Отзывы СПб — Мёд
Здравствуйте. Скажу сразу, краткость в отзывах — это не про меня. Заказывал мёд у Евгения два раза (и далеко не последние). В первый раз заказал набор «Свежачок» (очень выгодный, рекомендую!) + каштановый мёд и дегустационные пробники (очень удобная вещь, кстати). Во второй раз в ход пошла медоперговая паста + дягилевый и кленовый меда (и подарок для коллеги по работе). Это восторг! Сам не был любителем мёда с самого детства (из того что пробовал вообще, нравился только гречишный сорт). И тут набрёл на сайт Евгения, в поисках чего-то к чайным посиделкам с книгой (чего-то ещё и полезного). Выбор всякого-такого очень большой и разнообраный, глаза разбегаются тут же, не сговариваясь. Цены, среди всез интернет-магазинов, самые адекватные, на мой взгляд. Так вот. Те люди, кто не любит данный продукт из-за вкуса, и кто хочет попробовать, но не знает, с чего начать — ребят, берите кориандровый и кленовый сорта — не пожалеете! Кратко: вкус кориандрового мёда- нежнейшая сливочная помадка (и чем он засахаренней — тем «сливочность» вкуса сильнее), с легким медовым послевкусием, а кленовый — это фантастически душистый цветочный сироп, медовый оттенок у него тоже идёт на втором месте. Полнейшее восхищение! В целом весь мёд очень вкусный, НО, именно эти два сорта теперь делят первое место на одной полке с гречишным, а на втором — умопомрачительная медовоперговая паста (еще одна моя любовь в сладостях). Редкий каштановый мёд тоже вкусный, кстати, но тяжелый сам по себе, как в текстуре, так и во вкусе(!). Его стоит есть только как самостоятельное дополнение к чаю (проверено!). Это все о самом мёде. А теперь об остальном. Доставляли мне посылки транспортной компанией СДЭК. Все пришло аккуратно упакованное, без повреждений. Ни одной капли ценного продукта мимо пролито не было!. Приятное глазу офомрление самой тары, яркие цвета радующие глаз, каждая баночка (включая пробники) подписана (ошибиться в том, какой мёд ешь, не выйдет). То же касается и подарочных наборов. Я брал «Богатырь» в котором: изящная резная коробочка с приятным пожеланием (тут дается выбор), девять аккуратных стеклянных баночек с разным мёдом, с яркой паллитрой цветов- настоящее эстетическое удовольствие! Коллега была в полном восторге! и шутила, что есть эту красоту жалко. В самом сервисе, конечно, была «маленькая ложка дёгтя» — информацию о заказе нужно «вытаскивать клещами». Но, реагируют быстро, поэтому данный минус сгладился. Качество самого продукта и доставки — отличное! Спасибо большое за старания всем работникам! Всем активно активно рекомендую!
Табачные компании: пчелы vs мед
Любопытная реплика прозвучала от топ-менеджеров Philip Morris (NYSE:). Руководители главной табачной компании заявили, что сигареты можно приравнять к бензиновым автомобилям. Следовательно, при соответствующей политике властей через 10 лет можно будет полностью отказаться от этого продукта. То бишь, от сигарет, папирос, сигарилл, сигар, трубочного табака и прочая и прочая…
Представители компании сошли с ума и решили отпилить тот сук, на котором сидят?
Сегодня каждый сходит с ума по-своему, поэтому подобные вещи практически не удивляют. Однако в данном случае за PM можно не переживать, и вот почему. У этой медали, как часто бывает, есть две стороны.
1. (Второстепенная): такое выступление, очевидно, последовало в угоду британским властям и их мягкой политике в отношении вейпов, а также других альтернатив сигаретам. Красавцы из PM просто переобулись на ходу в соответствии с духом времени, причем скорость данного переобувания весьма впечатляет.
2. (Ключевая): задача подобных словесных интервенций – отвлечь внимание и погасить нездоровый ажиотаж вокруг новой перспективной для PM сделки.
Philip Morris ведет переговоры о приобретении британского фармацевтического бизнеса Vectura Group (LON:). Именно эта компания поставляет в британские государственные больницы лекарства для борьбы с болезнями, вызванными курением.
Представители табачного гиганта настаивают на том, что сделка с Vectura является частью цели по созданию «оздоровительной компании». Антитабачные активисты, напротив, утверждают, что Philip Morris не может быть частью решения проблемы курения и просят правительство заблокировать данную сделку.
Вот и все – бизнес и ничего личного. Ребятки из PM набирают очки и правильно делают. В современном фарисейском мире подобная тактика часто не только «прокатывает», но и имеет определенный успех. О, времена, о нравы!
Здесь не лишним будет вспомнить, что пока Philip Morris пытается проникнуть в фармацевтический сектор, British American Tobacco (NYSE:) и Imperial Brands (LON:) имеют интересы на рынке каннабиса. И это вполне логично на фоне антитабачных кампаний: лидеры отрасли стремятся максимально диверсифицировать свой бизнес. Это для них вопрос выживания.
Перестройка бизнеса – это интересная и многоуровневая задача. Любопытно будет следить, как лидеры табачного мира с этим справятся. Впрочем, вероятно, совсем скоро «табачными» назвать их будет можно с большой натяжкой.
Для решения этой задачи необходимо иметь прочный финансовый тыл, который обеспечит и свободу маневра на долговом рынке.
Давайте посмотрим на финансы Philip Morris, British American Tobacco, Altria и Imperial Brands.
Табачные компании
Полагаем, что лидеры отрасли – наиболее очевидные кандидаты для сбалансированной стратегии.
У Philip Morris выше темпы роста финансовых показателей и ниже долговая нагрузка. Зато British American Tobacco при в целом сопоставимых показателях выглядит дешевле по мультипликаторам. Altria (NYSE:) – более волатильная акция, ну а Imperial Brands, очевидно, – более рискованный вариант для агрессивной стратегии. Настораживает только сильное падение выручки в 2021 г.
Сеть медицинских центров Мед Технолоджи
2nd Feb 2020They Got me back on feet !!!!
I was a tourist in Moscow fr om London and had a stroke. After spending some days in another hospital I was told about The Lyadov Clinic. I can recall my physical and mental state at that time. I was confused, scared, worried, didn’t know what a stroke was, very stressed and I don’t speak Russian. I actually thought it was the end for me. I was not in a good state.
As soon as I arrived there was somebody waiting for me at the entrance, I was taken straight to my room and the whole Lyadov system came to life. Within minutes there was a team of professionals around me, each person knew exactly what needed to be done, it felt like I was in the right place. But, I was waiting for something negative or worrying to happen, it can’t be this good, nothing is perfect. I was wrong, this place was perfect for me.
Very soon there was a detailed plan of action with a timescale, a set of clear objectives and aims focused on getting me better. But they also wanted to know what caused the stroke. This really did feel like a complete, full and thorough diagnosis and treatment plan. For me, this desire to find out why I had a stroke and not only fixing my problems is what makes Lyadov so special. The quality of everything was far higher than back in London.
The clinic is clean, rooms are clean and bright, food is amazing (they even peeled my boiled egg for me for breakfast) all the staff are friendly and professional, considerate and respectful , the doctors have a very very very high level of experience knowledge and expertise, state of the art equipment is used everywhere. This means that the whole system works as one and treatment can be refined if needed because all the various experts are in the same place. I arrived unable to walk and departed after 19 days capable of walking out of there, they really did ‘Get me back on my feet’. The attention to detail of each and every aspect of my care was truly amazing.
The doctors even helped provide medical reports, updates, English translations to my travel insurance company in London. This was far beyond what a normal doctor/consultant would help with. Medical doctors are Medical doctors not administrators, but this help also added to the overall excellence of the clinic.
Thank you so much to everybody, without you guys I don’t know wh ere I’d be today. Special thanks must go to Dr Vitaly who was my bridge between Moscow and London helping me understand what was happening in English, he certainly did more than expected to help me.
But the star for me was Dr Aleksei, I am still amazed at the level of knowledge this gentleman has. Some days he would come and notice something needed to be adjusted and knew exactly what to do in 1 second, and it always worked. Dr Aleksei I salute you Sir. You have no choice but to respect the experts that work at Lyadov.
