. (2019) сообщили, что дцРНК передавалась от взрослых рабочих, которые потребляли раствор сахарозы, содержащего дцРНК, личинкам, которые принимали пищу личинок, секретируемую взрослыми рабочими, получавшими дцРНК [46]. Эффект трансгенерации РНКи продолжался до взрослой стадии после эклозии [46]. Однако, насколько нам известно, нет сообщений о том, что кормящая РНКи использовалась для подавления экспрессии генов в головном мозге. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности и действенности этих методов функционального анализа генов, экспрессируемых в мозге медоносной пчелы.

2.4. Трансфекция внешней ДНК

Несколько групп сообщили об успешной плазмидной трансфекции медоносной пчелы. Робинсон и др. (2000) предприняли попытку трансфекции линеаризованной плазмиды, смешанной со спермой, в оплодотворенные яйцеклетки путем искусственного осеменения девственных маток, и сообщили, что внешняя ДНК размножалась по крайней мере в течение трех поколений, хотя интеграция трансфицированной ДНК в геном не была обнаружена [47 ]. Kunieda et al. (2004) и Schulte et al. (2013) использовали электропорацию для трансфекции плазмиды в мозг медоносной пчелы [48,49].Они подтвердили экспрессию внешнего гена (зеленый флуоресцентный белок : GFP ) в мозге трансфицированных пчел с помощью иммуноблоттинга или иммуногистохимии с использованием антитела против GFP [48,49]. Трансфекция с помощью бакуловируса — ДНК-вируса, который в основном поражает чешуекрылых насекомых — также применялась к медоносной пчеле [50,51]. Ando et al. (2007) обнаружили экспрессию GFP у личинок и куколок, инфицированных бакуловирусом [50]. Икеда и др. (2011) инфицировали маток бакуловирусом, несущим модифицированные внутренние гены вируса, и наблюдали тканезависимую экспрессию GFP [51].Однако методы, использованные в этих новаторских исследованиях, не применялись для функционального анализа генов и / или нейронов, вероятно, из-за их высокоинвазивных процедур и / или сложности нацеливания на конкретные ткани или органы.

2,5. Трансгенез с использованием транспозона piggyBac

Транспозоны ДНК, мобильные элементы ДНК, которые изменяют свое положение в геноме хозяина с помощью транспозазы, были использованы для трансгенеза у насекомых. Одним из наиболее часто используемых транспозонов у насекомых является элемент P, который был обнаружен у Drosophila [52] и использован для создания трансгенных D.melanogaster [53,54]. В отличие от элемента P, который избирательно используется в Drosophila , другой транспозон ДНК, piggyBac , широко используется для трансгенеза у нескольких отрядов насекомых [55,56,57,58,59]. Schulte et al. (2014) применили piggyBac для создания первой трансгенной медоносной пчелы [60]. Они вводили мРНК транспозазы piggyBac и плазмиды, полученные из piggyBac , содержащие внешние гены между инвертированными концевыми повторами piggyBac , в оплодотворенные яйца вскоре после откладки яиц, заставляя вылупившихся личинок дифференцироваться в маток, вводя их в колонию без маток.Некоторые из этих маток откладывали неоплодотворенные яйца, которые превратились в трансгенных трутней (А). Schulte et al. также подтвердили, что внешние плазмидные последовательности стали интегрированными в геном этих дронов, и наблюдали флуоресценцию, происходящую от белка, кодируемого интегрированными плазмидными последовательностями [60]. Недавно Отте и др. (2018) сообщили о более высокой эффективности интеграции внешних последовательностей в геном за счет улучшения процедур инъекции и замены транспозазы на гиперактивную, кодон-оптимизированную транспозазу [61,62].Поскольку транспозон piggyBac интегрируется в геном почти случайным образом (сайт «TTAA»), возможно, что интеграция piggyBac случайно нарушает эндогенные гены и регуляторные последовательности, и поэтому необходимо исследовать некоторые трансгенные линии. Однако, если доступны соответствующие промоторы, трансгенез с использованием вектора piggyBac может быть полезным и простым методом манипуляции генами даже у медоносной пчелы.

Обзор процедур проведения функционального анализа с использованием методов модификации генов у медоносной пчелы.( A ) Процедуры получения мутантной / трансгенной медоносной пчелы путем скрещивания. Стрелки со сплошной линией указывают процессы, выполненные в предыдущих исследованиях. Стрелками с пунктирными линиями обозначены процессы, предложенные в предыдущих исследованиях, как будущие исследования. ( B ) Альтернативные методы анализа функций генов с использованием мозаичных рабочих (F0), искусственно выращенных из инъецированных яиц.

2.6. Нокаут гена путем редактирования генома

Методы редактирования генома недавно были применены для функционального анализа генов у различных организмов.В частности, CRISPR / Cas9 широко используется из-за его универсальности и простоты создания необходимых компонентов. Kohno et al. (2016) сообщили о первом применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел при производстве мутантных дронов [63]. В настоящее время имеется несколько отчетов о применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел, и были предложены две процедуры для анализа функции генов [63,64,65,66].

Kohno et al. (2016) и Коно и Кубо (2018) предложили функциональный анализ гена путем получения гомозиготных мутантных рабочих посредством искусственного оплодотворения (A) [63,64].Они сообщили о разработке фундаментальных методов создания мутантных дронов с использованием CRISPR / Cas9 впервые. В качестве целевого гена они выбрали mrjp1 ( основной белок маточного молочка 1 ), который кодирует основной белковый компонент маточного молочка, поскольку нокаут mrjp1 не должен был вызывать эмбриональную летальность [67]. В Kohno и Kubo (2018) они затем нацелены на ген, названный mKast (, связанный с клетками Kenyon среднего типа, преимущественно связанный с аррестином белок ), который избирательно экспрессируется во взрослом мозге среди частей тела рабочих и, таким образом, как ожидается, будет имеют функции, связанные с регулированием социального поведения [48].Они успешно произвели соматических мозаичных маток (F0) из обработанных геномом оплодотворенных яиц и мутантных трутней (F1) из этих мозаичных маток (F0). Им также удалось получить гетерозиготных мутантных рабочих (F2) от маток дикого типа, искусственно осемененных спермой, полученной от мутантных трутней (A). Эти исследования проложили путь к производству мутантных медоносных пчел и продемонстрировали возможность получения мутантных пчел путем искусственного спаривания в лабораторных условиях. Однако о производстве гомозиготных рабочих-мутантов еще не сообщалось, в основном из-за трудоемких и сложных процедур содержания пчелиных семей в закрытом помещении из-за юридических ограничений.Было разработано несколько протоколов домашнего пчеловодства, что затрудняет получение гомозиготных рабочих-мутантов. Дроны в колонии, помещенной в закрытую комнату, как правило, отвергаются до их появления или полового созревания [63], возможно, из-за неподходящего состояния колонии. Более того, колонии, содержащиеся в закрытом помещении, еще не смогли пережить зиму [63], что требует завершения производства гомозиготных рабочих-мутантов до наступления зимы или криоконсервации спермы от мутантных трутней в течение зимы.

Необходимо улучшить руководство по пчеловодству в помещении, включая процедуру производства половозрелых трутней.

Чтобы избежать этих трудоемких и сложных процедур, Roth et al. (2019) предложили функциональный анализ с использованием поколения F0 (B) [65]. Они резко повысили эффективность редактирования генома, изменив положение инъекции с заднего на переднее, где находится ядро ​​эмбриона на его самой ранней стадии [68]. Они также выбрали высокоэффективную направляющую РНК из нескольких кандидатов.Комбинация этих улучшений привела к достижению 100% -ной скорости мутации в поколении F0. Это было большим улучшением, учитывая, что уровень редактирования генома составлял приблизительно 10% в предыдущих исследованиях медоносных пчел с использованием CRISPR / Cas9 (оценка по доле мутантных дронов в поколении F1) [63,64]. Затем из инъецированных оплодотворенных яиц выращивали методами in vitro для превращения в рабочих [69,70] и анализировали фенотипы. Roth et al. (2019) показали, что как питание на личиночных стадиях, так и гены, участвующие в пути определения пола у насекомых, регулируют полифенизм размеров репродуктивного органа у самок пчел [65].Этот отчет был первым функциональным анализом с использованием мутантных пчелиных пчел. Xiao et al. (2019) также сообщили об высокоэффективном редактировании генома медоносной пчелы с использованием аналогичных методов [66]. Хотя они анализировали эмбрионы только до того, как они вылупились, они продемонстрировали, что этот метод эффективен для анализа функции генов.

3. К функциональному анализу молекулярных и нервных основ, лежащих в основе социального поведения медоносных пчел

Одной из целей применения генетических методов, особенно обратных генетических методов, может быть выяснение причинной связи между поведением и генами, описанной в Раздел 2.2. С другой стороны, гены, идентифицированные путем исследования генов, преимущественно экспрессируемых в области (ах) мозга, которая, как считается, связана с социальным поведением, также могут быть вероятными мишенями. В этом разделе мы кратко резюмируем свойство одной из этих областей мозга, грибовидного тела (МБ), у медоносных пчел и других перепончатокрылых насекомых. Затем мы обсуждаем будущее направление, чтобы выявить молекулярные и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел.

3.1. Грибное тело медоносной пчелы: профили экспрессии генов и сравнение у перепончатокрылых насекомых

Считается, что у медоносной пчелы грибовидные тела (МБ), высший центр мозга насекомых, связаны с регуляцией социального поведения [71].МБ представляют собой парные структуры в мозгу насекомых, а МБ медоносных пчел имеют две входные области, называемые чашечками. Сомы внутренних нейронов MB, клетки Kenyon (KCs), расположены внутри чашечек и проецируют дендриты и аксоны в чашечки и ножки, соответственно (A). MBs участвуют в обучении и памяти, а также в мультимодальной обработке информации у некоторых видов насекомых, включая Drosophila [72,73,74,75,76,77,78,79]. Кроме того, доля нейропиля в МБ изменяется в зависимости от возраста и опыта, что указывает на возможную функцию МБ в возрастных задачах работника [80,81,82,83].Гены, которые преимущественно экспрессируются в МБ медоносных пчел, были идентифицированы посредством исчерпывающих исследований [84,85] (для обзора см. [86,87]). Анализ экспрессии этих MB-предпочтительных генов в мозге медоносных пчел показал, что KC делятся на несколько подтипов, и предполагается, что каждый подтип выполняет разные функции в регуляции поведения [86,87]. Ближайший ранний ген, экспрессия которого индуцируется в активированных нейронах, экспрессируется в MB после полета за пищей, что дополнительно поддерживает связь между MB и добычей пищи.

Резюме сравнительных анализов грибовидных тел (МБ) у перепончатокрылых насекомых. ( A ) Схематические чертежи компонентов пчелиных МБ. Субкомпартменты входной области МБ показаны на левой (боковой) чашечке. Подтипы KC класса I, сомы которых расположены внутри чашечки MB, показаны на правой (медиальной) чашечке. ( B ) Простое филогенное дерево для трех основных групп перепончатокрылых: Symphyta, Parasitica и Aculeata (верхняя часть), а также структурные характеристики МБ соответствующих видов (средняя и нижняя части).Сложные чашечки MB наблюдаются у Apocrita, но не у Symphyta. С другой стороны, количество подтипов KC класса I увеличилось с одного у Symphyta до двух у Parasitica и трех у Aculeata. Рисунки в средней части цитируются из [86], а рисунки в нижней части — из [88] с некоторыми изменениями.

Сравнение МБ среди перепончатокрылых насекомых, которые различаются реперторией поведения, выявило корреляцию между эволюцией поведения и МБ у перепончатокрылых насекомых.Сравнительные исследования обонятельных трактов в высшие центры мозга или морфологии входной области в МБ (чашечки; A) с использованием различных видов перепончатокрылых насекомых были проведены для выявления возможных нейронных цепей, связанных с социальностью [78,89]. Эти исследования показали, что одиночные паразитоидные осы (Parasitica) уже развили сложные структуры мозга, подобные Aculeata, которые демонстрируют поведение nidification (строительство гнезда) (B), и, таким образом, взаимосвязь между социальным поведением и структурами мозга остается неясной.Oya et al. (2017) сосредоточились на подтипах KC класса I, чьи соматы локализованы внутри чашечек MB и имеют различные профили экспрессии генов (A) [86,87,88]. Они использовали ген ( родственный тахикинину пептид ; Trp ), который дифференциально экспрессируется среди различных подтипов KC в мозге медоносной пчелы [90] в качестве маркерного гена подтипа KC, и сравнили профили экспрессии гомологов Trp в мозге пчел. различные перепончатокрылые насекомые (B) [88]. Oya et al. (2017) обнаружили, что количество подтипов KC постепенно увеличивается в связи с эволюцией поведения; один подтип одиночного пилильщика-фитофага (Symphyta), два подтипа одиночного паразитоидного оса (Parasitica) и три подтипа одиночного / эусоциального пилильщика Aculeata (B).Их исследование было первым, кто выявил нейронные характеристики, которые отличают Aculeata от других примитивных перепончатокрылых насекомых.

3.2. Исследование и функциональный анализ генов / нейронов, связанных с социальным поведением у перепончатокрылых насекомых

Как описано выше, знания о профилях экспрессии генов, которые, как считается, связаны с социальным поведением медоносных пчел, накапливаются. Связаны ли эти гены с регуляцией социального поведения медоносной пчелы и как нейроны, экспрессирующие эти гены, регулируют сложное поведение, не выяснено из-за нехватки эффективных методов модификации генов для применения к медоносной пчеле.Функциональный анализ путем нокаута генов, по-разному экспрессируемых в мозгу пчел-кормилиц и пчел-собирателей, или генов, экспрессируемых в определенных подтипах KC, может пролить свет на причинную связь между генами, экспрессируемыми в мозге, и социальным поведением медоносной пчелы. Некоторые гены, идентифицированные до сих пор, принадлежат к пути передачи сигналов экдизона или JH [29,91] и, таким образом, связаны с развитием или метаморфозом [92], что делает их нокаут с высокой вероятностью привести к летальному исходу в процессе развития, что помешало бы анализу. их функции в мозге и поведения у взрослых.Следовательно, методы подавления этих генов специфическим для мозга взрослого человека способом с использованием кормления РНКи (раздел 2.3) или трансгенеза с использованием piggyBac для индукции экспрессии shРНК под действием промотора тканеспецифичных генов (трансгенный рабочий (F2) в A ), необходимо применять во избежание аномалий развития [93]. Недавно сообщалось о методах подделки с использованием CRISPR / Cas9 для некоторых видов насекомых [94,95,96,97]. Альтернативным методом могло бы быть применение этих методов к медоносной пчеле для вставки донорской ДНК в целевые области генома, например, под промотором генов, предпочтительно экспрессируемых в KC.