Eternally grateful
Jimmy from London
2nd Feb 2020 They Got me back on feet !!!! I was a tourist in Moscow fr om London and had a stroke. After spending some days in another hospital I was told about The Lyadov Clinic. I can recall my physical and mental state at that time. I w…
Получение, оформление и замена полиса ОМС в Калининградской области
Полис обязательного медицинского страхования (ОМС) дает право
застрахованному гражданину на получение доступной и своевременной медицинской
помощи в медицинских организациях, работающих в системе ОМС, на бесплатное
оказание медицинской помощи на всей территории РФ в объеме, предусмотренном
Программой государственных гарантий оказания гражданам РФ бесплатной
медицинской помощи, утверждаемой ежегодно. Полис ОМС действует на всей
территории РФ и должен находиться на руках у застрахованного гражданина. При обращении
за медицинской помощью застрахованный обязан предъявить полис ОМС и документ,
удостоверяющий личность.
Курьерская доставка полисов обязательного медицинского страхования
Страховая компания «СОГАЗ-Мед» предоставляет возможность курьерской доставки полисов обязательного медицинского страхования застрахованным лицам в установленных случаях: инвалидам, лицам с ограниченными возможностями, лицам пожилого возраста, многодетным матерям и иным категориям. Также на сайте компании предусмотрена возможность диалога с застрахованными лицами в виде онлайн-чата (рубрика «вопрос-ответ»). Помимо этого, в компании «СОГАЗ-Мед» предусмотрено наличие круглосуточного многоканального телефона 8-800-100-07-02, обеспечивающего возможность для обращений граждан в режиме ожидания ответа.
Информирование застрахованных лиц об оказанной медицинской помощи и ее стоимости за счет средств ОМС
В соответствии с поручением Президента Российской Федерации от 25.07.2014г. №Пр-1788 страховые медицинские организации осуществляют индивидуальное информирование застрахованных лиц об оказанной медицинской помощи и ее стоимости за счет средств ОМС.
Как получить информацию об оказанной медицинской помощи и ее стоимости за счет средств ОМС?
1. Застрахованные лица могут обратиться лично либо через представителя в офисы страховой компании с письменным заявлением о получении данной информации. Доверенному лицу при себе необходимо иметь не только документ, удостоверяющий личность, но и доверенность на представление интересов ЗЛ, оформленную в простой письменной форме.
2. Подать заявление можно в центральном офисе Калининградского филиала СОГАЗ-Мед, расположенного по адресу: г. Калининград, пл. Победы, д. 4, 3 этаж, с 09.00 до 17.30 ежедневно (кроме субботы и воскресенья), а также в других пунктах выдачи полисов СОГАЗ-Мед. Информация будет предоставлена гражданину в течение 30 дней с момента подачи заявления, но не ранее 45 суток с момента окончания лечения или диагностического исследования.
3. Информацию для граждан доступна в электронном виде Личном кабинете электронной регистратуры Калининградской области на сайте medreg.gov39.ru. Для входа на сайт необходимо указать номер паспорта или свидетельства о рождении (без серии), номер полиса или временного свидетельства.
Полис ОМС с доставкой на рабочее место!
Внимание руководители организаций и предприятий Калининградской области! АО «Страховая компания «СОГАЗ-Мед» предоставляет Вам и Вашим сотрудникам возможность максимально сэкономить личное и рабочее время - оформить полисы ОМС единого образца непосредственно на рабочем месте.
Специалисты Центрального офиса «СОГАЗ-Мед» готовы приехать в любое удобное для Вас время для оформления и, в последующем, выдачи полисов ОМС на рабочих местах. Сотрудники Вашего предприятия смогут оформить полисы ОМС единого образца для себя и своих близких.
Сегодня любая организация и трудовой коллектив может воспользоваться нашей услугой абсолютно бесплатно!
Помимо оформления полисов ОМС единого образца сотрудники СОГАЗ-Мед при проведении выездных мероприятий осуществляют консультирование работников предприятий и организаций по всем вопросам защиты прав застрахованных лиц в системе ОМС.
Со списком необходимых документов и формой доверенностей вы можете ознакомиться в разделе Получение полиса ОМС
Для организации оформления полисов ОМС в офисе предприятия или организации достаточно просто направить заявку в произвольной форме на адрес: [email protected], либо связаться с нами по телефону Центрального офиса +7(4012) 998-521
Полезная информация для молодых и будущих мам
СОГАЗ-Мед дает возможность молодым и будущим мамам получить полис ОМС для новорожденных без очередей. Для этого необходимо позвонить по номеру контакт-центра 8-800-100-07-02 и заказать оформление полиса ОМС на дому. Приглашаем всех мам города Калининграда воспользоваться этим предложением и заказать оформление полиса новорожденному на дом. Напоминаем, что полисы единого образца действуют на территории всей Российской Федерации.Работа контакт-центра по вопросам ОМС.
Телефон контакт-центра Территориального фонда ОМС: 8-800-250-91-22
Звонки для граждан бесплатные.
Телефон «горячей линии» ТФОМС Калининградской области: 8(4012) 31-36-00
График работы «горячей линии»: Пн-Пт: 08.30-17.30.
Телефон контакт-центра Калининградского филиала
АО «Страховая компания «СОГАЗ-Мед»: 8 800 100 07 02
Основными задачами контакт-центра являются:
· организация защиты прав и интересов граждан на получение бесплатной медицинской помощи по территориальной программе обязательного медицинского страхования на территории субъекта Российской Федерации;
· информирование граждан об их правах на получение качественной медицинской помощи по программе обязательного медицинского страхования;
· организация «обратной связи» с населением субъекта Российской Федерации для получения информации, касающейся вопросов обязательного медицинского страхования;
· обеспечение объективного, всестороннего и своевременного рассмотрения обращений по вопросам медицинского страхования, а также пресечения нарушений законодательства в сфере обязательного медицинского страхования.
При обращении в контакт-центр подготовьте заранее ФИО и номер полиса обязательного медицинского страхования.
Получить консультацию по вопросам ОМС Вы можете по адресу:
г. Калининград, пл. Победы, д. 4, подъезд 4
Телефон контакт-центра 8-800-100-07-02
Показатели деятельности филиалаЕвгений Чичваркин и Татьяна Фокина: барышня и хулиган
Чичваркин родился на краю Москвы, «последнее здание было в городе». «Приличная трехкомнатная квартира, у меня своя комната была с детства. Книжек тоже было много. Помню, за первым слоем на полке стоял второй – книги, которые не должны были бросаться в глаза. Оттуда я утащил «Интердевочку», «Мастера и Маргариту».
У Чичваркиных любили принимать гостей, у Фокиных с этим было строго. «Мы с Женей смеемся, что я реализую какие-то свои детские мечты, – говорит Татьяна. – Потому что я фанатично приглашаю гостей. Проклинаю потом себя, потому что нужно их развлекать, готовить. Но при этом все равно получаю удовольствие. Это такой жуткий комплекс: мне всегда хотелось иметь дом, куда бы все могли просто позвонить и сказать: «А можно я заскочу?», «Ой, а можно мы придем вшестером?», «А можно с детьми?» А можно».
В их лондонском доме любимейшие гости – ресторатор Георгий Бухов-Вайнштейн, акционер сети Burger & Lobster. Банкир Григорий Гусельников, бывший акционер латвийского Norvik Bank, а ныне патрон культурной жизни русского и даже нерусского Лондона, с женой Юлией. Партнер Чичваркина еще по «Евросети», а теперь и по Hide Тимур Артемьев. «И еще огромное количество менее светских, но очень приятных местных русских». Приезжают «вечно голодные Женины старшие дети». Случаются и радостные новые знакомства. «Недавно Света Бондарчук с Сережей (мужем, композитором Сергеем Харченко. – Прим. «Татлера») приехали делать съемку – мы не расставались сорок восемь часов, – рассказывает Татьяна. – До этого Женя со Светой были лишь заочно знакомы, а казалось, что мы давно дружим. Мы были в запое эмоциональном и не эмоциональном друг от друга, от общения, от еды». «Выпили ящик шампанского, пошли в баню», – добавляет Евгений.
Сейчас за их спинами на кухне тоже стоят какие-то ящики. Стратегический запас на случай приезда вольноотпущенных московских гостей? Нет, посылка самим себе в Юрмалу. Там Евгений с Татьяной готовятся въехать в новый дом. «Это именно мой – мне очень важно это подчеркнуть, скорее для себя, – мой дом, – говорит Татьяна. – Первый и единственный, который я построила на свои деньги, позанимав у всех. Я влюбилась в Юрмалу, когда мы ездили к Грише Гусельникову с Юлей на дни рождения. Так она напомнила мне Ленинградскую область! А поскольку Женя, понятное дело, в Россию попасть не может, это было очень логичным местом, куда…» «Попасть, может быть, и может…» – комментирует Евгений. «…Куда будут приезжать друзья, родственники», – продолжает Татьяна. Стройка закончилась во время карантина, так что готовым свой дом Чичваркин с Фокиной еще не видели. Рассказывают, что он простой, деревянный, «в лесу, в соснах». Стоит в Асари, тишайшей части Юрмалы, до которой не долетает светская пыль концертного зала «Дзинтари». «Хотелось, чтобы в тусовку можно было всегда приехать, но чтобы она не происходила вокруг, – говорит Татьяна. – И мне очень нравится эта железная дорога рядом, нравится слышать электричку. Дурацкая эта фраза «все мы родом из детства» очень-очень правильная. Я сразу вспоминаю, как мы с бабушкой ходили на речку. Нужно было переходить железную дорогу. Я помню все эти звуки, запахи».
А в Лондоне Евгений и Татьяна готовятся открыть микрокафе Hideaway. У их ресторана уже было два поп-апа с тем же названием, «они всем полюбились», а тут подвернулось очень правильное место. «Тоже в Мэйфэйре, рядом с магазином, три минуты пешком, на Маунт-стрит, – рассказывает Евгений. – Наши соседи – бутики Celine и Balenciaga, отель The Connaught. В пятидесяти метрах – древнейший магазин ружей. Рядом – один из самых красивых и известных магазинов сигар: микроточка, которая продает сигар на десять миллионов фунтов в год. Джентльмены покупают ружье или сигару и садятся на улице за столик в ресторане, в George или в Scott’s. Крайне буржуазная всегда была улица. Как в 1720–1740-е годы туда въехали буржуи, так до сих пор оно и есть. До ковида вообще нельзя было ничего снять, в особенности именно под ресторан или кафе. Через два квартала от этого места покупка прав аренды под ресторан достигает двенадцати миллионов фунтов. Это только покупка прав».
Над дизайном Hideaway работает микроагентство Studio Caché Фокиной: в этом году она решила «наконец как-то оформить свои эстетические интересы». Формат нового заведения они с Евгением описывают как «забежал, взял с собой вкуснейший круассан и вкуснейший кофе или зашел с подружкой, с другом на ланч (устрицы, бокал шампанского) – и побежал дальше». Меню, как и во взрослом Hide, придумал большой художник Олли Дабу, который за время локдауна набил на доставке руку в приготовлении простых блюд. «Будет, к примеру, пиццетта с белым или черным трюфелем, – говорит Чичваркин. – Так, чтобы это не было бы целой пиццей, а что-то реально маленькое, но достаточно буржуазное». Ну так он еще пятнадцать лет назад говорил: «Ни… [ничего] себе, все – людям».
Доктор Комаровский развеял мифы о масках: «Респиратор может остановить вирус»
Фото: стоп-кадр видео youtube-канала Доктора Комаровского
Доктор Комаровский развеял мифы о масках: «Респиратор может остановить вирус» Фото: стоп-кадр видео youtube-канала Доктора Комаровского
Врач и телеведущий Евгений Комаровский развеял мифы об эффективности одноразовых медицинских масок, а также сообщил, какие средства защиты могут помочь здоровому человеку. Соответствующее видео опубликовано на YouTube-канале доктора.
«Одноразовая медицинская маска никак не может защитить вас от вируса, который летает в воздухе. Поэтому ВОЗ и говорит, что маску должен носить больной человек для того, чтобы его выделения из носа и рта оставались внутри маски. При этом вирус, когда мы чихаем в маску, все равно проникает через ее стенку, но его совсем мало, он не летит далеко, потому что нет крупной капли, сразу оседает. Поэтому маска резко сокращает вероятность того, что больной человек заразен для здорового», — сказал врач.
Он добавил, что «все, что маска может, это не дать разлететься соплям и слюням» болеющего человека. Евгений Комаровский подчеркнул, что «нужно научиться жить в маске, чтобы ее не поправлять»: здоровому человеку (раз всем рекомендовали использовать средства индивидуальной защиты, то маски носят и здоровые люди — поясняет доктор) или тому, кто находится в инкубационном периоде, не следует ее постоянно поправлять, так как она через час все равно намокает. При этом, постоянно ее поправляя руками, человек распространяет свои выделения из носа и рта по окружающим предметам.
Что касается респираторов, то, по мнению Комаровского, они могут остановить вирус.
«Если вы видите врача в маске – это приговор системе здравоохранения. Врач, который контактирует с пациентом с коронавирусом, должен быть только в респираторе», — заявил он.
Также он подчеркнул, что хлопковые тканевые маски нужны только больным людям, чтобы минимизировать вероятность заражения окружающих. Если здоровый человек надел тканевую маску, думая, что она защитит от коронавируса, «это наивная глупость».
«Маски с любыми фильтрами – это чистой воды развод. Если через маску проходит воздух, значит через нее пройдет и вирус», — подчеркнул Комаровский.
Актуальные данные о ситуации с COVID-19 в России и мире представлены на портале стопкоронавирус.рф.
Служба помощи призывникам ArmyHelp, ArmyHelp.by
Мы не продаем военные билеты, не содействуем в уклонении от призыва, не занимаемся подкупом должностных лиц мед. учреждений и военкомата. Заключение о категории годности принимает призывная комиссия. Суть нашей помощи заключается в достижении цели получения военного билета, путем поиска непризывного диагноза, либо подготовке необходимых документов при имеющемся непризывном диагнозе.
Мы помогаем всем начиная с ребят, которые получили (либо ждут) повестку и уже готовятся к призыву, которые уже проходят медицинское освидетельствование в самый разгар призывных мероприятий. Ну а если ты только начал задумываться о взаимоотношениях с военкоматом, тебе тоже сюда, так как наши специалисты с опытом работы юристами в военной сфере расскажут тебе поэтапно, что такое призыв и как реализовать свое право на получение военного билета.
Мы разберем твою ситуацию уже на первичной консультации!
Организуем визит к специалисту учреждения здравоохранения для оценки перспективы твоих документов. Через твоего личного клиент-менеджера мы организуем по твоему поручению визиты в мед. учреждения, без ущерба твоего времени! Поможем сопоставить полученные заключения с актуальным Расписанием болезней для предварительного определения степени годности.
Так как зачастую призывник сталкивается с проблемами, непосредственно в момент прохождения призывных мероприятий, мы окажем тебе компетентное информационное сопровождение при каждой явке в военкомат на всех «этапах» мероприятий призыва.
Наша работа включает в себя как платные, так и бесплатные услуги.
Ты можешь задать нам абсолютно любой вопрос, связанный с военкоматом, и наши специалисты в рамках бесплатной консультации ответят тебе на него по телефону или в офисах компании.
Если так случиться, что призывная комиссия вопреки твоим документам, которые подтверждают твой непризывной диагноз, вынесет в отношении тебя решение «ГОДЕН», мы организуем консультацию адвоката, для формирования твоей позиции и систематизации имеющихся документов с целью обжалования решения призывной комиссии в вышестоящий военкомат или суд!