Если определенные гены и / или нейроны обнаруживаются только у эусоциальных насекомых, они могут быть интересными целями для функционального анализа социального поведения. Kapheim et al. (2015) сравнили геномы 10 видов пчел с разной социальной сложностью и сообщили, что, хотя генные сети более сложны у социальных насекомых, у пчел, которые независимо развили эусоциальность, не было обнаружено консервативной эволюции определенных молекул [98]. Oya et al. (2017) сообщили, что три подтипа KC коррелируют с приобретением nidification у Aculeata (Hymenoptera).Aculeata включает виды от одиночных до продвинутых эусоциальных видов, однако молекулярные и нервные основы, которые присутствуют только у эусоциальных насекомых или медоносных пчел среди остроконечных насекомых, не описаны. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение «социальных генов / нейронов-кандидатов» посредством более полных сравнений подтипов KC у остроконечных видов. Неизвестно, есть ли другие субпопуляции нейронов в известных подтипах KC. Schatton и Scharff (2017) сообщили, что FoxP , который является гомологом человеческого FoxP2 , связанного с языковыми дефектами у людей [99], экспрессируется в ограниченной области в МБ медоносных пчел [100].Интересно, что FoxP экспрессируется в субпопуляции KC большого типа (в [100] авторы сообщили, что FoxP экспрессируется в KC среднего типа. Однако, поскольку KC среднего типа характеризуются преимущественной экспрессией из mKast , гена-маркера для KC среднего типа [87,101], здесь мы называем FoxP-экспрессирующие клетки KC большого типа). Этот вывод указывает на то, что должна быть другая классификация KC. Сравнение этих новых субпопуляций KCs между родственными видами может выявить нейронные и / или молекулярные субстраты, участвующие в социальном поведении.Недавно разработанные технологии, такие как одноклеточная RNA-Seq [102,103,104], вероятно, будут полезны для всесторонней идентификации субпопуляций KC у медоносных пчел и генов, предпочтительно экспрессируемых в каждой субпопуляции. Путем трансгенеза с использованием piggyBac или нокаута с использованием CRISPR / Cas9 можно управлять экспрессией генов в конкретных нейронах, если доступны соответствующие промоторы для управления экспрессией короткой шпильки РНК в интересующих клетках [93]. Кроме того, наблюдение или манипулирование нейронной активностью с помощью визуализации кальция и оптогенетики, соответственно, также будет полезно для выяснения причинной связи между нейронами и поведением [105,106].В будущем можно будет проверить, регулируют ли эти гены-кандидаты или нейроны социальное поведение с помощью этих методов. Поскольку эти методы трансгенеза или «нокаута» эффективны даже в поколении F1 (гетерозиготные рабочие; A), производство трансгенных медоносных пчел может быть достигнуто с относительно меньшими трудозатратами [60].

4. Выводы

Несмотря на обширные исследования, причинно-следственная связь между генами / нейронами мозга и социальным поведением медоносной пчелы еще не была продемонстрирована с использованием генетических методов.Недавнее радикальное усовершенствование инструментов для генетических исследований позволит преодолеть застой в функциональном анализе генов / нейронов медоносной пчелы. Помимо анализа идентифицированных в настоящее время генов-кандидатов / нейронов, было бы полезно дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, с использованием новых технологий.

Число видов, геном которых был секвенирован, увеличивается, и сообщалось о функциональных анализах с использованием перепончатокрылых насекомых, помимо медоносной пчелы.Сообщалось о генных манипуляциях пилильщика, Athalia rosae , который принадлежит к основной группе перепончатокрылых, Symphyta, и паразитоидной осы, Nasonia vitripennis (Apocrita) [57,107,108]. У муравьев (Formicidae), которые развили эусоциальность независимо от медоносной пчелы, поведенческая и развивающая функция orco , которая важна для функции пахучих рецепторов, была проанализирована с помощью CRISPR / Cas9 [109,110]. Будущее сравнение функций генов, регулирующих социальное поведение у медоносной пчелы, и ортологичных генов у этих примитивных перепончатокрылых насекомых или насекомых другого социального происхождения, позволит по-новому взглянуть на вклад молекулярных и нейронных изменений в эволюцию социального поведения у остроконечных насекомых.

Достижения и перспективы функционального анализа молекулярных и нейронных механизмов, лежащих в основе социального поведения

Аннотация

Европейская медоносная пчела является модельным организмом для изучения социального поведения. Всесторонний анализ профилей дифференциальной экспрессии генов между мозгом пчел-кормилиц и собирателей или в грибовидных телах — структура мозга, связанная с обучением, памятью и мультимодальной сенсорной интеграцией — выявил гены-кандидаты, связанные с поведением медоносных пчел.Несмотря на накопление знаний о профилях экспрессии генов, связанных с поведением медоносных пчел, остается неясным, действительно ли эти гены регулируют социальное поведение медоносных пчел, отчасти из-за нехватки методов генетической манипуляции, доступных для применения к медоносным пчелам. В этом обзоре мы описываем генетические методы, применяемые для изучения медоносной пчелы, от классической прямой генетики до недавно разработанных методов модификации генов с использованием транспозона и CRISPR / Cas9.Затем мы обсудим будущий функциональный анализ с использованием этих генетических методов, нацеленных на гены, идентифицированные в предыдущем исследовании. Поскольку никаких конкретных генов или нейронов, уникальных для социальных насекомых, еще не обнаружено, дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, посредством всестороннего анализа грибовидных тел у остроконечных видов может предоставить интригующие цели для функционального анализа, а также понимание молекулярных структур. и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения.

Ключевые слова: медоносная пчела, генетика, социальное поведение, грибовидное тело, клетка Кеньона

1.Введение

Социальные животные живут группами и демонстрируют сложное социальное поведение, такое как разделение труда и общение между людьми [1]. Однако, как это поведение регулируется в мозгу социальных животных, остается в значительной степени неизвестным. Некоторые виды насекомых, называемые эусоциальными насекомыми, также демонстрируют весьма изощренное социальное поведение. В отличие от мозга млекопитающих, который относительно велик и имеет сложную структуру, у насекомых относительно небольшой и менее сложный мозг [2,3].Кроме того, социальный образ жизни насекомых легче наблюдать в лабораторных условиях, что позволяет проводить обширные исследования их поведения и лежащих в основе молекулярных механизмов. Европейская медоносная пчела ( Apis mellifera L.) — один из наиболее хорошо изученных видов с точки зрения взаимосвязи ген-поведение [4].

Как и другие эусоциальные насекомые, колония медоносных пчел содержит репродуктивные и не репродуктивные касты: только матка (репродуктивная каста) откладывает яйца, в то время как рабочие (не репродуктивная каста) — это произвольно бесплодные самки, занятые другими задачами, необходимыми для поддерживать активность колонии [5,6].В колонии рабочие заняты различными задачами, такими как очистка улья, уход за личинками, охрана улья от злоумышленников и добыча пищи, воды и смолы. Задачи, которыми заняты рабочие, частично меняются в зависимости от их возраста после выхода на работу [5,6]. Собиратели часто могут передавать информацию об источниках пищи (или новых местах гнезд в репродуктивном рое) своим товарищам по гнезду, используя танец виляния, символизированный инструмент коммуникации, который неизвестен другим животным [5,6,7].

Некоторые методы разведения были разработаны для использования в исследованиях медоносных пчел [8,9], что сделало медоносных пчел отличным экспериментальным животным для изучения социального поведения. Есть несколько исследований, которые продемонстрировали молекулярные механизмы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел [10,11,12,13]. Хотя в этих исследованиях эффективно использовались генетические и / или фармакологические методы, эффективность этих методов зависит от ткани, в которой экспрессируется ген-мишень, или от наличия агонистических или антагонистических лекарственных средств.Следовательно, для выяснения причинно-следственной связи между определенной молекулой, нейроном или областью мозга и социальным поведением медоносной пчелы были желательны эффективные, воспроизводимые и универсальные методы модификации генов, доступные для применения к медоносной пчеле. За последние несколько лет было разработано несколько эффективных методов манипуляции генами медоносных пчел. В этом обзоре мы описываем попытки выполнить функциональный анализ генов медоносных пчел, а также недавний прогресс в методах модификации генов, используемых в исследованиях медоносных пчел.Затем мы обсудим будущие перспективы анализа функций генов и нейронов медоносных пчел с использованием этих методов модификации генов.

2. Генетические методы, примененные к медоносной пчеле

2.1. Прямая генетика, использующая локусы количественных признаков

У плодовой мушки Drosophila melanogaster , установленного модельного организма, используемого в молекулярной биологии и нейробиологии, прямая генетика привела к идентификации генов, связанных с мутантными фенотипами [14]. В общем, идентификация генов, связанных с интересующими признаками, требует широкомасштабного фенотипического скрининга с использованием потомства животных, случайно мутировавших в результате химической или лучевой обработки.Однако у медоносной пчелы этот процесс затруднен, потому что в колонии только одна репродуктивная самка (матка) [5,6]. Эта уникальная, но вызывающая беспокойство характеристика делает сложным и трудоемким создание мутантных штаммов с применением методов прямой генетики, хотя после создания мутантных штаммов наличие одной репродуктивной самки может быть потенциально благоприятным, поскольку это может привести к созданию клона генетически идентичного мутантного потомства. .

В некоторых исследованиях предпринимались попытки идентифицировать области генома, связанные с количественными различиями в поведении между колониями [15,16,17,18,19,20,21].Путем строгого контроля спаривания эти исследования идентифицировали локусы количественных признаков (QTL), связанные с количественными различиями в интересующих признаках, например, предпочтение пыльцы [15,16,18], начало поиска пищи [17], защитное поведение [18]. , 19], бесплодие рабочих [20] и размер яичников [21]. Поскольку идентифицированные области генома содержат много генов, необходимо провести обратный генетический анализ, чтобы сделать вывод, что гены-кандидаты, присутствующие в предполагаемой области генома, действительно связаны с интересующим признаком.

2.2. Исследование генов-кандидатов с помощью транскриптомных подходов

В колонии медоносных пчел десятки тысяч рабочих демонстрируют социальное поведение. Поведение рабочих меняется примерно в соответствии с возрастом рабочего после взрыва, и их физиологическое состояние также изменяется в соответствии с их задачами [22,23,24,25]. Предполагая, что мозг пчел, занятых различными задачами, экспрессирует разные гены, связанные с регуляцией социального поведения, был проведен комплексный анализ с использованием микроматрицы кДНК для выявления дифференциально экспрессируемых генов в мозге рабочих, занятых выполнением различных задач или демонстрирующих разное поведение (недавно появившиеся , медсестра, охранник, строит ульи и собиратели) [26,27,28,29].Кроме того, выявлено сравнение генов, экспрессируемых в мозге во время развития у королевы, рабочего и трутня [30]. Эти гены могут, по крайней мере частично, способствовать разным поведенческим свойствам полов или женских каст. Использование этих всесторонних сравнительных анализов для идентификации дифференциально экспрессируемых генов полезно для изучения представляющих интерес генов-кандидатов, однако требуются дополнительные функциональные анализы, чтобы определить, действительно ли эти гены регулируют поведение медоносных пчел или индуцируются в результате такого поведения.

2.3. РНК-интерференция

Ингибирование экспрессии генов посредством РНК-интерференции (РНКи) применялось для анализа функции генов у многих видов животных, включая медоносную пчелу. Введение двухцепочечной РНК (дцРНК) или малой интерферирующей РНК (миРНК) в гемоцель взрослых рабочих снижает некоторое количество комплементарной мРНК. Например, экспрессия вителлогенина, предшественника белка желтка, который в основном экспрессируется в женском жировом теле у насекомых, ингибируется путем инъекции дцРНК в брюшную полость [31,32], и этот нокдаун побуждает рабочих рано кормиться [32]. .Предполагается, что взаимное подавление между вителлогенином и ювенильным гормоном (ЮГ), которое способствует поведенческому развитию [10,33,34], контролирует время смены поведения у медоносной пчелы [35]. РНКи также использовались для подавления экспрессии генов в мозге медоносной пчелы [36,37,38,39]. Эти исследования продемонстрировали, что нокдаун генов, связанных с нейронными функциями, нарушает формирование памяти и / или препятствует ее восстановлению. Однако эффективность индуцированного РНКи подавления экспрессии гена варьируется в зависимости от ткани, в которой экспрессируется целевой ген.Экспрессия вителлогенина в брюшной полости рабочих почти теряется после инъекции дцРНК [22,31,32], и это ингибирование длится в течение периода времени, достаточного для изменения экспрессии генов и поведения, регулируемых вителлогенином [12,22,32, 40]. С другой стороны, подавление экспрессии генов в головном мозге обнаруживается только в течение 24 часов после инъекции дцРНК или миРНК [36,37,38]. Торможение восстанавливается через 48 ч после лечения [37,38]. Хотя подавления достаточно для оценки функций генов в обучении и памяти у медоносной пчелы, уменьшение мРНК в мозге меньше (снижение уровня мРНК или белка примерно на 30–60%), чем в жировом теле.Различная эффективность подавления может быть обусловлена, по крайней мере частично, тканезависимым захватом дцРНК и миРНК [41]. Учитывая, что гетерозиготные мутанты, у которых один из двух аллелей дикого типа мутирован и, таким образом, количество соответствующей мРНК снижается примерно на 50%, обычно не обнаруживают какого-либо фенотипа у Drosophila [14], кажется сбивающим с толку то, что наблюдались поведенческие дефекты. у пчел, получавших РНКи, нацеливающие гены, экспрессируемые в головном мозге, даже когда эффективность РНКи-индуцированного подавления экспрессии генов составляла около 50%.Возможно, степень подавления различается в каждой ячейке; т.е. некоторые клетки демонстрируют фенотипы дикого типа с уровнем экспрессии целевого гена более 50%, в то время как другие клетки демонстрируют дефекты с уровнем экспрессии менее 50%, и в целом индивидуумы, обработанные РНКи, демонстрируют дефектные фенотипы.

Вместо инъекции РНК в гемоцели пероральное введение дцРНК (кормовая РНКи) использовалось для подавления экспрессии генов-мишеней у медоносной пчелы [42,43,44,45]. Хотя для кормления РНКи часто требуется большое количество дцРНК, этот метод является менее инвазивным и менее трудоемким, а также имеет относительно длительный эффект молчания у взрослых медоносных пчел [44,45].Кроме того, Maori et al. (2019) сообщили, что дцРНК передавалась от взрослых рабочих, которые потребляли раствор сахарозы, содержащего дцРНК, личинкам, которые принимали пищу личинок, секретируемую взрослыми рабочими, получавшими дцРНК [46]. Эффект трансгенерации РНКи продолжался до взрослой стадии после эклозии [46]. Однако, насколько нам известно, нет сообщений о том, что кормящая РНКи использовалась для подавления экспрессии генов в головном мозге. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности и действенности этих методов функционального анализа генов, экспрессируемых в мозге медоносной пчелы.