Ссылка на домашнюю страницу iSpot.tv
A&E ABC Взрослый плавать AMC Канал американских героев Планета животных Антенна ТВ BBC America СТАВКА СТАВЬТЕ ЕЕ Сеть Big Ten Bloomberg HD Bounce TV БРАВО Cartoon Network CBS CBS Sports CMTV CNBC CNN Comedy Central Кулинарный канал Суд ТВ Тайна придворного телевидения CW Пункт назначения Америка Канал Дискавери Discovery en Español Семейный канал Discovery Канал Discovery Life канал Дисней Дисней Юниор США Дисней XD Сделай сам E! ESPN ESPN Deportes ESPN2 ESPNEWS ESPNU Продовольственная сеть ЛИСА Фокс Бизнес Фокс Депортес Fox News Фокс Спорт 1 Свободная форма Предохранитель FX Канал FX Movie FXX К вашему сведению Galavision Игровое шоу Получить ТВ Гольф Великая американская страна Грит ТВ Клеймо Признанные фильмы и мистерии Главные новости HGTV Исторический канал Независимый фильм (IFC) INSP Открытие расследования ИОН Лафф ТВ Продолжительность жизни Фильмы на всю жизнь Логотип Мав ТВ Сеть MLB Сеть Motor Trend Фильмы! MSNBC MTV MTV2 MyNetworkTV Национальная география National Geographic Wild NBA TV NBC NBC Sports Газету Сеть НФЛ НХЛ Ник Ник младшийНик Тунс Ник @ Nite Олимпийский канал Сеть Опры Уинфри Открытый канал Овация КИСЛОРОД Сеть PAC-12 Paramount Network PBS Поп Reelz Channel RFD TV Ездить на ТВ Научный канал Сеть SEC Смитсоновский институт SundanceTV SYFY TBS Подросток Ник Telemundo Теннисный канал Канал Спортсмена Этот телевизор TLC TNT Tr3s: MTV, Musica y Mas Путешествовать Настоящая преступная сеть TruTV ТУДН ТВ Азия ТВ ЗЕМЛЯ TV ONE UniMas Универсальные дети Universo Univision UP TV Сеть США Vh2 Viceland МЫ ТВ Канал о погоде Willow Cricket Zee TV USA, Inc.
Отзыв Евгения (Канада) о фильме «Мед во рту»
Мелкий аферист Уолтер Харш убегал от парня, которого он «избавил» от нескольких затрудненных долларов, когда он попал в аварию (погони на высокой скорости, как правило, заканчиваются так), и сильно сломал ему руку.Когда он лечился в больнице, к нему подошел хулиган
Произведение оказалось олицетворением диктатора страны в Латинской Америке.
Теперь, когда Харш ознакомился с деталями, работа не выглядела такой безобидной, а 50 000 долларов — не такими уж большими деньгами, согласны? Однако Суровый, будучи жадным и не самым умным парнем в округе, решил сделать все возможное, чтобы удержать свой платеж. Неудивительно, что это привело его как раз в самый разгар международного заговора.
У истории был большой потенциал, даже если не обращать внимания на маловероятное совпадение, что Харш не только выглядел , точно , как упомянутый диктатор, но и имел ту же группу крови: O отрицательную (самая редкая).
Я мог это не заметить. Что я не мог не заметить, так это сюжет и персонажей.
С многообещающего начала история превратилась в скучный, медлительный и неинтересный беспорядок, который набрал обороты только в последних парах глав. Персонажи меня тоже не особо интересовали. Причиной тому было полное отсутствие никого, даже отдаленно напоминающего хорошо написанного персонажа. Возьмите местную роковую женщину мисс Мюрц.
Какая трата! Хотя она, несомненно, была женщиной, в ней не было ничего рокового; она была просто невротичной женщиной.Главный герой Уолтер Харш постоянно переключался между глупым и злым гением, в зависимости от требований сюжета. Другими словами, парень был неубедителен, и его упорная глупость не заставила меня полюбить его больше.
Сказав это, в целом история была терпимой и достаточно короткой, чтобы закончить ее, не получая полной и безнадежной скуки. Я почувствовал себя щедрым и дал книге 3 звезды, но на низком уровне. Если вам больше нечего читать, дерзайте, иначе не беспокойтесь.
Поиск недостающих генов медоносной пчелы: уроки, извлеченные из обновления генома
Задний план: Первое поколение сборок и аннотаций геномных последовательностей оказало значительное влияние на наше понимание биологии секвенированных видов, филогенетических взаимоотношений между видами, изучение популяций внутри и между видами, а также повлияло на биологию человека.Поскольку только несколько геномов многоклеточных животных приблизились к завершенному качеству (человек, мышь, муха и червь), есть возможности для улучшения большинства сборок генома. Геном медоносной пчелы (Apis mellifera), опубликованный в 2006 году, был отмечен своим бимодальным распределением содержания GC, которое повлияло на качество сборки в некоторых регионах, и меньшим количеством генов в исходном наборе генов (OGSv1.0) по сравнению с тем, что было бы ожидается на основе других секвенированных геномов насекомых.
Результаты: Здесь мы сообщаем об улучшенной сборке генома медоносной пчелы (Amel_4.5) с новым набором аннотаций генов (OGSv3.2) и показывают, что геном медоносной пчелы содержит ряд генов, подобных геномам других насекомых, вопреки тому, что было предложено в OGSv1.0. Сборка нового генома является более непрерывной и полной, а новый набор генов включает на ~ 5000 больше генов, кодирующих белок, что на 50% больше, чем сообщалось ранее. Около 1/6 дополнительных генов были связаны с улучшением сборки, а оставшиеся были выведены на основании новых данных по RNAseq и белкам.
Выводы: Уроки, извлеченные из этого обновления генома, имеют важное значение для будущих проектов секвенирования генома.Кроме того, улучшения значительно увеличивают геномные ресурсы медоносной пчелы, ключевой модели социального поведения и важной для глобальной экологии посредством опыления.
(PDF) Имитация процессов обучения концепции медоносных пчел с использованием векторных символических архитектур
Аваргес-Вебер, А., Дайер, А.Г., Ферра, Н., Джурфа, М., 2015. Лес или деревья:
предпочтение для глобальной обработки изображений изменено на противоположное по предыдущему опыту с
пчелами.Труды Королевского общества B: Биологические науки 282.
Дайер, А.Г., Рави, С., Гарсия, Дж. Э., 2014. Полет в сложных условиях:
Насекомые могут связывать множественные сенсорные восприятия и какие уроки могут послужить уроками для ма-
chine Vision? Журнал программной инженерии и приложений 7, 406-412.
Элиасмит, К., 2013. Как построить мозг: нейронная архитектура для биологического Cog-
nition. Издательство Оксфордского университета.
Эмрули, Б., Гейлер, Р. В., Сандин, Ф., 2013. Аналогичное отображение и логический вывод с
двоичными кодами разбрызгиванияи разреженной распределенной памятью. В: Материалы международной совместной конференции по нейронным сетям
, стр. 1-8.
Эмрули, Б., Сандин, Ф., 2014. Аналогичное отображение с разреженной распределенной памятью: простая модель
, которая учится обобщать на примерах. Когнитивные вычисления 6 (1),
74-88.
Эмрули Б., Сандин Ф., Дельсинг Дж., 2014.Архитектура векторного пространства для возникающей интер-
работоспособности систем путем обучения на демонстрации. Биологически вдохновленный Cog-
nitive Architectures 9, 33-45.
Галлант, С. И., Окайве, Т. В., 2013. Представление объектов, отношений и последовательностей.
Нейронные вычисления 25 (8), 2038-2078.
Гейлер Р. В., 1998. Мультипликативное связывание, операторы представления и аналогия. В:
Джентнер, Д., Холиоук, К. Дж., Кокинов, Б. Н. (ред.), Достижения в исследовании аналогий:
Интеграция теории и данных когнитивных, вычислительных и нейронных наук
эндов.Новый болгарский университет, София, Болгария, стр. 1-4.
Гейлер Р. В., Леви С. Д., 2009. Распределенная основа для аналогичного отображения. В: The
Proceeding of the second International Conference on Analogy, 2009. pp. 1-10.
Гентнер Д., 1983. Отображение структуры: теоретическая основа для аналогии. Когнитивный
Наука, 7, 155-170.
Джурфа М., Чжан С., Дженетт А., Мензель Р., Сринивасан М. В., 2001. Понятия
«Сходство» и «Различие» в насекомых.Nature 410, 930-933.
Канерва П., 1988. Разреженная распределенная память. MIT Press.
Канерва П., 1997. Полностью распределенное представительство. В: Real World Computing Sympo-
sium. Vol. 97. С. 358-365.
Kanerva, P. 2000. Большие узоры образуют отличные символы: пример обучения на примере
. В: Стефан Вермтер и Р. Сан (ред.). Гибридные нейронные системы. 1778,
с. 194-203.
26
кацнецов | Последние записи
«Конечно, нужны носки», — говорит Дима.Он хорошо одетый сибиряк, и уголки его рта сжимаются от боли.
V на полу, знакомясь с одним из щенков с большими бархатистыми ушами, пока они ждут. «Хотя жарко», — говорит он. «Они… вспотеют? Они мне не нравятся «.
«Вот для чего нужны носки, — говорит Дима. «Вы портите себе обувь, это отвратительно».
«Это туфли», — говорит Ви с безмятежностью атлета-подростка, который действительно верит, что они довольно чистые, потому что все, кого они знают, хуже.«В любом случае я не беру с собой, мне не нужно, если будет жарко».
Дима беспомощно моргает, не в силах не обращать внимания на глупость насчет погоды. «Знаешь, ты хочешь быть готовым», — говорит он. «Ты же не знаешь, что пойдет дождь, станет холодно или что-то в этом роде».
В снова мигает. «Здесь всегда жарко», — говорит он чуть южнее, чем язвительно.
«Если он не хочет, ничего страшного», — говорит Евгений, просто чтобы остановить их. «Вы расстроите собак», и кивает щенку, которого Ви все еще держится за ухо, не обращая внимания, чуть слишком близко .
V фиксирует на нем. «Ага?»
«О, ты будешь выглядеть глупо, я не говорю, что это хорошо. Но ладно, если хочешь, — говорит ему Евгений.
«Я нет», — резко говорит Ви и снова начинает осторожно поглаживать уши щенка большим пальцем, пригнув лицо, чтобы скрыть какую-то улыбку.
Есть, и он немного жалеет об этом, позже, когда он видит фотографии, Евгений видит это по его лицу. Но он смеется и, может быть, больше этого не делает, а может быть, после этого он еще сильнее наклоняется к Евгению за плечи.
—
Другие люди начинают больше обижаться, когда вы вырастаете. Это изменение связано не с тем, как они пытаются причинить вам боль: от некоторых из них легче отказаться, а от некоторых, а может, и большинства, остается прежним. Вам просто становится больно смотреть на людей, зная, что не так, прежде чем они это сделают, потому что вы знали это раньше.
«Привет, привет», — говорит Евгений, толкая Ви в сторону, пока тот не поворачивается ровно настолько, насколько это возможно. У них есть лед еще на двадцать минут или около того, пока ночной парень Майло не приходит и говорит Евгению, что они действительно должны закрыться, но даже он может признать, что они на ночь катались.
В отвечает: «Привет», но даже для него это маленькое.
«Хочешь послушать анекдот?» — предлагает Евгений, обнимая его.
В говорит: «Хорошо», и Евгений знает, что на самом деле не знает, но старается не выглядеть грустным.
«Итак, на этот раз Шерлок Холмс и Ватсон собираются отправиться в поход», — начинает Евгений.
«Это ты сказал», — говорит В. «Во вторник.»
«Это то, что вы думаете. Я русский, я знаю три версии этой шутки, которые намного лучше.Евгений бьется щекой о волосы Ви. «Ну что, как поживаешь? Просто долгая зима? »
В фыркает, резкий звук для него, как будто это было неожиданно. «Здесь даже нет зимы», — говорит он. Похоже, он хочет ее проглотить, но он этого не делает, и он стискивает зубы, глядя на Евгения.
«Скучаете по пражской зиме? Снега много? »
Двадцать пять лет не старше, пока вы не станете старше людей, которыми раньше восхищались. Начинает болеть, глядя на какого-то тупого малыша вдали от дома и видя своего лучшего друга или старшего брата.
«Это были годы», — говорит Ви, как будто не обращая внимания на это, но на самом деле он лишь чуть ближе пожимает плечами, обращаясь к Евгению. «Сейчас вроде ничего нового или чего-то такого».
Евгений считает стропила. «Мм, — предлагает он. Это не плохо только потому, что болит. Это больно, как тренировка, как если не спать всю ночь, чтобы кататься на коньках в тишине, обернутой вокруг вас, как шарф, или встретить кого-то, кого вы не видели годами.
Это было то, что должно было облегчить вам поездку в Вашингтон, а не в любой другой город.Вашингтон был командой России, практически командой России. «Радуйся, — сказали ему, — хотя бы есть и другие русские, — услужливо попытался подумать Евгений, — но никого не было дома».
Алекс перебирал все гласные со своим ударением, и он не понимал, почему Евгений ожидал найти мед за завтраком по утрам или почему он должен был начать носить его с собой, когда его никогда не было. Дима любил березки и автопутешествия, когда они летали над знакомыми открытыми равнинами, и пытался заставить Евгения взглянуть на особо красивые равнины, а Евгению снова хотелось настоящих гор.Здесь никогда не было никого, с кем Саня мог бы поговорить о регби, или покурить по глупым холодным утрам, или кто бы вспомнил его город с ним, когда замерзли реки.
Вы вырастаете и превращаетесь в человека, который чего-то скучает.
«Что сейчас лучше всего в Праге?» он говорит. «Мол, если ты сейчас там, в прошлый раз, когда был дома на зиму, то что там?»
«Бабушка», — говорит Ви, быстро и осторожно, и Евгений это тоже помнит. Находясь на расстоянии двенадцати и тысячи миль от дома, не имея возможности впервые наткнуться на ее объятия; девять, и сидел на полу в спальне для старших мальчиков, откусывая медовый хлеб из бабушкиного пакета, которым Саня был готов поделиться и почувствовать что-то вроде пассивной любви, даже если она немного затхладилась.- Знаешь, до того, как я уехал. Я всегда к ней навещал, на праздники и все такое, помогал на кухне ».
«Ага», — отвечает Евгений, прижимаясь щекой к макушке очень светлых волос Ви. «Я рассказываю вам о пьяном человеке, который ходит в зоопарк?»
—
Бабушка Якуба — милая женщина, которая специально вырастила более хорошего мальчика. Найти ее в чешском Facebook несложно, и она несколько дней обдумывает его просьбу, прежде чем дать ему рецепт с намеренно тонкими инструкциями, чтобы проверить его, как это делают бабушки.Он забирает продукты в русской бакалейной лавке, потому что это не имеет особого значения, и бросает их на кухню Алекса, потому что они там и бесплатны.
«Ой, извините, вы использовали это?» — говорит он и указывает на плиту. «Вы знаете, что это может разжечь огонь, да? Для тебя опасно оставлять его просто валяться дома ».
«Иди на хуй», — говорит Алекс, отвинчивая колпачок от Gatorade зубами и не забывая только ухмыляться после того, как он закончит. Он уходит делать что-то на заднем дворе, о чем Евгений не беспокоится, пока готовится сгущенка, и возвращается, как будто его позвали, как только стало жарко.Конечно, он потерял рубашку.
«Попробуй прикоснуться к этому, и я спасу карамель, а не тебя», — предупреждает его Евгений. Алекс все равно только мычит, и мышцы позади него все равно, рука на пояснице Евгения и натыкается на его лопатки, пытаясь оттолкнуть его голову вниз, чтобы Алексу было лучше видно, поэтому Евгений добавляет: «Я работал над этим».
Алекс игнорирует его, хотя его рука все еще близко и теплая сквозь тонкую футболку Евгения, что означает, что он действительно думает. Когда его нет, он говорит или нащупывает людей более целеустремленно.Карамель теперь может выйти из горячей воды, и он позволяет движению стряхнуть себя, пока Евгений вылавливает ее щипцами и засовывает в холодильник, хотя Евгений особо этого не хотел.
Он возвращается на следующий день, словно с удивлением обнаруживает свою кухню заново, и проверяет все ингредиенты, пока Евгений отмеряет, смешивает и растапливает еще масла на медленном огне.
«Вы уже сделали это. Дважды, — замечает Алекс.
«Три кусочка масла.Теперь вы знаете, почему это так хорошо, — говорит Евгений. «Дай мне это, мне это нужно».