2.4. Трансфекция внешней ДНК

Несколько групп сообщили об успешной плазмидной трансфекции медоносной пчелы. Робинсон и др. (2000) предприняли попытку трансфекции линеаризованной плазмиды, смешанной со спермой, в оплодотворенные яйцеклетки путем искусственного осеменения девственных маток, и сообщили, что внешняя ДНК размножалась по крайней мере в течение трех поколений, хотя интеграция трансфицированной ДНК в геном не была обнаружена [47 ]. Kunieda et al. (2004) и Schulte et al. (2013) использовали электропорацию для трансфекции плазмиды в мозг медоносной пчелы [48,49].Они подтвердили экспрессию внешнего гена (зеленый флуоресцентный белок : GFP ) в мозге трансфицированных пчел с помощью иммуноблоттинга или иммуногистохимии с использованием антитела против GFP [48,49]. Трансфекция с помощью бакуловируса — ДНК-вируса, который в основном поражает чешуекрылых насекомых — также применялась к медоносной пчеле [50,51]. Ando et al. (2007) обнаружили экспрессию GFP у личинок и куколок, инфицированных бакуловирусом [50]. Икеда и др. (2011) инфицировали маток бакуловирусом, несущим модифицированные внутренние гены вируса, и наблюдали тканезависимую экспрессию GFP [51].Однако методы, использованные в этих новаторских исследованиях, не применялись для функционального анализа генов и / или нейронов, вероятно, из-за их высокоинвазивных процедур и / или сложности нацеливания на конкретные ткани или органы.

2,5. Трансгенез с использованием транспозона piggyBac

Транспозоны ДНК, мобильные элементы ДНК, которые изменяют свое положение в геноме хозяина с помощью транспозазы, были использованы для трансгенеза у насекомых. Одним из наиболее часто используемых транспозонов у насекомых является элемент P, который был обнаружен у Drosophila [52] и использован для создания трансгенных D.melanogaster [53,54]. В отличие от элемента P, который избирательно используется в Drosophila , другой транспозон ДНК, piggyBac , широко используется для трансгенеза у нескольких отрядов насекомых [55,56,57,58,59]. Schulte et al. (2014) применили piggyBac для создания первой трансгенной медоносной пчелы [60]. Они вводили мРНК транспозазы piggyBac и плазмиды, полученные из piggyBac , содержащие внешние гены между инвертированными концевыми повторами piggyBac , в оплодотворенные яйца вскоре после откладки яиц, заставляя вылупившихся личинок дифференцироваться в маток, вводя их в колонию без маток.Некоторые из этих маток откладывали неоплодотворенные яйца, которые превратились в трансгенных трутней (А). Schulte et al. также подтвердили, что внешние плазмидные последовательности стали интегрированными в геном этих дронов, и наблюдали флуоресценцию, происходящую от белка, кодируемого интегрированными плазмидными последовательностями [60]. Недавно Отте и др. (2018) сообщили о более высокой эффективности интеграции внешних последовательностей в геном за счет улучшения процедур инъекции и замены транспозазы на гиперактивную, кодон-оптимизированную транспозазу [61,62].Поскольку транспозон piggyBac интегрируется в геном почти случайным образом (сайт «TTAA»), возможно, что интеграция piggyBac случайно нарушает эндогенные гены и регуляторные последовательности, и поэтому необходимо исследовать некоторые трансгенные линии. Однако, если доступны соответствующие промоторы, трансгенез с использованием вектора piggyBac может быть полезным и простым методом манипуляции генами даже у медоносной пчелы.

Обзор процедур проведения функционального анализа с использованием методов модификации генов у медоносной пчелы.( A ) Процедуры получения мутантной / трансгенной медоносной пчелы путем скрещивания. Стрелки со сплошной линией указывают процессы, выполненные в предыдущих исследованиях. Стрелками с пунктирными линиями обозначены процессы, предложенные в предыдущих исследованиях, как будущие исследования. ( B ) Альтернативные методы анализа функций генов с использованием мозаичных рабочих (F0), искусственно выращенных из инъецированных яиц.

2.6. Нокаут гена путем редактирования генома

Методы редактирования генома недавно были применены для функционального анализа генов у различных организмов.В частности, CRISPR / Cas9 широко используется из-за его универсальности и простоты создания необходимых компонентов. Kohno et al. (2016) сообщили о первом применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел при производстве мутантных дронов [63]. В настоящее время имеется несколько отчетов о применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел, и были предложены две процедуры для анализа функции генов [63,64,65,66].

Kohno et al. (2016) и Коно и Кубо (2018) предложили функциональный анализ гена путем получения гомозиготных мутантных рабочих посредством искусственного оплодотворения (A) [63,64].Они сообщили о разработке фундаментальных методов создания мутантных дронов с использованием CRISPR / Cas9 впервые. В качестве целевого гена они выбрали mrjp1 ( основной белок маточного молочка 1 ), который кодирует основной белковый компонент маточного молочка, поскольку нокаут mrjp1 не должен был вызывать эмбриональную летальность [67]. В Kohno и Kubo (2018) они затем нацелены на ген, названный mKast (, связанный с клетками Kenyon среднего типа, преимущественно связанный с аррестином белок ), который избирательно экспрессируется во взрослом мозге среди частей тела рабочих и, таким образом, как ожидается, будет имеют функции, связанные с регулированием социального поведения [48].Они успешно произвели соматических мозаичных маток (F0) из обработанных геномом оплодотворенных яиц и мутантных трутней (F1) из этих мозаичных маток (F0). Им также удалось получить гетерозиготных мутантных рабочих (F2) от маток дикого типа, искусственно осемененных спермой, полученной от мутантных трутней (A). Эти исследования проложили путь к производству мутантных медоносных пчел и продемонстрировали возможность получения мутантных пчел путем искусственного спаривания в лабораторных условиях. Однако о производстве гомозиготных рабочих-мутантов еще не сообщалось, в основном из-за трудоемких и сложных процедур содержания пчелиных семей в закрытом помещении из-за юридических ограничений.Было разработано несколько протоколов домашнего пчеловодства, что затрудняет получение гомозиготных рабочих-мутантов. Дроны в колонии, помещенной в закрытую комнату, как правило, отвергаются до их появления или полового созревания [63], возможно, из-за неподходящего состояния колонии. Более того, колонии, содержащиеся в закрытом помещении, еще не смогли пережить зиму [63], что требует завершения производства гомозиготных рабочих-мутантов до наступления зимы или криоконсервации спермы от мутантных трутней в течение зимы.

Необходимо улучшить руководство по пчеловодству в помещении, включая процедуру производства половозрелых трутней.

Чтобы избежать этих трудоемких и сложных процедур, Roth et al. (2019) предложили функциональный анализ с использованием поколения F0 (B) [65]. Они резко повысили эффективность редактирования генома, изменив положение инъекции с заднего на переднее, где находится ядро ​​эмбриона на его самой ранней стадии [68]. Они также выбрали высокоэффективную направляющую РНК из нескольких кандидатов.Комбинация этих улучшений привела к достижению 100% -ной скорости мутации в поколении F0. Это было большим улучшением, учитывая, что уровень редактирования генома составлял приблизительно 10% в предыдущих исследованиях медоносных пчел с использованием CRISPR / Cas9 (оценка по доле мутантных дронов в поколении F1) [63,64]. Затем из инъецированных оплодотворенных яиц выращивали методами in vitro для превращения в рабочих [69,70] и анализировали фенотипы. Roth et al. (2019) показали, что как питание на личиночных стадиях, так и гены, участвующие в пути определения пола у насекомых, регулируют полифенизм размеров репродуктивного органа у самок пчел [65].Этот отчет был первым функциональным анализом с использованием мутантных пчелиных пчел. Xiao et al. (2019) также сообщили об высокоэффективном редактировании генома медоносной пчелы с использованием аналогичных методов [66]. Хотя они анализировали эмбрионы только до того, как они вылупились, они продемонстрировали, что этот метод эффективен для анализа функции генов.

3. К функциональному анализу молекулярных и нервных основ, лежащих в основе социального поведения медоносных пчел

Одной из целей применения генетических методов, особенно обратных генетических методов, может быть выяснение причинной связи между поведением и генами, описанной в Раздел 2.2. С другой стороны, гены, идентифицированные путем исследования генов, преимущественно экспрессируемых в области (ах) мозга, которая, как считается, связана с социальным поведением, также могут быть вероятными мишенями. В этом разделе мы кратко резюмируем свойство одной из этих областей мозга, грибовидного тела (МБ), у медоносных пчел и других перепончатокрылых насекомых. Затем мы обсуждаем будущее направление, чтобы выявить молекулярные и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел.

3.1. Грибное тело медоносной пчелы: профили экспрессии генов и сравнение у перепончатокрылых насекомых

Считается, что у медоносной пчелы грибовидные тела (МБ), высший центр мозга насекомых, связаны с регуляцией социального поведения [71].МБ представляют собой парные структуры в мозгу насекомых, а МБ медоносных пчел имеют две входные области, называемые чашечками. Сомы внутренних нейронов MB, клетки Kenyon (KCs), расположены внутри чашечек и проецируют дендриты и аксоны в чашечки и ножки, соответственно (A). MBs участвуют в обучении и памяти, а также в мультимодальной обработке информации у некоторых видов насекомых, включая Drosophila [72,73,74,75,76,77,78,79]. Кроме того, доля нейропиля в МБ изменяется в зависимости от возраста и опыта, что указывает на возможную функцию МБ в возрастных задачах работника [80,81,82,83].Гены, которые преимущественно экспрессируются в МБ медоносных пчел, были идентифицированы посредством исчерпывающих исследований [84,85] (для обзора см. [86,87]). Анализ экспрессии этих MB-предпочтительных генов в мозге медоносных пчел показал, что KC делятся на несколько подтипов, и предполагается, что каждый подтип выполняет разные функции в регуляции поведения [86,87]. Ближайший ранний ген, экспрессия которого индуцируется в активированных нейронах, экспрессируется в MB после полета за пищей, что дополнительно поддерживает связь между MB и добычей пищи.

Резюме сравнительных анализов грибовидных тел (МБ) у перепончатокрылых насекомых. ( A ) Схематические чертежи компонентов пчелиных МБ. Субкомпартменты входной области МБ показаны на левой (боковой) чашечке. Подтипы KC класса I, сомы которых расположены внутри чашечки MB, показаны на правой (медиальной) чашечке. ( B ) Простое филогенное дерево для трех основных групп перепончатокрылых: Symphyta, Parasitica и Aculeata (верхняя часть), а также структурные характеристики МБ соответствующих видов (средняя и нижняя части).Сложные чашечки MB наблюдаются у Apocrita, но не у Symphyta. С другой стороны, количество подтипов KC класса I увеличилось с одного у Symphyta до двух у Parasitica и трех у Aculeata. Рисунки в средней части цитируются из [86], а рисунки в нижней части — из [88] с некоторыми изменениями.

Сравнение МБ среди перепончатокрылых насекомых, которые различаются реперторией поведения, выявило корреляцию между эволюцией поведения и МБ у перепончатокрылых насекомых.Сравнительные исследования обонятельных трактов в высшие центры мозга или морфологии входной области в МБ (чашечки; A) с использованием различных видов перепончатокрылых насекомых были проведены для выявления возможных нейронных цепей, связанных с социальностью [78,89]. Эти исследования показали, что одиночные паразитоидные осы (Parasitica) уже развили сложные структуры мозга, подобные Aculeata, которые демонстрируют поведение nidification (строительство гнезда) (B), и, таким образом, взаимосвязь между социальным поведением и структурами мозга остается неясной.Oya et al. (2017) сосредоточились на подтипах KC класса I, чьи соматы локализованы внутри чашечек MB и имеют различные профили экспрессии генов (A) [86,87,88]. Они использовали ген ( родственный тахикинину пептид ; Trp ), который дифференциально экспрессируется среди различных подтипов KC в мозге медоносной пчелы [90] в качестве маркерного гена подтипа KC, и сравнили профили экспрессии гомологов Trp в мозге пчел. различные перепончатокрылые насекомые (B) [88]. Oya et al. (2017) обнаружили, что количество подтипов KC постепенно увеличивается в связи с эволюцией поведения; один подтип одиночного пилильщика-фитофага (Symphyta), два подтипа одиночного паразитоидного оса (Parasitica) и три подтипа одиночного / эусоциального пилильщика Aculeata (B).Их исследование было первым, кто выявил нейронные характеристики, которые отличают Aculeata от других примитивных перепончатокрылых насекомых.

3.2. Исследование и функциональный анализ генов / нейронов, связанных с социальным поведением у перепончатокрылых насекомых

Как описано выше, знания о профилях экспрессии генов, которые, как считается, связаны с социальным поведением медоносных пчел, накапливаются. Связаны ли эти гены с регуляцией социального поведения медоносной пчелы и как нейроны, экспрессирующие эти гены, регулируют сложное поведение, не выяснено из-за нехватки эффективных методов модификации генов для применения к медоносной пчеле.Функциональный анализ путем нокаута генов, по-разному экспрессируемых в мозгу пчел-кормилиц и пчел-собирателей, или генов, экспрессируемых в определенных подтипах KC, может пролить свет на причинную связь между генами, экспрессируемыми в мозге, и социальным поведением медоносной пчелы. Некоторые гены, идентифицированные до сих пор, принадлежат к пути передачи сигналов экдизона или JH [29,91] и, таким образом, связаны с развитием или метаморфозом [92], что делает их нокаут с высокой вероятностью привести к летальному исходу в процессе развития, что помешало бы анализу. их функции в мозге и поведения у взрослых.Следовательно, методы подавления этих генов специфическим для мозга взрослого человека способом с использованием кормления РНКи (раздел 2.3) или трансгенеза с использованием piggyBac для индукции экспрессии shРНК под действием промотора тканеспецифичных генов (трансгенный рабочий (F2) в A ), необходимо применять во избежание аномалий развития [93]. Недавно сообщалось о методах подделки с использованием CRISPR / Cas9 для некоторых видов насекомых [94,95,96,97]. Альтернативным методом могло бы быть применение этих методов к медоносной пчеле для вставки донорской ДНК в целевые области генома, например, под промотором генов, предпочтительно экспрессируемых в KC.

Если определенные гены и / или нейроны обнаруживаются только у эусоциальных насекомых, они могут быть интересными целями для функционального анализа социального поведения. Kapheim et al. (2015) сравнили геномы 10 видов пчел с разной социальной сложностью и сообщили, что, хотя генные сети более сложны у социальных насекомых, у пчел, которые независимо развили эусоциальность, не было обнаружено консервативной эволюции определенных молекул [98]. Oya et al. (2017) сообщили, что три подтипа KC коррелируют с приобретением nidification у Aculeata (Hymenoptera).Aculeata включает виды от одиночных до продвинутых эусоциальных видов, однако молекулярные и нервные основы, которые присутствуют только у эусоциальных насекомых или медоносных пчел среди остроконечных насекомых, не описаны. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение «социальных генов / нейронов-кандидатов» посредством более полных сравнений подтипов KC у остроконечных видов. Неизвестно, есть ли другие субпопуляции нейронов в известных подтипах KC. Schatton и Scharff (2017) сообщили, что FoxP , который является гомологом человеческого FoxP2 , связанного с языковыми дефектами у людей [99], экспрессируется в ограниченной области в МБ медоносных пчел [100].Интересно, что FoxP экспрессируется в субпопуляции KC большого типа (в [100] авторы сообщили, что FoxP экспрессируется в KC среднего типа. Однако, поскольку KC среднего типа характеризуются преимущественной экспрессией из mKast , гена-маркера для KC среднего типа [87,101], здесь мы называем FoxP-экспрессирующие клетки KC большого типа). Этот вывод указывает на то, что должна быть другая классификация KC. Сравнение этих новых субпопуляций KCs между родственными видами может выявить нейронные и / или молекулярные субстраты, участвующие в социальном поведении.Недавно разработанные технологии, такие как одноклеточная RNA-Seq [102,103,104], вероятно, будут полезны для всесторонней идентификации субпопуляций KC у медоносных пчел и генов, предпочтительно экспрессируемых в каждой субпопуляции. Путем трансгенеза с использованием piggyBac или нокаута с использованием CRISPR / Cas9 можно управлять экспрессией генов в конкретных нейронах, если доступны соответствующие промоторы для управления экспрессией короткой шпильки РНК в интересующих клетках [93]. Кроме того, наблюдение или манипулирование нейронной активностью с помощью визуализации кальция и оптогенетики, соответственно, также будет полезно для выяснения причинной связи между нейронами и поведением [105,106].В будущем можно будет проверить, регулируют ли эти гены-кандидаты или нейроны социальное поведение с помощью этих методов. Поскольку эти методы трансгенеза или «нокаута» эффективны даже в поколении F1 (гетерозиготные рабочие; A), производство трансгенных медоносных пчел может быть достигнуто с относительно меньшими трудозатратами [60].

4. Выводы

Несмотря на обширные исследования, причинно-следственная связь между генами / нейронами мозга и социальным поведением медоносной пчелы еще не была продемонстрирована с использованием генетических методов.Недавнее радикальное усовершенствование инструментов для генетических исследований позволит преодолеть застой в функциональном анализе генов / нейронов медоносной пчелы. Помимо анализа идентифицированных в настоящее время генов-кандидатов / нейронов, было бы полезно дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, с использованием новых технологий.

Число видов, геном которых был секвенирован, увеличивается, и сообщалось о функциональных анализах с использованием перепончатокрылых насекомых, помимо медоносной пчелы.Сообщалось о генных манипуляциях пилильщика, Athalia rosae , который принадлежит к основной группе перепончатокрылых, Symphyta, и паразитоидной осы, Nasonia vitripennis (Apocrita) [57,107,108]. У муравьев (Formicidae), которые развили эусоциальность независимо от медоносной пчелы, поведенческая и развивающая функция orco , которая важна для функции пахучих рецепторов, была проанализирована с помощью CRISPR / Cas9 [109,110]. Будущее сравнение функций генов, регулирующих социальное поведение у медоносной пчелы, и ортологичных генов у этих примитивных перепончатокрылых насекомых или насекомых другого социального происхождения, позволит по-новому взглянуть на вклад молекулярных и нейронных изменений в эволюцию социального поведения у остроконечных насекомых.

Достижения и перспективы функционального анализа молекулярных и нейронных механизмов, лежащих в основе социального поведения

Аннотация

Европейская медоносная пчела является модельным организмом для изучения социального поведения. Всесторонний анализ профилей дифференциальной экспрессии генов между мозгом пчел-кормилиц и собирателей или в грибовидных телах — структура мозга, связанная с обучением, памятью и мультимодальной сенсорной интеграцией — выявил гены-кандидаты, связанные с поведением медоносных пчел.Несмотря на накопление знаний о профилях экспрессии генов, связанных с поведением медоносных пчел, остается неясным, действительно ли эти гены регулируют социальное поведение медоносных пчел, отчасти из-за нехватки методов генетической манипуляции, доступных для применения к медоносным пчелам. В этом обзоре мы описываем генетические методы, применяемые для изучения медоносной пчелы, от классической прямой генетики до недавно разработанных методов модификации генов с использованием транспозона и CRISPR / Cas9.Затем мы обсудим будущий функциональный анализ с использованием этих генетических методов, нацеленных на гены, идентифицированные в предыдущем исследовании. Поскольку никаких конкретных генов или нейронов, уникальных для социальных насекомых, еще не обнаружено, дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, посредством всестороннего анализа грибовидных тел у остроконечных видов может предоставить интригующие цели для функционального анализа, а также понимание молекулярных структур. и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения.

Ключевые слова: медоносная пчела, генетика, социальное поведение, грибовидное тело, клетка Кеньона

1.Введение

Социальные животные живут группами и демонстрируют сложное социальное поведение, такое как разделение труда и общение между людьми [1]. Однако, как это поведение регулируется в мозгу социальных животных, остается в значительной степени неизвестным. Некоторые виды насекомых, называемые эусоциальными насекомыми, также демонстрируют весьма изощренное социальное поведение. В отличие от мозга млекопитающих, который относительно велик и имеет сложную структуру, у насекомых относительно небольшой и менее сложный мозг [2,3].Кроме того, социальный образ жизни насекомых легче наблюдать в лабораторных условиях, что позволяет проводить обширные исследования их поведения и лежащих в основе молекулярных механизмов. Европейская медоносная пчела ( Apis mellifera L.) — один из наиболее хорошо изученных видов с точки зрения взаимосвязи ген-поведение [4].

Как и другие эусоциальные насекомые, колония медоносных пчел содержит репродуктивные и не репродуктивные касты: только матка (репродуктивная каста) откладывает яйца, в то время как рабочие (не репродуктивная каста) — это произвольно бесплодные самки, занятые другими задачами, необходимыми для поддерживать активность колонии [5,6].В колонии рабочие заняты различными задачами, такими как очистка улья, уход за личинками, охрана улья от злоумышленников и добыча пищи, воды и смолы. Задачи, которыми заняты рабочие, частично меняются в зависимости от их возраста после выхода на работу [5,6]. Собиратели часто могут передавать информацию об источниках пищи (или новых местах гнезд в репродуктивном рое) своим товарищам по гнезду, используя танец виляния, символизированный инструмент коммуникации, который неизвестен другим животным [5,6,7].

Некоторые методы разведения были разработаны для использования в исследованиях медоносных пчел [8,9], что сделало медоносных пчел отличным экспериментальным животным для изучения социального поведения. Есть несколько исследований, которые продемонстрировали молекулярные механизмы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел [10,11,12,13]. Хотя в этих исследованиях эффективно использовались генетические и / или фармакологические методы, эффективность этих методов зависит от ткани, в которой экспрессируется ген-мишень, или от наличия агонистических или антагонистических лекарственных средств.Следовательно, для выяснения причинно-следственной связи между определенной молекулой, нейроном или областью мозга и социальным поведением медоносной пчелы были желательны эффективные, воспроизводимые и универсальные методы модификации генов, доступные для применения к медоносной пчеле. За последние несколько лет было разработано несколько эффективных методов манипуляции генами медоносных пчел. В этом обзоре мы описываем попытки выполнить функциональный анализ генов медоносных пчел, а также недавний прогресс в методах модификации генов, используемых в исследованиях медоносных пчел.Затем мы обсудим будущие перспективы анализа функций генов и нейронов медоносных пчел с использованием этих методов модификации генов.

2. Генетические методы, примененные к медоносной пчеле

2.1. Прямая генетика, использующая локусы количественных признаков

У плодовой мушки Drosophila melanogaster , установленного модельного организма, используемого в молекулярной биологии и нейробиологии, прямая генетика привела к идентификации генов, связанных с мутантными фенотипами [14]. В общем, идентификация генов, связанных с интересующими признаками, требует широкомасштабного фенотипического скрининга с использованием потомства животных, случайно мутировавших в результате химической или лучевой обработки.Однако у медоносной пчелы этот процесс затруднен, потому что в колонии только одна репродуктивная самка (матка) [5,6]. Эта уникальная, но вызывающая беспокойство характеристика делает сложным и трудоемким создание мутантных штаммов с применением методов прямой генетики, хотя после создания мутантных штаммов наличие одной репродуктивной самки может быть потенциально благоприятным, поскольку это может привести к созданию клона генетически идентичного мутантного потомства. .

В некоторых исследованиях предпринимались попытки идентифицировать области генома, связанные с количественными различиями в поведении между колониями [15,16,17,18,19,20,21].Путем строгого контроля спаривания эти исследования идентифицировали локусы количественных признаков (QTL), связанные с количественными различиями в интересующих признаках, например, предпочтение пыльцы [15,16,18], начало поиска пищи [17], защитное поведение [18]. , 19], бесплодие рабочих [20] и размер яичников [21]. Поскольку идентифицированные области генома содержат много генов, необходимо провести обратный генетический анализ, чтобы сделать вывод, что гены-кандидаты, присутствующие в предполагаемой области генома, действительно связаны с интересующим признаком.

2.2. Исследование генов-кандидатов с помощью транскриптомных подходов

В колонии медоносных пчел десятки тысяч рабочих демонстрируют социальное поведение. Поведение рабочих меняется примерно в соответствии с возрастом рабочего после взрыва, и их физиологическое состояние также изменяется в соответствии с их задачами [22,23,24,25]. Предполагая, что мозг пчел, занятых различными задачами, экспрессирует разные гены, связанные с регуляцией социального поведения, был проведен комплексный анализ с использованием микроматрицы кДНК для выявления дифференциально экспрессируемых генов в мозге рабочих, занятых выполнением различных задач или демонстрирующих разное поведение (недавно появившиеся , медсестра, охранник, строит ульи и собиратели) [26,27,28,29].Кроме того, выявлено сравнение генов, экспрессируемых в мозге во время развития у королевы, рабочего и трутня [30]. Эти гены могут, по крайней мере частично, способствовать разным поведенческим свойствам полов или женских каст. Использование этих всесторонних сравнительных анализов для идентификации дифференциально экспрессируемых генов полезно для изучения представляющих интерес генов-кандидатов, однако требуются дополнительные функциональные анализы, чтобы определить, действительно ли эти гены регулируют поведение медоносных пчел или индуцируются в результате такого поведения.

2.3. РНК-интерференция

Ингибирование экспрессии генов посредством РНК-интерференции (РНКи) применялось для анализа функции генов у многих видов животных, включая медоносную пчелу. Введение двухцепочечной РНК (дцРНК) или малой интерферирующей РНК (миРНК) в гемоцель взрослых рабочих снижает некоторое количество комплементарной мРНК. Например, экспрессия вителлогенина, предшественника белка желтка, который в основном экспрессируется в женском жировом теле у насекомых, ингибируется путем инъекции дцРНК в брюшную полость [31,32], и этот нокдаун побуждает рабочих рано кормиться [32]. .Предполагается, что взаимное подавление между вителлогенином и ювенильным гормоном (ЮГ), которое способствует поведенческому развитию [10,33,34], контролирует время смены поведения у медоносной пчелы [35]. РНКи также использовались для подавления экспрессии генов в мозге медоносной пчелы [36,37,38,39]. Эти исследования продемонстрировали, что нокдаун генов, связанных с нейронными функциями, нарушает формирование памяти и / или препятствует ее восстановлению. Однако эффективность индуцированного РНКи подавления экспрессии гена варьируется в зависимости от ткани, в которой экспрессируется целевой ген.Экспрессия вителлогенина в брюшной полости рабочих почти теряется после инъекции дцРНК [22,31,32], и это ингибирование длится в течение периода времени, достаточного для изменения экспрессии генов и поведения, регулируемых вителлогенином [12,22,32, 40]. С другой стороны, подавление экспрессии генов в головном мозге обнаруживается только в течение 24 часов после инъекции дцРНК или миРНК [36,37,38]. Торможение восстанавливается через 48 ч после лечения [37,38]. Хотя подавления достаточно для оценки функций генов в обучении и памяти у медоносной пчелы, уменьшение мРНК в мозге меньше (снижение уровня мРНК или белка примерно на 30–60%), чем в жировом теле.Различная эффективность подавления может быть обусловлена, по крайней мере частично, тканезависимым захватом дцРНК и миРНК [41]. Учитывая, что гетерозиготные мутанты, у которых один из двух аллелей дикого типа мутирован и, таким образом, количество соответствующей мРНК снижается примерно на 50%, обычно не обнаруживают какого-либо фенотипа у Drosophila [14], кажется сбивающим с толку то, что наблюдались поведенческие дефекты. у пчел, получавших РНКи, нацеливающие гены, экспрессируемые в головном мозге, даже когда эффективность РНКи-индуцированного подавления экспрессии генов составляла около 50%.Возможно, степень подавления различается в каждой ячейке; т.е. некоторые клетки демонстрируют фенотипы дикого типа с уровнем экспрессии целевого гена более 50%, в то время как другие клетки демонстрируют дефекты с уровнем экспрессии менее 50%, и в целом индивидуумы, обработанные РНКи, демонстрируют дефектные фенотипы.

Вместо инъекции РНК в гемоцели пероральное введение дцРНК (кормовая РНКи) использовалось для подавления экспрессии генов-мишеней у медоносной пчелы [42,43,44,45]. Хотя для кормления РНКи часто требуется большое количество дцРНК, этот метод является менее инвазивным и менее трудоемким, а также имеет относительно длительный эффект молчания у взрослых медоносных пчел [44,45].Кроме того, Maori et al. (2019) сообщили, что дцРНК передавалась от взрослых рабочих, которые потребляли раствор сахарозы, содержащего дцРНК, личинкам, которые принимали пищу личинок, секретируемую взрослыми рабочими, получавшими дцРНК [46]. Эффект трансгенерации РНКи продолжался до взрослой стадии после эклозии [46]. Однако, насколько нам известно, нет сообщений о том, что кормящая РНКи использовалась для подавления экспрессии генов в головном мозге. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности и действенности этих методов функционального анализа генов, экспрессируемых в мозге медоносной пчелы.

2.4. Трансфекция внешней ДНК

Несколько групп сообщили об успешной плазмидной трансфекции медоносной пчелы. Робинсон и др. (2000) предприняли попытку трансфекции линеаризованной плазмиды, смешанной со спермой, в оплодотворенные яйцеклетки путем искусственного осеменения девственных маток, и сообщили, что внешняя ДНК размножалась по крайней мере в течение трех поколений, хотя интеграция трансфицированной ДНК в геном не была обнаружена [47 ]. Kunieda et al. (2004) и Schulte et al. (2013) использовали электропорацию для трансфекции плазмиды в мозг медоносной пчелы [48,49].Они подтвердили экспрессию внешнего гена (зеленый флуоресцентный белок : GFP ) в мозге трансфицированных пчел с помощью иммуноблоттинга или иммуногистохимии с использованием антитела против GFP [48,49]. Трансфекция с помощью бакуловируса — ДНК-вируса, который в основном поражает чешуекрылых насекомых — также применялась к медоносной пчеле [50,51]. Ando et al. (2007) обнаружили экспрессию GFP у личинок и куколок, инфицированных бакуловирусом [50]. Икеда и др. (2011) инфицировали маток бакуловирусом, несущим модифицированные внутренние гены вируса, и наблюдали тканезависимую экспрессию GFP [51].Однако методы, использованные в этих новаторских исследованиях, не применялись для функционального анализа генов и / или нейронов, вероятно, из-за их высокоинвазивных процедур и / или сложности нацеливания на конкретные ткани или органы.