Алекс обиженно облизывает венчики миксера в последний раз, но сдает их. Евгений переворачивает их, чтобы слизывать остатки карамели и масла, и ополаскивает их, прежде чем вернуть в тесто для торта.
«Вы хорошо ладили с детьми», — наконец говорит Алекс. «Собираюсь стать таким лидером, как я». Может быть, вам нужно знать его мягкие долгие гласные, чтобы знать, что он не произносит их каким-то определенным тоном.
«Не совсем», — говорит Евгений, глядя на первый слой в духовке.«Совсем не такой, как ты». Цвет все еще в порядке. Алекс сидит на табурете у стойки, пинает ногами, но все еще смотрит на Евгения.
Может быть, они по этому поводу спорили, а может, не спорят. Евгений сказал: «Нет, не я», но не сказал: «Я не буду тобой», когда имел в виду это. Становится легче подбирать слова, легче говорить людям, что они значат для вас, по мере того, как вы понимаете, что маленькие оттенки ваших слов значат больше, и вы учитесь формировать их лучше, даже когда вы узнаете, что никогда не бывает гарантии, что вы сможете заставить кого-то другого слышать их.
«Что, как будто я не…» — спрашивает Алекс и покачивает плечами.
«Нет», — соглашается Евгений. «Ты, Саша, много. Но ты не делаешь много вещей «.
«Я не готовлю».
«Слава Богу, — говорит Евгений.
«Так что, я просто плакат для детей? Как у тебя было на стене, когда ты был маленьким? » Он берет ложку для смешивания и переворачивает ее. «Или так, что, дети тоже не хотят твоего?»
Евгений смотрит на него. Чтобы называть себя Ником Бэкстремом, нужно обладать уверенностью в себе святого и быть придурком, а Евгений никогда не хотел просить такого одобрения, но Алекс позвонил ему.Алекс любит всех, каждому отвечает, что может затруднить его чтение, за исключением того, что когда он хочет кого-то, он безжалостно дает понять, звоня. У него есть друзья, которых он не забывает обнять, когда видит их, и друзья, которых он до сих пор пишет через 12 часов разницы и годы, и Евгений попадает в список. Алекс хотел, чтобы он выступал в Вашингтоне и на национальных чемпионатах, а также в любой команде, которую собирает Алекс до их первой встречи, и Алекс крутит ему пальцы в гневе прямо сейчас, потому что ненавидит, когда его список неправильно истолковывают.
«Думаю, еще пару лет. Может быть, 12 лет, но Ви еще недостаточно молод, он смотрел на меня, как на тебя, — говорит Евгений, вставляя другой поднос и глядя на него искоса. «Алекс, расслабься».
«Ты сказал это», — ворчит Алекс. «Не говори тупого дерьма».
«Я же сказал, ты не шутишь, Алекс. Нет, вам не нужно, вы были их героем в течение многих лет просто потому, что были, и вы остаетесь им, когда они приходят сюда и все время видятся с вами.Они хотят погнаться за вами, может быть, вы не наблюдаете за ними, спрашиваете, в порядке ли они, зная, что это не так, и заставляете их говорить или чувствовать себя лучше ». Это последний слой, но он не подносит к ним нож, пока они горячие, а Алекс недоволен, поэтому он разносит их через прилавок. «У тебя хорошо получается быть большим, понимаешь? А это … не знаю, немного далековато.
«Теперь я не смешной», — говорит Алекс, но с ложкой покончил. «Что дальше?»
«Я думаю, орехи», — говорит Евгений, и он знает, что нужно отпрыгнуть назад почти вне досягаемости, когда Алекс бросается за ним.Алекс хватает его за запястье, а затем за прилавок, достаточно, чтобы оторвать его от незащищенных пирожных и повернуть к месту Алекса в углу, а затем зацепляет ногу за колено, чтобы удержать его там.
Евгений наклоняется, чтобы удариться носом о лоб Алекса, потому что его руки все еще присыпаны мукой, а затем передумывает и все равно гладит Алекса по волосам, наслаждаясь тем, как они цепляются за тонкие пряди и заставляют вас видеть серебряный блеск. «Я не стану менее глупым только потому, что я взрослый», — говорит он.«Давай, Алекс. Глупо, как я мог быть взрослым до того, как мне исполнился год. Это просто не то, как кто-то может быть тобой ».
Алекс позволяет муке стечь по щекам, осесть на губе, как снег. Он не возражает, не обращает на это внимания, и это его взгляд.
У Евгения вообще не было плаката, как у Мишки на первом этаже или у Наташи из соседнего дома, что, по общему мнению, было очень круто. У Евгения был Youtube, клипы с самых ярких роликов, его друзья, лежащие на полу, вместе рисовали Алекса в тысячи историй.
Каждый день это по-прежнему похоже на гребаную сказку.
Алекс стряхивает взгляд и немного муки, медленно моргая. «Да, я знаю, — говорит он. Евгений поворачивает запястье, которое все еще держит, и Алекс медленно поднимает пальцы вверх по руке. «Задумчиво», — говорит он, как будто переименовывает только то, что уже сказал Евгений. «Не так уж и плохо, если бы я был немного более таким».
Уголок его рта наклоняется, и Евгений тычет в нем, немного липком от карамели и высохшем от муки, пока он не приоткрывает губы, обнажая вместо этого зуб, и Евгений прижимает кончик пальца к его кончику.
«Тебя хватит, нас хватит», — говорит он. «Вы просто что-то еще, для большего. Дайте ребенку несколько лет, и он к этому привыкнет ».
Алекс закрывает рот, немного отстраняется и одновременно втягивает Евгения. «Ага?»
«Так не пойдет», — говорит ему Евгений, позволяя Алексу потянуть. «Я не имею в виду, что он перестанет смотреть на тебя, просто значит, что он научится… быть обычным и с тобой тоже. Потусуйтесь, послушайте, как вы облажались, хорошие песни, посидите вместе, больно.Это реально. Но я думаю, ты думаешь, что восхищаться тобой ненастоящее, настоящие вещи убьют это. Они этого не делают «. Он закрывает глаза рукой. «Это как солнечные очки».
«Мы закончили говорить о Джейке?» Алекс говорит через некоторое время. «Потому что он …»
«Тоска по дому. «Будьте вежливы», — говорит ему Евгений.
«Уже», — отвечает Алекс. «Это ребенок, — собирался я сказать. Очень светлый. И я голоден.
«Ты между мной и орехами», — говорит Евгений. «Я говорил тебе.» Алекс кусает палец и пытается слизать с него немного муки.На самом деле это было не то, что Алекс собирался сказать.
Алекс впивается пяткой в мягкую кожу под коленом, пока не позволяет себе опереться на Алекса, чтобы удержать равновесие. «Я не вижу проблемы», — говорит Алекс, и Евгений сдается и целует все чужие и знакомые голубые глаза Алекса, затем останавливается прямо над его ртом, прежде чем Алекс снова укусит его.
«Или торт», — говорит он и забирает обратно ложку для смешивания.
Грязный мед — WNOR FM99
9 часов назад в спорте
Ангелина Мельникова, знаменитая гимнастка из России, скользила вокруг брусьев, когда по всему миру разлетелись последние новости: ее соперница, американская суперзвезда Симона Байлз, вылетела с соревнований.
9 часов назад в спорте
Алекс Овечкин сообщил, что остается в «Вашингтон Кэпиталз» в истинном стиле Ovi с пятью восклицательными знаками. Еще пять лет и шанс побить рекорд Уэйна Гретцки по количеству забитых мячей в НХЛ.
9 часов назад в спорте
Аарон Роджерс прибыл в Грин-Бей накануне первой тренировки Пэкерс в тренировочном лагере.
10 часов назад в музыке
Всем, кто опасался, что хранилище Принца было заполнено только прикрытиями Билли Джоэла, как шутил сатирический сайт The Onion вскоре после его смерти, не стоит беспокоиться.
10 часов назад в сфере развлечений
Неизданный альбом Wu-Tang Clan, конфискованный Мартином Шкрели после признания его виновным в мошенничестве с ценными бумагами, был продан во вторник за нераскрытую сумму, хотя прокуратура утверждает, что этого было достаточно, чтобы полностью погасить оставшуюся часть его задолженности в размере 7 долларов.После вынесения приговора в 2018 году он столкнулся с судебным приказом о конфискации 4 миллионов долларов.