2,5. Трансгенез с использованием транспозона piggyBac

Транспозоны ДНК, мобильные элементы ДНК, которые изменяют свое положение в геноме хозяина с помощью транспозазы, были использованы для трансгенеза у насекомых. Одним из наиболее часто используемых транспозонов у насекомых является элемент P, который был обнаружен у Drosophila [52] и использован для создания трансгенных D.melanogaster [53,54]. В отличие от элемента P, который избирательно используется в Drosophila , другой транспозон ДНК, piggyBac , широко используется для трансгенеза у нескольких отрядов насекомых [55,56,57,58,59]. Schulte et al. (2014) применили piggyBac для создания первой трансгенной медоносной пчелы [60]. Они вводили мРНК транспозазы piggyBac и плазмиды, полученные из piggyBac , содержащие внешние гены между инвертированными концевыми повторами piggyBac , в оплодотворенные яйца вскоре после откладки яиц, заставляя вылупившихся личинок дифференцироваться в маток, вводя их в колонию без маток.Некоторые из этих маток откладывали неоплодотворенные яйца, которые превратились в трансгенных трутней (А). Schulte et al. также подтвердили, что внешние плазмидные последовательности стали интегрированными в геном этих дронов, и наблюдали флуоресценцию, происходящую от белка, кодируемого интегрированными плазмидными последовательностями [60]. Недавно Отте и др. (2018) сообщили о более высокой эффективности интеграции внешних последовательностей в геном за счет улучшения процедур инъекции и замены транспозазы на гиперактивную, кодон-оптимизированную транспозазу [61,62].Поскольку транспозон piggyBac интегрируется в геном почти случайным образом (сайт «TTAA»), возможно, что интеграция piggyBac случайно нарушает эндогенные гены и регуляторные последовательности, и поэтому необходимо исследовать некоторые трансгенные линии. Однако, если доступны соответствующие промоторы, трансгенез с использованием вектора piggyBac может быть полезным и простым методом манипуляции генами даже у медоносной пчелы.

Обзор процедур проведения функционального анализа с использованием методов модификации генов у медоносной пчелы.( A ) Процедуры получения мутантной / трансгенной медоносной пчелы путем скрещивания. Стрелки со сплошной линией указывают процессы, выполненные в предыдущих исследованиях. Стрелками с пунктирными линиями обозначены процессы, предложенные в предыдущих исследованиях, как будущие исследования. ( B ) Альтернативные методы анализа функций генов с использованием мозаичных рабочих (F0), искусственно выращенных из инъецированных яиц.

2.6. Нокаут гена путем редактирования генома

Методы редактирования генома недавно были применены для функционального анализа генов у различных организмов.В частности, CRISPR / Cas9 широко используется из-за его универсальности и простоты создания необходимых компонентов. Kohno et al. (2016) сообщили о первом применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел при производстве мутантных дронов [63]. В настоящее время имеется несколько отчетов о применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел, и были предложены две процедуры для анализа функции генов [63,64,65,66].

Kohno et al. (2016) и Коно и Кубо (2018) предложили функциональный анализ гена путем получения гомозиготных мутантных рабочих посредством искусственного оплодотворения (A) [63,64].Они сообщили о разработке фундаментальных методов создания мутантных дронов с использованием CRISPR / Cas9 впервые. В качестве целевого гена они выбрали mrjp1 ( основной белок маточного молочка 1 ), который кодирует основной белковый компонент маточного молочка, поскольку нокаут mrjp1 не должен был вызывать эмбриональную летальность [67]. В Kohno и Kubo (2018) они затем нацелены на ген, названный mKast (, связанный с клетками Kenyon среднего типа, преимущественно связанный с аррестином белок ), который избирательно экспрессируется во взрослом мозге среди частей тела рабочих и, таким образом, как ожидается, будет имеют функции, связанные с регулированием социального поведения [48].Они успешно произвели соматических мозаичных маток (F0) из обработанных геномом оплодотворенных яиц и мутантных трутней (F1) из этих мозаичных маток (F0). Им также удалось получить гетерозиготных мутантных рабочих (F2) от маток дикого типа, искусственно осемененных спермой, полученной от мутантных трутней (A). Эти исследования проложили путь к производству мутантных медоносных пчел и продемонстрировали возможность получения мутантных пчел путем искусственного спаривания в лабораторных условиях. Однако о производстве гомозиготных рабочих-мутантов еще не сообщалось, в основном из-за трудоемких и сложных процедур содержания пчелиных семей в закрытом помещении из-за юридических ограничений.Было разработано несколько протоколов домашнего пчеловодства, что затрудняет получение гомозиготных рабочих-мутантов. Дроны в колонии, помещенной в закрытую комнату, как правило, отвергаются до их появления или полового созревания [63], возможно, из-за неподходящего состояния колонии. Более того, колонии, содержащиеся в закрытом помещении, еще не смогли пережить зиму [63], что требует завершения производства гомозиготных рабочих-мутантов до наступления зимы или криоконсервации спермы от мутантных трутней в течение зимы.

Необходимо улучшить руководство по пчеловодству в помещении, включая процедуру производства половозрелых трутней.

Чтобы избежать этих трудоемких и сложных процедур, Roth et al. (2019) предложили функциональный анализ с использованием поколения F0 (B) [65]. Они резко повысили эффективность редактирования генома, изменив положение инъекции с заднего на переднее, где находится ядро ​​эмбриона на его самой ранней стадии [68]. Они также выбрали высокоэффективную направляющую РНК из нескольких кандидатов.Комбинация этих улучшений привела к достижению 100% -ной скорости мутации в поколении F0. Это было большим улучшением, учитывая, что уровень редактирования генома составлял приблизительно 10% в предыдущих исследованиях медоносных пчел с использованием CRISPR / Cas9 (оценка по доле мутантных дронов в поколении F1) [63,64]. Затем из инъецированных оплодотворенных яиц выращивали методами in vitro для превращения в рабочих [69,70] и анализировали фенотипы. Roth et al. (2019) показали, что как питание на личиночных стадиях, так и гены, участвующие в пути определения пола у насекомых, регулируют полифенизм размеров репродуктивного органа у самок пчел [65].Этот отчет был первым функциональным анализом с использованием мутантных пчелиных пчел. Xiao et al. (2019) также сообщили об высокоэффективном редактировании генома медоносной пчелы с использованием аналогичных методов [66]. Хотя они анализировали эмбрионы только до того, как они вылупились, они продемонстрировали, что этот метод эффективен для анализа функции генов.

3. К функциональному анализу молекулярных и нервных основ, лежащих в основе социального поведения медоносных пчел

Одной из целей применения генетических методов, особенно обратных генетических методов, может быть выяснение причинной связи между поведением и генами, описанной в Раздел 2.2. С другой стороны, гены, идентифицированные путем исследования генов, преимущественно экспрессируемых в области (ах) мозга, которая, как считается, связана с социальным поведением, также могут быть вероятными мишенями. В этом разделе мы кратко резюмируем свойство одной из этих областей мозга, грибовидного тела (МБ), у медоносных пчел и других перепончатокрылых насекомых. Затем мы обсуждаем будущее направление, чтобы выявить молекулярные и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел.

3.1. Грибное тело медоносной пчелы: профили экспрессии генов и сравнение у перепончатокрылых насекомых

Считается, что у медоносной пчелы грибовидные тела (МБ), высший центр мозга насекомых, связаны с регуляцией социального поведения [71].МБ представляют собой парные структуры в мозгу насекомых, а МБ медоносных пчел имеют две входные области, называемые чашечками. Сомы внутренних нейронов MB, клетки Kenyon (KCs), расположены внутри чашечек и проецируют дендриты и аксоны в чашечки и ножки, соответственно (A). MBs участвуют в обучении и памяти, а также в мультимодальной обработке информации у некоторых видов насекомых, включая Drosophila [72,73,74,75,76,77,78,79]. Кроме того, доля нейропиля в МБ изменяется в зависимости от возраста и опыта, что указывает на возможную функцию МБ в возрастных задачах работника [80,81,82,83].Гены, которые преимущественно экспрессируются в МБ медоносных пчел, были идентифицированы посредством исчерпывающих исследований [84,85] (для обзора см. [86,87]). Анализ экспрессии этих MB-предпочтительных генов в мозге медоносных пчел показал, что KC делятся на несколько подтипов, и предполагается, что каждый подтип выполняет разные функции в регуляции поведения [86,87]. Ближайший ранний ген, экспрессия которого индуцируется в активированных нейронах, экспрессируется в MB после полета за пищей, что дополнительно поддерживает связь между MB и добычей пищи.

Резюме сравнительных анализов грибовидных тел (МБ) у перепончатокрылых насекомых. ( A ) Схематические чертежи компонентов пчелиных МБ. Субкомпартменты входной области МБ показаны на левой (боковой) чашечке. Подтипы KC класса I, сомы которых расположены внутри чашечки MB, показаны на правой (медиальной) чашечке. ( B ) Простое филогенное дерево для трех основных групп перепончатокрылых: Symphyta, Parasitica и Aculeata (верхняя часть), а также структурные характеристики МБ соответствующих видов (средняя и нижняя части).Сложные чашечки MB наблюдаются у Apocrita, но не у Symphyta. С другой стороны, количество подтипов KC класса I увеличилось с одного у Symphyta до двух у Parasitica и трех у Aculeata. Рисунки в средней части цитируются из [86], а рисунки в нижней части — из [88] с некоторыми изменениями.

Сравнение МБ среди перепончатокрылых насекомых, которые различаются реперторией поведения, выявило корреляцию между эволюцией поведения и МБ у перепончатокрылых насекомых.Сравнительные исследования обонятельных трактов в высшие центры мозга или морфологии входной области в МБ (чашечки; A) с использованием различных видов перепончатокрылых насекомых были проведены для выявления возможных нейронных цепей, связанных с социальностью [78,89]. Эти исследования показали, что одиночные паразитоидные осы (Parasitica) уже развили сложные структуры мозга, подобные Aculeata, которые демонстрируют поведение nidification (строительство гнезда) (B), и, таким образом, взаимосвязь между социальным поведением и структурами мозга остается неясной.Oya et al. (2017) сосредоточились на подтипах KC класса I, чьи соматы локализованы внутри чашечек MB и имеют различные профили экспрессии генов (A) [86,87,88]. Они использовали ген ( родственный тахикинину пептид ; Trp ), который дифференциально экспрессируется среди различных подтипов KC в мозге медоносной пчелы [90] в качестве маркерного гена подтипа KC, и сравнили профили экспрессии гомологов Trp в мозге пчел. различные перепончатокрылые насекомые (B) [88]. Oya et al. (2017) обнаружили, что количество подтипов KC постепенно увеличивается в связи с эволюцией поведения; один подтип одиночного пилильщика-фитофага (Symphyta), два подтипа одиночного паразитоидного оса (Parasitica) и три подтипа одиночного / эусоциального пилильщика Aculeata (B).Их исследование было первым, кто выявил нейронные характеристики, которые отличают Aculeata от других примитивных перепончатокрылых насекомых.

3.2. Исследование и функциональный анализ генов / нейронов, связанных с социальным поведением у перепончатокрылых насекомых

Как описано выше, знания о профилях экспрессии генов, которые, как считается, связаны с социальным поведением медоносных пчел, накапливаются. Связаны ли эти гены с регуляцией социального поведения медоносной пчелы и как нейроны, экспрессирующие эти гены, регулируют сложное поведение, не выяснено из-за нехватки эффективных методов модификации генов для применения к медоносной пчеле.Функциональный анализ путем нокаута генов, по-разному экспрессируемых в мозгу пчел-кормилиц и пчел-собирателей, или генов, экспрессируемых в определенных подтипах KC, может пролить свет на причинную связь между генами, экспрессируемыми в мозге, и социальным поведением медоносной пчелы. Некоторые гены, идентифицированные до сих пор, принадлежат к пути передачи сигналов экдизона или JH [29,91] и, таким образом, связаны с развитием или метаморфозом [92], что делает их нокаут с высокой вероятностью привести к летальному исходу в процессе развития, что помешало бы анализу. их функции в мозге и поведения у взрослых.Следовательно, методы подавления этих генов специфическим для мозга взрослого человека способом с использованием кормления РНКи (раздел 2.3) или трансгенеза с использованием piggyBac для индукции экспрессии shРНК под действием промотора тканеспецифичных генов (трансгенный рабочий (F2) в A ), необходимо применять во избежание аномалий развития [93]. Недавно сообщалось о методах подделки с использованием CRISPR / Cas9 для некоторых видов насекомых [94,95,96,97]. Альтернативным методом могло бы быть применение этих методов к медоносной пчеле для вставки донорской ДНК в целевые области генома, например, под промотором генов, предпочтительно экспрессируемых в KC.

Если определенные гены и / или нейроны обнаруживаются только у эусоциальных насекомых, они могут быть интересными целями для функционального анализа социального поведения. Kapheim et al. (2015) сравнили геномы 10 видов пчел с разной социальной сложностью и сообщили, что, хотя генные сети более сложны у социальных насекомых, у пчел, которые независимо развили эусоциальность, не было обнаружено консервативной эволюции определенных молекул [98]. Oya et al. (2017) сообщили, что три подтипа KC коррелируют с приобретением nidification у Aculeata (Hymenoptera).Aculeata включает виды от одиночных до продвинутых эусоциальных видов, однако молекулярные и нервные основы, которые присутствуют только у эусоциальных насекомых или медоносных пчел среди остроконечных насекомых, не описаны. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение «социальных генов / нейронов-кандидатов» посредством более полных сравнений подтипов KC у остроконечных видов. Неизвестно, есть ли другие субпопуляции нейронов в известных подтипах KC. Schatton и Scharff (2017) сообщили, что FoxP , который является гомологом человеческого FoxP2 , связанного с языковыми дефектами у людей [99], экспрессируется в ограниченной области в МБ медоносных пчел [100].Интересно, что FoxP экспрессируется в субпопуляции KC большого типа (в [100] авторы сообщили, что FoxP экспрессируется в KC среднего типа. Однако, поскольку KC среднего типа характеризуются преимущественной экспрессией из mKast , гена-маркера для KC среднего типа [87,101], здесь мы называем FoxP-экспрессирующие клетки KC большого типа). Этот вывод указывает на то, что должна быть другая классификация KC. Сравнение этих новых субпопуляций KCs между родственными видами может выявить нейронные и / или молекулярные субстраты, участвующие в социальном поведении.Недавно разработанные технологии, такие как одноклеточная RNA-Seq [102,103,104], вероятно, будут полезны для всесторонней идентификации субпопуляций KC у медоносных пчел и генов, предпочтительно экспрессируемых в каждой субпопуляции. Путем трансгенеза с использованием piggyBac или нокаута с использованием CRISPR / Cas9 можно управлять экспрессией генов в конкретных нейронах, если доступны соответствующие промоторы для управления экспрессией короткой шпильки РНК в интересующих клетках [93]. Кроме того, наблюдение или манипулирование нейронной активностью с помощью визуализации кальция и оптогенетики, соответственно, также будет полезно для выяснения причинной связи между нейронами и поведением [105,106].В будущем можно будет проверить, регулируют ли эти гены-кандидаты или нейроны социальное поведение с помощью этих методов. Поскольку эти методы трансгенеза или «нокаута» эффективны даже в поколении F1 (гетерозиготные рабочие; A), производство трансгенных медоносных пчел может быть достигнуто с относительно меньшими трудозатратами [60].

4. Выводы

Несмотря на обширные исследования, причинно-следственная связь между генами / нейронами мозга и социальным поведением медоносной пчелы еще не была продемонстрирована с использованием генетических методов.Недавнее радикальное усовершенствование инструментов для генетических исследований позволит преодолеть застой в функциональном анализе генов / нейронов медоносной пчелы. Помимо анализа идентифицированных в настоящее время генов-кандидатов / нейронов, было бы полезно дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, с использованием новых технологий.

Число видов, геном которых был секвенирован, увеличивается, и сообщалось о функциональных анализах с использованием перепончатокрылых насекомых, помимо медоносной пчелы.Сообщалось о генных манипуляциях пилильщика, Athalia rosae , который принадлежит к основной группе перепончатокрылых, Symphyta, и паразитоидной осы, Nasonia vitripennis (Apocrita) [57,107,108]. У муравьев (Formicidae), которые развили эусоциальность независимо от медоносной пчелы, поведенческая и развивающая функция orco , которая важна для функции пахучих рецепторов, была проанализирована с помощью CRISPR / Cas9 [109,110]. Будущее сравнение функций генов, регулирующих социальное поведение у медоносной пчелы, и ортологичных генов у этих примитивных перепончатокрылых насекомых или насекомых другого социального происхождения, позволит по-новому взглянуть на вклад молекулярных и нейронных изменений в эволюцию социального поведения у остроконечных насекомых.

Достижения и перспективы функционального анализа молекулярных и нейронных механизмов, лежащих в основе социального поведения

Аннотация

Европейская медоносная пчела является модельным организмом для изучения социального поведения. Всесторонний анализ профилей дифференциальной экспрессии генов между мозгом пчел-кормилиц и собирателей или в грибовидных телах — структура мозга, связанная с обучением, памятью и мультимодальной сенсорной интеграцией — выявил гены-кандидаты, связанные с поведением медоносных пчел.Несмотря на накопление знаний о профилях экспрессии генов, связанных с поведением медоносных пчел, остается неясным, действительно ли эти гены регулируют социальное поведение медоносных пчел, отчасти из-за нехватки методов генетической манипуляции, доступных для применения к медоносным пчелам. В этом обзоре мы описываем генетические методы, применяемые для изучения медоносной пчелы, от классической прямой генетики до недавно разработанных методов модификации генов с использованием транспозона и CRISPR / Cas9.Затем мы обсудим будущий функциональный анализ с использованием этих генетических методов, нацеленных на гены, идентифицированные в предыдущем исследовании. Поскольку никаких конкретных генов или нейронов, уникальных для социальных насекомых, еще не обнаружено, дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, посредством всестороннего анализа грибовидных тел у остроконечных видов может предоставить интригующие цели для функционального анализа, а также понимание молекулярных структур. и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения.

Ключевые слова: медоносная пчела, генетика, социальное поведение, грибовидное тело, клетка Кеньона

1.Введение

Социальные животные живут группами и демонстрируют сложное социальное поведение, такое как разделение труда и общение между людьми [1]. Однако, как это поведение регулируется в мозгу социальных животных, остается в значительной степени неизвестным. Некоторые виды насекомых, называемые эусоциальными насекомыми, также демонстрируют весьма изощренное социальное поведение. В отличие от мозга млекопитающих, который относительно велик и имеет сложную структуру, у насекомых относительно небольшой и менее сложный мозг [2,3].Кроме того, социальный образ жизни насекомых легче наблюдать в лабораторных условиях, что позволяет проводить обширные исследования их поведения и лежащих в основе молекулярных механизмов. Европейская медоносная пчела ( Apis mellifera L.) — один из наиболее хорошо изученных видов с точки зрения взаимосвязи ген-поведение [4].

Как и другие эусоциальные насекомые, колония медоносных пчел содержит репродуктивные и не репродуктивные касты: только матка (репродуктивная каста) откладывает яйца, в то время как рабочие (не репродуктивная каста) — это произвольно бесплодные самки, занятые другими задачами, необходимыми для поддерживать активность колонии [5,6].В колонии рабочие заняты различными задачами, такими как очистка улья, уход за личинками, охрана улья от злоумышленников и добыча пищи, воды и смолы. Задачи, которыми заняты рабочие, частично меняются в зависимости от их возраста после выхода на работу [5,6]. Собиратели часто могут передавать информацию об источниках пищи (или новых местах гнезд в репродуктивном рое) своим товарищам по гнезду, используя танец виляния, символизированный инструмент коммуникации, который неизвестен другим животным [5,6,7].

Некоторые методы разведения были разработаны для использования в исследованиях медоносных пчел [8,9], что сделало медоносных пчел отличным экспериментальным животным для изучения социального поведения. Есть несколько исследований, которые продемонстрировали молекулярные механизмы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел [10,11,12,13]. Хотя в этих исследованиях эффективно использовались генетические и / или фармакологические методы, эффективность этих методов зависит от ткани, в которой экспрессируется ген-мишень, или от наличия агонистических или антагонистических лекарственных средств.Следовательно, для выяснения причинно-следственной связи между определенной молекулой, нейроном или областью мозга и социальным поведением медоносной пчелы были желательны эффективные, воспроизводимые и универсальные методы модификации генов, доступные для применения к медоносной пчеле. За последние несколько лет было разработано несколько эффективных методов манипуляции генами медоносных пчел. В этом обзоре мы описываем попытки выполнить функциональный анализ генов медоносных пчел, а также недавний прогресс в методах модификации генов, используемых в исследованиях медоносных пчел.Затем мы обсудим будущие перспективы анализа функций генов и нейронов медоносных пчел с использованием этих методов модификации генов.

2. Генетические методы, примененные к медоносной пчеле

2.1. Прямая генетика, использующая локусы количественных признаков

У плодовой мушки Drosophila melanogaster , установленного модельного организма, используемого в молекулярной биологии и нейробиологии, прямая генетика привела к идентификации генов, связанных с мутантными фенотипами [14]. В общем, идентификация генов, связанных с интересующими признаками, требует широкомасштабного фенотипического скрининга с использованием потомства животных, случайно мутировавших в результате химической или лучевой обработки.Однако у медоносной пчелы этот процесс затруднен, потому что в колонии только одна репродуктивная самка (матка) [5,6]. Эта уникальная, но вызывающая беспокойство характеристика делает сложным и трудоемким создание мутантных штаммов с применением методов прямой генетики, хотя после создания мутантных штаммов наличие одной репродуктивной самки может быть потенциально благоприятным, поскольку это может привести к созданию клона генетически идентичного мутантного потомства. .

В некоторых исследованиях предпринимались попытки идентифицировать области генома, связанные с количественными различиями в поведении между колониями [15,16,17,18,19,20,21].Путем строгого контроля спаривания эти исследования идентифицировали локусы количественных признаков (QTL), связанные с количественными различиями в интересующих признаках, например, предпочтение пыльцы [15,16,18], начало поиска пищи [17], защитное поведение [18]. , 19], бесплодие рабочих [20] и размер яичников [21]. Поскольку идентифицированные области генома содержат много генов, необходимо провести обратный генетический анализ, чтобы сделать вывод, что гены-кандидаты, присутствующие в предполагаемой области генома, действительно связаны с интересующим признаком.

2.2. Исследование генов-кандидатов с помощью транскриптомных подходов

В колонии медоносных пчел десятки тысяч рабочих демонстрируют социальное поведение. Поведение рабочих меняется примерно в соответствии с возрастом рабочего после взрыва, и их физиологическое состояние также изменяется в соответствии с их задачами [22,23,24,25]. Предполагая, что мозг пчел, занятых различными задачами, экспрессирует разные гены, связанные с регуляцией социального поведения, был проведен комплексный анализ с использованием микроматрицы кДНК для выявления дифференциально экспрессируемых генов в мозге рабочих, занятых выполнением различных задач или демонстрирующих разное поведение (недавно появившиеся , медсестра, охранник, строит ульи и собиратели) [26,27,28,29].Кроме того, выявлено сравнение генов, экспрессируемых в мозге во время развития у королевы, рабочего и трутня [30]. Эти гены могут, по крайней мере частично, способствовать разным поведенческим свойствам полов или женских каст. Использование этих всесторонних сравнительных анализов для идентификации дифференциально экспрессируемых генов полезно для изучения представляющих интерес генов-кандидатов, однако требуются дополнительные функциональные анализы, чтобы определить, действительно ли эти гены регулируют поведение медоносных пчел или индуцируются в результате такого поведения.

2.3. РНК-интерференция

Ингибирование экспрессии генов посредством РНК-интерференции (РНКи) применялось для анализа функции генов у многих видов животных, включая медоносную пчелу. Введение двухцепочечной РНК (дцРНК) или малой интерферирующей РНК (миРНК) в гемоцель взрослых рабочих снижает некоторое количество комплементарной мРНК. Например, экспрессия вителлогенина, предшественника белка желтка, который в основном экспрессируется в женском жировом теле у насекомых, ингибируется путем инъекции дцРНК в брюшную полость [31,32], и этот нокдаун побуждает рабочих рано кормиться [32]. .Предполагается, что взаимное подавление между вителлогенином и ювенильным гормоном (ЮГ), которое способствует поведенческому развитию [10,33,34], контролирует время смены поведения у медоносной пчелы [35]. РНКи также использовались для подавления экспрессии генов в мозге медоносной пчелы [36,37,38,39]. Эти исследования продемонстрировали, что нокдаун генов, связанных с нейронными функциями, нарушает формирование памяти и / или препятствует ее восстановлению. Однако эффективность индуцированного РНКи подавления экспрессии гена варьируется в зависимости от ткани, в которой экспрессируется целевой ген.Экспрессия вителлогенина в брюшной полости рабочих почти теряется после инъекции дцРНК [22,31,32], и это ингибирование длится в течение периода времени, достаточного для изменения экспрессии генов и поведения, регулируемых вителлогенином [12,22,32, 40]. С другой стороны, подавление экспрессии генов в головном мозге обнаруживается только в течение 24 часов после инъекции дцРНК или миРНК [36,37,38]. Торможение восстанавливается через 48 ч после лечения [37,38]. Хотя подавления достаточно для оценки функций генов в обучении и памяти у медоносной пчелы, уменьшение мРНК в мозге меньше (снижение уровня мРНК или белка примерно на 30–60%), чем в жировом теле.Различная эффективность подавления может быть обусловлена, по крайней мере частично, тканезависимым захватом дцРНК и миРНК [41]. Учитывая, что гетерозиготные мутанты, у которых один из двух аллелей дикого типа мутирован и, таким образом, количество соответствующей мРНК снижается примерно на 50%, обычно не обнаруживают какого-либо фенотипа у Drosophila [14], кажется сбивающим с толку то, что наблюдались поведенческие дефекты. у пчел, получавших РНКи, нацеливающие гены, экспрессируемые в головном мозге, даже когда эффективность РНКи-индуцированного подавления экспрессии генов составляла около 50%.Возможно, степень подавления различается в каждой ячейке; т.е. некоторые клетки демонстрируют фенотипы дикого типа с уровнем экспрессии целевого гена более 50%, в то время как другие клетки демонстрируют дефекты с уровнем экспрессии менее 50%, и в целом индивидуумы, обработанные РНКи, демонстрируют дефектные фенотипы.

Вместо инъекции РНК в гемоцели пероральное введение дцРНК (кормовая РНКи) использовалось для подавления экспрессии генов-мишеней у медоносной пчелы [42,43,44,45]. Хотя для кормления РНКи часто требуется большое количество дцРНК, этот метод является менее инвазивным и менее трудоемким, а также имеет относительно длительный эффект молчания у взрослых медоносных пчел [44,45].Кроме того, Maori et al. (2019) сообщили, что дцРНК передавалась от взрослых рабочих, которые потребляли раствор сахарозы, содержащего дцРНК, личинкам, которые принимали пищу личинок, секретируемую взрослыми рабочими, получавшими дцРНК [46]. Эффект трансгенерации РНКи продолжался до взрослой стадии после эклозии [46]. Однако, насколько нам известно, нет сообщений о том, что кормящая РНКи использовалась для подавления экспрессии генов в головном мозге. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для оценки эффективности и действенности этих методов функционального анализа генов, экспрессируемых в мозге медоносной пчелы.

2.4. Трансфекция внешней ДНК

Несколько групп сообщили об успешной плазмидной трансфекции медоносной пчелы. Робинсон и др. (2000) предприняли попытку трансфекции линеаризованной плазмиды, смешанной со спермой, в оплодотворенные яйцеклетки путем искусственного осеменения девственных маток, и сообщили, что внешняя ДНК размножалась по крайней мере в течение трех поколений, хотя интеграция трансфицированной ДНК в геном не была обнаружена [47 ]. Kunieda et al. (2004) и Schulte et al. (2013) использовали электропорацию для трансфекции плазмиды в мозг медоносной пчелы [48,49].Они подтвердили экспрессию внешнего гена (зеленый флуоресцентный белок : GFP ) в мозге трансфицированных пчел с помощью иммуноблоттинга или иммуногистохимии с использованием антитела против GFP [48,49]. Трансфекция с помощью бакуловируса — ДНК-вируса, который в основном поражает чешуекрылых насекомых — также применялась к медоносной пчеле [50,51]. Ando et al. (2007) обнаружили экспрессию GFP у личинок и куколок, инфицированных бакуловирусом [50]. Икеда и др. (2011) инфицировали маток бакуловирусом, несущим модифицированные внутренние гены вируса, и наблюдали тканезависимую экспрессию GFP [51].Однако методы, использованные в этих новаторских исследованиях, не применялись для функционального анализа генов и / или нейронов, вероятно, из-за их высокоинвазивных процедур и / или сложности нацеливания на конкретные ткани или органы.