Вычислительные и транскрипционные доказательства наличия микроРНК в геноме медоносной пчелы | Genome Biology
Вычислительная идентификация предполагаемых miRNA
Мы использовали всю сборку генома медоносной пчелы, чтобы предсказать кандидатуру miRNA. Были составлены три неисключительных набора кандидатов на миРНК. Сначала были идентифицированы последовательности медоносных пчел, гомологичные miRNAs, перечисленным в miRBase [16] (HOM).Во-вторых, были каталогизированы элементы микроконсервативных последовательностей (МСЭ), непрерывные последовательности длиной от 22 до 29 нуклеотидов, которые являются общими и точно консервативными во всех трех геномах Apis mellifera , D. melanogaster и Anopheles gambiae [ 17].
Наконец, немного более длинные пчелиные последовательности (75-90 нуклеотидов), имеющие общие структурные особенности, характерные для miRNA и хорошо совпадающие с аналогичными последовательностями в Drosophila — подход, который мы называем сканированием стебель-петля (SLS) — идентифицировали еще один набор предполагаемых медоносных пчел миРНК.Этот подход не просто помечает регионы со склонностью к образованию петлевых структур подходящей длины, потому что существуют тысячи таких регионов в 235 Mb секвенированного генома медоносной пчелы. Вместо этого сравнения Smith-Waterman с областями генома Drosophila , которые, вероятно, формируют структуры pre-miRNA, использовали для фильтрации и уточнения списка предполагаемых кандидатов SLS у медоносных пчел.
Каждый предполагаемый предшественник miRNA (pre-miRNA), идентифицированный любым методом, был свернут для проверки термодинамической склонности последовательности pre-miRNA к адаптации соответствующей вторичной структуры шпильки — и для проверки того, что зрелая miRNA находилась в стержне шпильки.Мы идентифицировали предполагаемые канонические miRNA медоносных пчел, но методы MCE и SLS также предложили ряд возможных новых miRNA, которые присутствуют, но ранее не распознавались в других геномах.
Объединение результатов MCE и основанных на гомологии методов поиска miRNA предоставило окончательный набор из 65 уникальных локусов-кандидатов miRNA с 66 уникальными предсказанными моделями miRNA для экспериментальной оценки — включая 25 лучших предсказаний, сгенерированных MCE. Этот окончательный набор из 65 локусов miRNA включал 6 предполагаемых miRNA, идентифицированных либо методами гомологии, либо методами MCE, но также с помощью процесса SLS.Однако ни один из кандидатов, идентифицированных только с помощью SLS, не входил в окончательный набор из 65 и не тестировался на экспрессию в этом исследовании. Кандидаты miRNA медоносной пчелы, включая некоторые потенциально новые miRNA и несколько ортологов известных miRNA медоносной пчелы, перечислены в файле дополнительных данных 1. Существовали две модели зрелой и предшественницы miRNA, предсказанные MCE и HOM для одного из предсказанных локусов miRNA. Для каждой модели miRNA медоносной пчелы-кандидата в дополнительном файле данных 1 приводится метод прогнозирования (HOM, MCE и / или SLS), обозначение miRBase, если доступно, последовательности предполагаемой зрелой miRNA медоносной пчелы и предполагаемой области-предшественника, геномные координаты каждого появления зрелые и предполагаемые последовательности миРНК-предшественников в сборке генома пчелы, выпуск 4, расположение относительно кодирующей последовательности (CDS) официального набора генов медоносной пчелы [18] (межгенный, интронный или перекрывающийся CDS), содержание GC домена содержания GC в которые встроена miRNA (описано в [15]), и энергии сворачивания.Свернутые предшественники для некоторых новых miRNA показаны в файле дополнительных данных 8.
Проверка кандидатов miRNA медоносной пчелы с помощью RT-PCR
Для обнаружения и проверки miRNA доступны различные методы, включая методы гибридизации, такие как Нозерн-блоттинг и т. Д. методы с использованием ПЦР (см. обзор [19]). Мы использовали метод RT-PCR, описанный Shi и Chang [20], чтобы проверить транскрипцию многих из описываемых нами миРНК медоносных пчел. Вкратце, этот протокол вызывает полиаденилирование экстрагированной РНК (в нашем случае после отбора по размеру для малых видов РНК путем связывания с субстратом из стекловолокна или разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле) с последующей обратной транскрипцией, примированной поли (Т) адаптер.Затем miRNA-специфические прямые праймеры соединяют с праймером, комплементарным адаптеру RT, для количественной ПЦР-амплификации.
Таблица 1 показывает нормализованные уровни экспрессии в пуле образцов личинок и взрослых пчел для 30 кандидатных miRNAs. Некоторых кандидатов опрашивали с помощью нескольких праймеров, чтобы проверить экспрессию на основе цепей и различить экспрессию предшественников и зрелых последовательностей миРНК, что привело к получению в общей сложности 45 праймеров. Еще 23 праймера либо генерировали артефактные продукты ПЦР в воде или контроле с одним праймером, либо не давали результатов тестов на линейность амплификации.В целом кандидаты, протестированные с прямым и обратным праймерами, показали гораздо более высокую экспрессию одной цепи. В качестве методологического контроля, демонстрирующего специфичность цепи, праймеры для двух вариантов РНК сплайсосомы U4 (C5581a и C5581b) показали сильную экспрессию в предсказанном обратном направлении, тогда как ориентированный вперед праймер для C5581b почти не показал экспрессии. Экспрессия для этого локуса была маргинальной при запросе узкого (обогащенного 18-30 нуклеотидными (нуклеотидными) видами) пула РНК. Праймеры, соответствующие зрелым миРНК, имели тенденцию генерировать более сильный сигнал, особенно при тестировании экстрактов РНК, очищенных в геле (18-30 нуклеотидов).Сопоставление тестируемых праймеров с кандидатами на миРНК появляется в файле дополнительных данных 2, а гель, показывающий количественные продукты ОТ-ПЦР (qRT-PCR) для выбранной РНК размером 18-30 нуклеотидов, находится в файле дополнительных данных 9.
Таблица 1 Описание из протестированных miRNAМы обнаружили 25 потенциально новых miRNA от MCE, 17 из которых были протестированы с помощью qRT-PCR. Двенадцать из них были экспрессированы в одной или нескольких тканях, стадиях, кастах или объединенных образцах РНК, в то время как четыре не имели детектируемой экспрессии (C2327, C4131, C5267 и C6617).Тем не менее, три из отрицательных кандидатов ОТ-ПЦР показали доказательства транскрипции в данных тайлинг-массива (C4131, C6617 и C5267).
C5152a и C5152b представляют собой дискретные предсказания miRNA в физической близости на противоположных цепях (показаны в файле дополнительных данных 1), и оба дают хорошие предсказания шпильки (файл дополнительных данных 8). C5152b похож на Drosophila dre-ame-190, но не идентичен ему. : Экспрессия C5152a и C5152b с помощью RT-PCR была протестирована с использованием нескольких праймеров, и оба праймера F- и D + показали экспрессию (дополнительный файл данных 3).Праймеры F- и D + были разработаны для амплификации зрелых миРНК, предсказанных для C5152a и C5152b, соответственно (дополнительный файл данных 2). Однако сложное перекрытие и антисмысловая ориентация этих двух предсказаний, а также сайты связывания для F- и D + в каждом из C5152a и C5152b не позволяют нам исключить возможность того, что только один действительно экспрессируется как в смысловой, так и в антисмысловой ориентациях.
В целом, мы предоставляем доказательства транскрипции для большинства новых предсказаний MCE, включая примерно две трети новых кандидатов, поддающихся тестированию RT-PCR.Прогнозируемые уровни экспрессии коррелировали между анализами, включающими экстракты РНК, смещенные в сторону мелких видов, с использованием либо селективного осаждения, либо электрофоретического разделения (таблица 1; дополнительный файл данных 3). Дополнительные кандидаты, вероятно, будут подтверждены как имеющие транскрипцию с использованием других методов и тканей медоносной пчелы или этапов жизни.