2,5. Трансгенез с использованием транспозона piggyBac

Транспозоны ДНК, мобильные элементы ДНК, которые изменяют свое положение в геноме хозяина с помощью транспозазы, были использованы для трансгенеза у насекомых. Одним из наиболее часто используемых транспозонов у насекомых является элемент P, который был обнаружен у Drosophila [52] и использован для создания трансгенных D.melanogaster [53,54]. В отличие от элемента P, который избирательно используется в Drosophila , другой транспозон ДНК, piggyBac , широко используется для трансгенеза у нескольких отрядов насекомых [55,56,57,58,59]. Schulte et al. (2014) применили piggyBac для создания первой трансгенной медоносной пчелы [60]. Они вводили мРНК транспозазы piggyBac и плазмиды, полученные из piggyBac , содержащие внешние гены между инвертированными концевыми повторами piggyBac , в оплодотворенные яйца вскоре после откладки яиц, заставляя вылупившихся личинок дифференцироваться в маток, вводя их в колонию без маток.Некоторые из этих маток откладывали неоплодотворенные яйца, которые превратились в трансгенных трутней (А). Schulte et al. также подтвердили, что внешние плазмидные последовательности стали интегрированными в геном этих дронов, и наблюдали флуоресценцию, происходящую от белка, кодируемого интегрированными плазмидными последовательностями [60]. Недавно Отте и др. (2018) сообщили о более высокой эффективности интеграции внешних последовательностей в геном за счет улучшения процедур инъекции и замены транспозазы на гиперактивную, кодон-оптимизированную транспозазу [61,62].Поскольку транспозон piggyBac интегрируется в геном почти случайным образом (сайт «TTAA»), возможно, что интеграция piggyBac случайно нарушает эндогенные гены и регуляторные последовательности, и поэтому необходимо исследовать некоторые трансгенные линии. Однако, если доступны соответствующие промоторы, трансгенез с использованием вектора piggyBac может быть полезным и простым методом манипуляции генами даже у медоносной пчелы.

Обзор процедур проведения функционального анализа с использованием методов модификации генов у медоносной пчелы.( A ) Процедуры получения мутантной / трансгенной медоносной пчелы путем скрещивания. Стрелки со сплошной линией указывают процессы, выполненные в предыдущих исследованиях. Стрелками с пунктирными линиями обозначены процессы, предложенные в предыдущих исследованиях, как будущие исследования. ( B ) Альтернативные методы анализа функций генов с использованием мозаичных рабочих (F0), искусственно выращенных из инъецированных яиц.

2.6. Нокаут гена путем редактирования генома

Методы редактирования генома недавно были применены для функционального анализа генов у различных организмов.В частности, CRISPR / Cas9 широко используется из-за его универсальности и простоты создания необходимых компонентов. Kohno et al. (2016) сообщили о первом применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел при производстве мутантных дронов [63]. В настоящее время имеется несколько отчетов о применении CRISPR / Cas9 у медоносных пчел, и были предложены две процедуры для анализа функции генов [63,64,65,66].

Kohno et al. (2016) и Коно и Кубо (2018) предложили функциональный анализ гена путем получения гомозиготных мутантных рабочих посредством искусственного оплодотворения (A) [63,64].Они сообщили о разработке фундаментальных методов создания мутантных дронов с использованием CRISPR / Cas9 впервые. В качестве целевого гена они выбрали mrjp1 ( основной белок маточного молочка 1 ), который кодирует основной белковый компонент маточного молочка, поскольку нокаут mrjp1 не должен был вызывать эмбриональную летальность [67]. В Kohno и Kubo (2018) они затем нацелены на ген, названный mKast (, связанный с клетками Kenyon среднего типа, преимущественно связанный с аррестином белок ), который избирательно экспрессируется во взрослом мозге среди частей тела рабочих и, таким образом, как ожидается, будет имеют функции, связанные с регулированием социального поведения [48].Они успешно произвели соматических мозаичных маток (F0) из обработанных геномом оплодотворенных яиц и мутантных трутней (F1) из этих мозаичных маток (F0). Им также удалось получить гетерозиготных мутантных рабочих (F2) от маток дикого типа, искусственно осемененных спермой, полученной от мутантных трутней (A). Эти исследования проложили путь к производству мутантных медоносных пчел и продемонстрировали возможность получения мутантных пчел путем искусственного спаривания в лабораторных условиях. Однако о производстве гомозиготных рабочих-мутантов еще не сообщалось, в основном из-за трудоемких и сложных процедур содержания пчелиных семей в закрытом помещении из-за юридических ограничений.Было разработано несколько протоколов домашнего пчеловодства, что затрудняет получение гомозиготных рабочих-мутантов. Дроны в колонии, помещенной в закрытую комнату, как правило, отвергаются до их появления или полового созревания [63], возможно, из-за неподходящего состояния колонии. Более того, колонии, содержащиеся в закрытом помещении, еще не смогли пережить зиму [63], что требует завершения производства гомозиготных рабочих-мутантов до наступления зимы или криоконсервации спермы от мутантных трутней в течение зимы.

Необходимо улучшить руководство по пчеловодству в помещении, включая процедуру производства половозрелых трутней.

Чтобы избежать этих трудоемких и сложных процедур, Roth et al. (2019) предложили функциональный анализ с использованием поколения F0 (B) [65]. Они резко повысили эффективность редактирования генома, изменив положение инъекции с заднего на переднее, где находится ядро ​​эмбриона на его самой ранней стадии [68]. Они также выбрали высокоэффективную направляющую РНК из нескольких кандидатов.Комбинация этих улучшений привела к достижению 100% -ной скорости мутации в поколении F0. Это было большим улучшением, учитывая, что уровень редактирования генома составлял приблизительно 10% в предыдущих исследованиях медоносных пчел с использованием CRISPR / Cas9 (оценка по доле мутантных дронов в поколении F1) [63,64]. Затем из инъецированных оплодотворенных яиц выращивали методами in vitro для превращения в рабочих [69,70] и анализировали фенотипы. Roth et al. (2019) показали, что как питание на личиночных стадиях, так и гены, участвующие в пути определения пола у насекомых, регулируют полифенизм размеров репродуктивного органа у самок пчел [65].Этот отчет был первым функциональным анализом с использованием мутантных пчелиных пчел. Xiao et al. (2019) также сообщили об высокоэффективном редактировании генома медоносной пчелы с использованием аналогичных методов [66]. Хотя они анализировали эмбрионы только до того, как они вылупились, они продемонстрировали, что этот метод эффективен для анализа функции генов.

3. К функциональному анализу молекулярных и нервных основ, лежащих в основе социального поведения медоносных пчел

Одной из целей применения генетических методов, особенно обратных генетических методов, может быть выяснение причинной связи между поведением и генами, описанной в Раздел 2.2. С другой стороны, гены, идентифицированные путем исследования генов, преимущественно экспрессируемых в области (ах) мозга, которая, как считается, связана с социальным поведением, также могут быть вероятными мишенями. В этом разделе мы кратко резюмируем свойство одной из этих областей мозга, грибовидного тела (МБ), у медоносных пчел и других перепончатокрылых насекомых. Затем мы обсуждаем будущее направление, чтобы выявить молекулярные и нейронные основы, лежащие в основе социального поведения медоносных пчел.

3.1. Грибное тело медоносной пчелы: профили экспрессии генов и сравнение у перепончатокрылых насекомых

Считается, что у медоносной пчелы грибовидные тела (МБ), высший центр мозга насекомых, связаны с регуляцией социального поведения [71].МБ представляют собой парные структуры в мозгу насекомых, а МБ медоносных пчел имеют две входные области, называемые чашечками. Сомы внутренних нейронов MB, клетки Kenyon (KCs), расположены внутри чашечек и проецируют дендриты и аксоны в чашечки и ножки, соответственно (A). MBs участвуют в обучении и памяти, а также в мультимодальной обработке информации у некоторых видов насекомых, включая Drosophila [72,73,74,75,76,77,78,79]. Кроме того, доля нейропиля в МБ изменяется в зависимости от возраста и опыта, что указывает на возможную функцию МБ в возрастных задачах работника [80,81,82,83].Гены, которые преимущественно экспрессируются в МБ медоносных пчел, были идентифицированы посредством исчерпывающих исследований [84,85] (для обзора см. [86,87]). Анализ экспрессии этих MB-предпочтительных генов в мозге медоносных пчел показал, что KC делятся на несколько подтипов, и предполагается, что каждый подтип выполняет разные функции в регуляции поведения [86,87]. Ближайший ранний ген, экспрессия которого индуцируется в активированных нейронах, экспрессируется в MB после полета за пищей, что дополнительно поддерживает связь между MB и добычей пищи.

Резюме сравнительных анализов грибовидных тел (МБ) у перепончатокрылых насекомых. ( A ) Схематические чертежи компонентов пчелиных МБ. Субкомпартменты входной области МБ показаны на левой (боковой) чашечке. Подтипы KC класса I, сомы которых расположены внутри чашечки MB, показаны на правой (медиальной) чашечке. ( B ) Простое филогенное дерево для трех основных групп перепончатокрылых: Symphyta, Parasitica и Aculeata (верхняя часть), а также структурные характеристики МБ соответствующих видов (средняя и нижняя части).Сложные чашечки MB наблюдаются у Apocrita, но не у Symphyta. С другой стороны, количество подтипов KC класса I увеличилось с одного у Symphyta до двух у Parasitica и трех у Aculeata. Рисунки в средней части цитируются из [86], а рисунки в нижней части — из [88] с некоторыми изменениями.

Сравнение МБ среди перепончатокрылых насекомых, которые различаются реперторией поведения, выявило корреляцию между эволюцией поведения и МБ у перепончатокрылых насекомых.Сравнительные исследования обонятельных трактов в высшие центры мозга или морфологии входной области в МБ (чашечки; A) с использованием различных видов перепончатокрылых насекомых были проведены для выявления возможных нейронных цепей, связанных с социальностью [78,89]. Эти исследования показали, что одиночные паразитоидные осы (Parasitica) уже развили сложные структуры мозга, подобные Aculeata, которые демонстрируют поведение nidification (строительство гнезда) (B), и, таким образом, взаимосвязь между социальным поведением и структурами мозга остается неясной.Oya et al. (2017) сосредоточились на подтипах KC класса I, чьи соматы локализованы внутри чашечек MB и имеют различные профили экспрессии генов (A) [86,87,88]. Они использовали ген ( родственный тахикинину пептид ; Trp ), который дифференциально экспрессируется среди различных подтипов KC в мозге медоносной пчелы [90] в качестве маркерного гена подтипа KC, и сравнили профили экспрессии гомологов Trp в мозге пчел. различные перепончатокрылые насекомые (B) [88]. Oya et al. (2017) обнаружили, что количество подтипов KC постепенно увеличивается в связи с эволюцией поведения; один подтип одиночного пилильщика-фитофага (Symphyta), два подтипа одиночного паразитоидного оса (Parasitica) и три подтипа одиночного / эусоциального пилильщика Aculeata (B).Их исследование было первым, кто выявил нейронные характеристики, которые отличают Aculeata от других примитивных перепончатокрылых насекомых.

3.2. Исследование и функциональный анализ генов / нейронов, связанных с социальным поведением у перепончатокрылых насекомых

Как описано выше, знания о профилях экспрессии генов, которые, как считается, связаны с социальным поведением медоносных пчел, накапливаются. Связаны ли эти гены с регуляцией социального поведения медоносной пчелы и как нейроны, экспрессирующие эти гены, регулируют сложное поведение, не выяснено из-за нехватки эффективных методов модификации генов для применения к медоносной пчеле.Функциональный анализ путем нокаута генов, по-разному экспрессируемых в мозгу пчел-кормилиц и пчел-собирателей, или генов, экспрессируемых в определенных подтипах KC, может пролить свет на причинную связь между генами, экспрессируемыми в мозге, и социальным поведением медоносной пчелы. Некоторые гены, идентифицированные до сих пор, принадлежат к пути передачи сигналов экдизона или JH [29,91] и, таким образом, связаны с развитием или метаморфозом [92], что делает их нокаут с высокой вероятностью привести к летальному исходу в процессе развития, что помешало бы анализу. их функции в мозге и поведения у взрослых.Следовательно, методы подавления этих генов специфическим для мозга взрослого человека способом с использованием кормления РНКи (раздел 2.3) или трансгенеза с использованием piggyBac для индукции экспрессии shРНК под действием промотора тканеспецифичных генов (трансгенный рабочий (F2) в A ), необходимо применять во избежание аномалий развития [93]. Недавно сообщалось о методах подделки с использованием CRISPR / Cas9 для некоторых видов насекомых [94,95,96,97]. Альтернативным методом могло бы быть применение этих методов к медоносной пчеле для вставки донорской ДНК в целевые области генома, например, под промотором генов, предпочтительно экспрессируемых в KC.

Если определенные гены и / или нейроны обнаруживаются только у эусоциальных насекомых, они могут быть интересными целями для функционального анализа социального поведения. Kapheim et al. (2015) сравнили геномы 10 видов пчел с разной социальной сложностью и сообщили, что, хотя генные сети более сложны у социальных насекомых, у пчел, которые независимо развили эусоциальность, не было обнаружено консервативной эволюции определенных молекул [98]. Oya et al. (2017) сообщили, что три подтипа KC коррелируют с приобретением nidification у Aculeata (Hymenoptera).Aculeata включает виды от одиночных до продвинутых эусоциальных видов, однако молекулярные и нервные основы, которые присутствуют только у эусоциальных насекомых или медоносных пчел среди остроконечных насекомых, не описаны. Таким образом, необходимо дальнейшее изучение «социальных генов / нейронов-кандидатов» посредством более полных сравнений подтипов KC у остроконечных видов. Неизвестно, есть ли другие субпопуляции нейронов в известных подтипах KC. Schatton и Scharff (2017) сообщили, что FoxP , который является гомологом человеческого FoxP2 , связанного с языковыми дефектами у людей [99], экспрессируется в ограниченной области в МБ медоносных пчел [100].Интересно, что FoxP экспрессируется в субпопуляции KC большого типа (в [100] авторы сообщили, что FoxP экспрессируется в KC среднего типа. Однако, поскольку KC среднего типа характеризуются преимущественной экспрессией из mKast , гена-маркера для KC среднего типа [87,101], здесь мы называем FoxP-экспрессирующие клетки KC большого типа). Этот вывод указывает на то, что должна быть другая классификация KC. Сравнение этих новых субпопуляций KCs между родственными видами может выявить нейронные и / или молекулярные субстраты, участвующие в социальном поведении.Недавно разработанные технологии, такие как одноклеточная RNA-Seq [102,103,104], вероятно, будут полезны для всесторонней идентификации субпопуляций KC у медоносных пчел и генов, предпочтительно экспрессируемых в каждой субпопуляции. Путем трансгенеза с использованием piggyBac или нокаута с использованием CRISPR / Cas9 можно управлять экспрессией генов в конкретных нейронах, если доступны соответствующие промоторы для управления экспрессией короткой шпильки РНК в интересующих клетках [93]. Кроме того, наблюдение или манипулирование нейронной активностью с помощью визуализации кальция и оптогенетики, соответственно, также будет полезно для выяснения причинной связи между нейронами и поведением [105,106].В будущем можно будет проверить, регулируют ли эти гены-кандидаты или нейроны социальное поведение с помощью этих методов. Поскольку эти методы трансгенеза или «нокаута» эффективны даже в поколении F1 (гетерозиготные рабочие; A), производство трансгенных медоносных пчел может быть достигнуто с относительно меньшими трудозатратами [60].

4. Выводы

Несмотря на обширные исследования, причинно-следственная связь между генами / нейронами мозга и социальным поведением медоносной пчелы еще не была продемонстрирована с использованием генетических методов.Недавнее радикальное усовершенствование инструментов для генетических исследований позволит преодолеть застой в функциональном анализе генов / нейронов медоносной пчелы. Помимо анализа идентифицированных в настоящее время генов-кандидатов / нейронов, было бы полезно дальнейшее изучение генов-кандидатов / нейронов, коррелирующих с социальностью, с использованием новых технологий.

Число видов, геном которых был секвенирован, увеличивается, и сообщалось о функциональных анализах с использованием перепончатокрылых насекомых, помимо медоносной пчелы.Сообщалось о генных манипуляциях пилильщика, Athalia rosae , который принадлежит к основной группе перепончатокрылых, Symphyta, и паразитоидной осы, Nasonia vitripennis (Apocrita) [57,107,108]. У муравьев (Formicidae), которые развили эусоциальность независимо от медоносной пчелы, поведенческая и развивающая функция orco , которая важна для функции пахучих рецепторов, была проанализирована с помощью CRISPR / Cas9 [109,110]. Будущее сравнение функций генов, регулирующих социальное поведение у медоносной пчелы, и ортологичных генов у этих примитивных перепончатокрылых насекомых или насекомых другого социального происхождения, позволит по-новому взглянуть на вклад молекулярных и нейронных изменений в эволюцию социального поведения у остроконечных насекомых.

Часть 1 — Генетика медоносных пчел — Партнерство с информацией о пчелах

Меня всегда восхищали королевы и рабочие. Фактически, я потратил степень магистра на изучение механизмов, которые производят маток и рабочих. Я хочу посвятить следующие три статьи в этом и последующих выпусках, обсуждая сложные процессы, которые управляют тем, как яйцо становится рабочим или маткой. Вы можете рассчитывать на эти три штуки:

• Генетическая книга жизни — основы генетики медоносных пчел
• Как генетика и окружающая среда формируют рабочих и маток медоносных пчел
• Отличия королевы от рабочих

У медоносных пчел есть система определения пола (трутни-самцы против маток-самок или рабочих), известная как гаплодиплоидия.Это несколько отличается от определения пола человека ( Рисунок 1 ). У людей и мужчины, и женщины несут по две копии каждой хромосомы (обе они диплоидны), одна унаследована от отца, а другая — от матери. Люди мужского пола возникают потому, что у них есть определенная половая хромосома (Y-хромосома), которой нет у женщин. Что касается медоносных пчел, у пчелиной матки есть специальный отсек в ее теле, чтобы нести сперму, полученную в результате предыдущих брачных событий, и она определяет, оплодотворять ли каждую яйцеклетку во время снесения.Самцы развиваются из неоплодотворенных яиц и поэтому несут только один набор хромосом (гаплоид), а самки развиваются из оплодотворенных яиц и обладают двумя копиями каждой хромосомы (диплоид). Самки получают ДНК от обоих родителей, а самцы получают ДНК только от своей матери. . Забавный факт BIP: самцы медоносных пчел не имеют отцов

Рисунок 1: На рисунке выше показано определение пола человека. Каждая полоса представляет половую хромосому.Также стрелки показывают, как эти хромосомы передаются будущему потомству. У людей есть так называемая система определения пола XX / XY. В этой системе пол определяется парой половых хромосом. В то время как у людей всего 23 пары хромосом, 2 (X и Y) определяют пол человека. У женщин обычно есть две одинаковые половые хромосомы (XX), а у мужчин — два разных типа половых хромосом (XY).

Рисунок 2: Выше показана генетика рабочих пчел и маток.Полоски обозначают хромосомы. Рабочие женщины и матки являются результатом оплодотворения, которое представляет собой процесс слияния яиц самок королевы со спермой трутней самцов. Эта комбинация дает диплоидное яйцо и содержит хромосомы как самца трутня, так и самки королевы. Хотя для простоты я просто показываю 1 хромосому, у медоносных пчел 16 хромосом (по сравнению с 23 для человека). В этом примере диплоидное потомство унаследует хромосому от набора дрона и набора королевы, то есть «белую» хромосому и «черную» хромосому.Уникальные для медоносных пчел диплоидные самки могут развиваться либо в матку, либо в рабочую. Это зависит от питания, которое они получают во время развития.

Рисунок 3: На рисунке выше изображена генетика рабочего-несушки. У рабочих-несушек недостаточно развиты репродуктивные черты, поэтому они не могут спариваться с трутнями. Из-за этого они не могут оплодотворять яйца и производить рабочих самок или маток. Однако рабочие-несушки могут производить неоплодотворенных гаплоидных самцов.Это последняя попытка колонии передать свой генетический материал будущим поколениям.

Рисунок 4: На рисунке выше изображена королева, откладывающая яйца трутня. Королевы могут откладывать оплодотворенные или неоплодотворенные яйца. Обычно это зависит от размера клетки, поскольку матки откладывают неоплодотворенные яйца трутней в более крупные клетки трутней.

Рисунки 2-4 суммируют генетические различия между диплоидными самками и гаплоидными самцами.Чтобы самки могли развиваться, им нужен другой генетический рецепт, как у матери, так и у отца. Диплоидные самцы — отличный пример того, насколько важны эти различные генетические рецепты в определении пола. В некоторых случаях диплоидные самцы могут стать результатом получения идентичных хромосом от отца и матери. Это может быть результатом очень инбредных популяций и приводит к бесплодию самцов ( Фигуры 2 ).

Королевы — единственные особи в колонии, которые могут производить как диплоидных рабочих женщин, так и маток, а также производить гаплоидных самцов.Я коснусь того, почему рабочие не могут производить диплоидных самок, в более позднем блоге, но я опишу более подробно в Рисунках 3-4 . Рабочие могут откладывать дронов, потому что рабочие могут откладывать неоплодотворенные яйца. По сути, рабочие не могут спариваться или хранить сперму, поэтому они производят только гаплоидных самцов.

Рисунок 5: На рисунке выше показана высокоинбредная популяция. В этом примере матки спаривались со своим братом или сестрой, у которых одинаковые хромосомы.Приведенный выше пример диплоидного потомства получил белую хромосому от отца и белую хромосому от матери, что приводит к диплоидным самцам. Эти самцы не выживают в природе, потому что колония немедленно их удаляет. Тем не менее, удаление диплоидных самцов приводит к пятнистой структуре расплода после спаривания.

Гаплодиплоидия интересна и важна для семей медоносных пчел, но зачем среднему пчеловоду знать эту информацию? На это есть несколько причин: 1) эта информация помогает нам понять и улучшить системы спаривания, 2) определение пола позволяет нам понять, почему медоносные пчелы не переносят инбридинга, 3) эта информация может помочь нам понять, почему и как королевы терпят неудачу, и 4) Генетика — важный аспект пчеловодства, но в будущем генетика станет неотъемлемым компонентом более устойчивого пчеловодства.

Генетика медоносных пчел завораживает. Если вам понравилось читать этот блог так же, как мне понравилось его писать, следите за следующей статьей о том, как генетика и окружающая среда формируют рабочих и матку медоносных пчел.

Ура!
Гаретт Слейтер

Команда передачи технологий Среднего Запада

Университет Миннесоты
Bee Informed Partnership

Генетика медоносных пчел: где же чудо?

Долгое время генетика была ответом на наши сельскохозяйственные проблемы.Я имею в виду не современный генный сплайсинг, при котором вы комбинируете гены разных видов, а старомодное разведение, при котором вы скрещиваете отобранных вручную особей, чтобы усилить их лучшие черты. Этот традиционный метод позволил получить более крупные, более толстые, устойчивые к болезням и высокоурожайные растения и животных, которые составляют основу современного сельского хозяйства. С годами он дал нам больше молока, более крупную вишню, более сладкие яблоки, устойчивые к фитофторозу помидоры, розовые нарциссы и множество пород собак.

Случайно мы сделали то же самое с нежелательными организмами.Метициллин-резистентный Staphylococcus aureus (MRSA) и аналогичные патогены возникли, потому что мы убили большинство, но не всех людей. Те, кто выжил, были самыми сильными, лучше всего адаптированными и наиболее способными выжить, несмотря на антибиотики. Тот же принцип отбора работает в обратном направлении. Ближе к дому мы вывели клещей Varroa , устойчивых практически ко всему, что мы в них бросаем.

Почему мы не разводим лучших пчел?

Так почему бы нам просто не разводить лучших пчел? Что так долго?

Ответ здесь прост: у нас уже есть.С медоносными пчелами селекционеры сотворили всякие чудеса. Они могут создавать нежных пчел, хорошо перезимовавших пчел, пчел с повышенным производством меда и даже пчел, которые справляются с клещами Varroa . Разведение — не проблема.

Проблема с медоносными пчелами возникает после того, как матки покидают заводчика. Признаки, полученные от маток медоносных пчел в тщательно контролируемых программах разведения, вскоре исчезают, когда дочерям этих маток разрешается спариваться с открытым поголовьем. Через одно или два поколения потомки этих супер-пчел вернутся к исходной точке.Почему это продолжается?

Генетические препятствия

У проблемы много причин, но на ум приходят четыре.

1. Медоносные пчелы в Северной Америке долгое время имели ограниченный генофонд. Частично это связано с Законом о медоносных пчелах 1922 года, который запретил ввоз медоносных пчел в Соединенные Штаты. Идея заключалась в том, чтобы предотвратить проникновение в страну возбудителей болезней медоносных пчел, в частности, трахейных клещей. Но непреднамеренным последствием было отключение потока генов из родных земель медоносных пчел.
2. В геноме медоносной пчелы ограничено количество генов, позволяющих проводить детоксикацию. Вместо того, чтобы быстро развиваться, чтобы защитить себя от угроз окружающей среды, медоносная пчела использует другие механизмы, такие как гигиеническое поведение, прополис и жертвоприношение индивида на благо колонии. В то время как комары, тараканы и даже клещи Varroa становятся устойчивыми, казалось бы, в мгновение ока, медоносная пчела более генетически стабильна и менее изменчива
3. Медоносная пчела, как и все перепончатокрылые, гаплодиплоидная.Гаплодиплоидия означает, что некоторые люди имеют два набора хромосом (диплоид), а некоторые — только один набор (гаплоид). Если ваши познания в генетике ограничены, достаточно сказать, что гаплодиплоидия — это странно и работает не так, как простая менделевская генетика, которую вы изучали в старшей школе. Эта сложность затрудняет разведение. У медоносных пчел самцы производятся из неоплодотворенных яиц, что означает, что каждый трутень имеет только один набор [1] хромосом. У пчел-самок, как рабочих, так и маток, два набора.У большинства животных все особи имеют два набора хромосом.
4. Мед пчелиный многогранный. Полиандрия означает «много мужчин» и относится к тому факту, что пчелиная матка спаривается много раз. Наличие множества самок само по себе не является чем-то необычным, но пчелиная матка хранит всю сперму в своем теле до конца своей яйцекладочной жизни. Поэтому, когда она откладывает яйца, яйца оплодотворяются разными самцами. Каждое из этих разных сцеплений представляет собой отдельное подсемейство в выводковом гнезде. У рабочих любой подсемейства одни и те же мать и отец, и их называют «суперсестрами», потому что у них около 75% общих генов.У рабочих, принадлежащих к разным подсемействам, одна и та же мать, но разные отцы. Они известны как сводные сестры и имеют около 25% общих генов. Когда люди спрашивают: «Почему мои пчелы все разного цвета?» вот и ответ: они представляют разные подсемейства в одном гнезде.

Успешные пчеловоды скрещивают маток и трутней, демонстрирующих искомые характеристики. Те, кто наиболее успешен, используют инструментальное оплодотворение и умеют управлять беспилотными матерями.Действительно полезно иметь отдаленный остров или обширные участки земли, свободные от других колоний. Успешные заводчики наводняют свой район приемлемыми дронами и тем самым изменяют генофонд в свою пользу. Это особенно важно при разведении на устойчивость Varroa и гигиеническое поведение, потому что все гены рецессивны.

Пчеловодство в реальном мире

Но вернемся к проблемам. В реальном мире тщательно выращенная и осемененная королева будет работать так, как рекламируется.Скажем, например, вы покупаете матку, выведенную и повязанную для гигиенического поведения. Ее потомство, скорее всего, покажет желаемый признак, и будут отправлены клещи Varroa . Но в какой-то момент колонии собираются, и королева теряется в дебрях.

Если вы не вмешаетесь, одна из ее дочерей станет новой королевой. Она несет желаемые черты и от ее матери, и от отца, но когда она спаривается, она спаривается с местными дронами. Возможно, у некоторых из этих отцов есть гигиенический ген, особенно если некоторые другие местные пчеловоды покупали пчел у того же заводчика.Но у большинства дронов такой особенности нет.

Это игра с числами

Представьте, что местный пчелиный клуб в городе только что купил 250 упаковок у производителя на юге. Предположим на мгновение, что все они выжили. Тогда у вас будет, по крайней мере, теоретически 250 маток, каждая из которых откладывает 1000 яиц в день в течение апреля, мая и июня. Если предположить, что 15% этих пчел — дроны, то в течение этого трехмесячного периода в вашем районе будет (250 x 1000 x 90) x 15% или 3 375 000 дронов.И это всего лишь дроны из новых пакетов, а не из старых и диких колоний. И все они горят желанием спариться с потомством вашей гигиеничной королевы.

Конечно, это приблизительные цифры, но суть ясна: если вы принесете королеву с устойчивостью Varroa в область, где много пчел, но мало сопротивления Varroa , эта черта скоро исчезнет.

Изменение местного генофонда требует времени

Те пчеловоды, которые успешно выращивают пчел, не нуждающихся в лечении, обычно работают в одном и том же районе в течение многих лет и, по крайней мере, в некоторой степени защищены от посторонних поставок.Эти два фактора означают, что они оказали большое влияние на популяции диких пчел в их районе. Другими словами, они смогли заполнить свою территорию «хорошими» генами, поэтому существует более высокая вероятность того, что их королевы будут спариваться с дронами, которые также имеют черты устойчивости к Varroa . Нет ничего необычного в том, чтобы слышать о пчеловодах, не нуждающихся в лечении, которые охотно раздают устойчивые стада новым пчеловодам в своем районе, чтобы они не ввозили пакетных пчел.

Если ваша новая матка спаривается 16 раз, и только один или два из этих спариваний происходят с дроном с генами, устойчивыми к Varroa , у вас будет максимум два подсемейства в вашем улье, демонстрирующих эту черту.Если предположить, что все подсемейства представлены одинаково, это будет примерно 1/8 пчел или 12,5% — возможно, слишком мало, чтобы принести много пользы. Чем больше дронов с устойчивостью к Varroa в области, тем больше у вас шансов увидеть некоторое сопротивление, именно поэтому мы видим очаги сопротивления Varroa , где проводилось много разведения. Перенести это сопротивление в другую часть страны — непростая задача.

Сводка

Таким образом, стойкий пчеловод с большим количеством ульев может значительно изменить генофонд в свою пользу.