Валидация миРНК-кандидатов с помощью полногеномного мозаичного массива
Мы также проанализировали результаты двух полногеномных мозаичных экспериментов медоносной пчелы для доказательства того, что наши кандидаты-миРНК экспрессируются.С использованием РНК, собранной из нескольких тканей и стадий, транскрипция всего генома, включая межгенные области, была оценена путем гибридизации с 36-мерными зондами. Были собраны два специфичных для цепи олигонуклеотидных зонда из 36 нуклеотидов на каждые 46 п.н. генома медоносной пчелы. Полную матрицу тайлинга генома гибридизовали в двух отдельных экспериментах с двумя разными объединенными образцами полиаденилированной РНК; но второй эксперимент содержал объединенную РНК, обогащенную для мозга и грудной клетки.
Для каждой миРНК-кандидата были исследованы мозаичные зонды в геномной области, содержащей ее последовательность-предшественник, фланкированную 50 основаниями на обоих 5 ‘и 3’ концах.МикроРНК считали экспрессированной, если по крайней мере один зонд в выбранной области измерял сигнал выше 90% всех зондов тайлинга из всего генома. Двадцать шесть miRNA, перечисленные в файле дополнительных данных 6, измеряли сильный сигнал в любом из экспериментов с мозаичным массивом и шесть — в обоих. Среди последних шести C4222, C6617 и ame-mir-100 показали дифференциальную мощность сигнала в двух экспериментах с мозаичным массивом.
Эксперименты с массивом плиток позволяют беспристрастно измерять паттерны экспрессии по всему геному.У некоторых организмов сигналы от мозаичных массивов наблюдались в многочисленных некодирующих областях генома, что указывает на присутствие некодирующей РНК, включая тРНК. Примечательно, что тРНК примерно того же размера, что и предшественники миРНК [21]. Однако ни пре-миРНК, ни зрелые миРНК не будут полиаденлилированы. Таким образом, использование полиА РНК в этих экспериментах привело к смещению образцов РНК против зрелых миРНК. Следовательно, неспособность некоторых miRNA, подтвержденных с помощью RT-PCR, быть обнаружена как сигналы мозаичного массива, неудивительна.Напротив, было трудно приписать статистическую значимость наблюдаемым сигналам мозаичного массива, потому что эксперименты с массивами были разработаны для обнаружения более длинных генов, кодирующих белок. Следовательно, было слишком мало зондов (примерно 3-4) для каждого предшественника miRNA, и обычно только один из этих зондов давал сильные сигналы. Значимость результатов мозаичного массива выше для шести miRNA, показывающих сильные сигналы в обоих экспериментах A и B, и для двенадцати miRNA-кандидатов, которые также показали результаты RT-PCR, согласующиеся с транскрипцией.Однако дифференциальный сигнал для трех положительных кандидатов на miRNA из мозаичного массива предполагает, что эти miRNA (C6617, C4222 и ame-mir-100) могут играть роль в мозге или грудной клетке пчел.
Кастовые, тканевые и возрастные корреляции экспрессии miRNA
Мы предположили, что miRNAs могут участвовать в драматических изменениях судьбы развития, связанных с переключением от репродуктивной женщины к касте стерильной рабочей женщины. Соответственно, РНК была выделена из различных тканей и стадий как маток, так и рабочих медоносных пчел и охарактеризована с помощью ОТ-ПЦР.Рисунок 1 и файл дополнительных данных 10 контрастируют уровни экспрессии для подмножества кандидатных локусов miRNA во взрослой голове, грудной клетке, брюшной полости и целых куколках как для маток, так и для рабочих. Несколько кандидатов показали различное выражение между матками и рабочими в брюшной полости, возможно, в той части тела, которая физиологически наиболее различается между этими кастами из-за их разной плодовитости. Локусы-кандидаты ame-mir-9a, C3345 и C5152 более сильно экспрессируются в брюшке рабочих, в то время как C1504 и аме-мир-71 сильнее экспрессируются в брюшке матки.Ame-mir-71 также имел гораздо более сильную экспрессию у развивающихся (куколочных) рабочих, чем у маток и в грудных клетках рабочих. Более полное резюме экспериментов ОТ-ПЦР для этого подмножества показано в дополнительном файле данных 4. В соответствии с нашей гипотезой, что предсказанные с помощью вычислений миРНК медоносных пчел могут быть вовлечены в развитие пчел и, в частности, в изменениях, которые характеризуют альтернативные судьбы рабочих и рабочих. королева, многие miRNAs демонстрируют паттерны экспрессии, связанные с тканью, стадией или кастой. Дополнительные файлы данных содержат значения оценок транскрипции ОТ-ПЦР для объединенной РНК (файл дополнительных данных 3) и дополнительных образцов маток / рабочих (файл дополнительных данных 4), последовательностей праймеров, используемых для экспериментальной оценки (файл дополнительных данных 5), и выравнивания праймеры к последовательностям-предшественникам (файл дополнительных данных 2).
Рисунок 1Нормализованная экспрессия в образцах рабочих и маток для шести кандидатов miRNA. Значения указывают относительные уровни выражений в виде шкалы log 10 с SD для трех повторностей образца, как описано в тексте. Указаны идентификаторы праймеров.
Интронные miRNAs и гены хозяина
MiRNAs часто сгруппированы в геномах млекопитающих и мух, и эта кластеризация часто связана с ко-транскрипцией miRNAs и генов, с которыми они находятся в непосредственной близости [22].Ко-транскрипция miRNA и близлежащих генов может также отражать координированную регуляцию miRNA и близлежащих генов. В частности, интронные miRNAs часто, хотя и не всегда, скоординированно экспрессируются с их геном-хозяином и транскрибируются как единый первичный транскрипт [23]. В подтверждение постулируемой роли miRNAs в регуляции альтернативных траекторий развития, связанных с кастовой дифференциацией, мы исследовали функциональную роль генов официального набора генов медоносных пчел, в которые встроены интронные miRNA медоносных пчел [18].Учитывая нехватку прямых функциональных доказательств для большинства генов медоносных пчел, мы полагались на исчерпывающий набор компьютерных ортологов, описанных в другом месте [15]. Мы обнаружили несколько примечательных взаимосвязей, которые заслуживают дополнительного исследования. Во-первых, это были ассоциации с фундаментальным клеточным механизмом роста и развития. Амэ-мир-34, аме-мир-277 и аме-мир-317 все занимают интрон 3 GB10191. GB10191 является ортологом Rbp8 в Drosophila и RPB8 у человека — часть основного комплекса РНК-полимеразы II и непосредственно участвует во всей транскрипционной активности.Точно так же аме-мир-279 встроен в интрон 3 GB12486, ДНК-полимеразы-α-примазы медоносной пчелы.
Интересно, что функциональные процессы др. Генов, несущих интронные miRNAs, предполагают, что некоторые miRNA пчел могут участвовать в важных, но более сложных кастовых различиях. Например, новый кандидат miRNA C689 обнаружен в GB10066, пчелином ортологе нейролигина, участвующего в развитии нервной системы. Новая miRNA C1504 встроена в GB11212, чей ортолог Drosophila участвует в формировании дорсального / вентрального паттерна, экспрессируется в дисках крыльев и отрицательно регулируется Ultrabithorax.Кандидат C5267 содержится в GB15446, чьи гомологи Drosophila являются регуляторами транскрипции с промоторов РНК-полимеразы II и участвуют в развитии глаз и других морфогенных взаимодействиях. Новый кандидат C5599 обнаружен в GB14516, ортологе Dll (Distalless), который обладает активностью фактора транскрипции и непосредственно участвует в формировании проксимального / дистального паттерна и морфогенезе, особенно в формировании антенн и гениталий. Пчелиные miRNA также могут участвовать в программировании репертуаров поведенческих реакций, поскольку GB15597 содержит miRNA C4222, а его ортолог мух — eag , вовлеченный в поведенческие реакции, включая сенсорное восприятие запаха и полета.
Анализ онтологии генов
Мы пришли к выводу, что анализ чрезмерно представленных терминов онтологии генов (GO) [24], связанных с генами, расположенными рядом с miRNA, может предложить дополнительное понимание функции некоторых miRNA пчел и позволит нам изучить широкие закономерности функциональной консервации между миРНК пчел и миРНК дрозофилы, миРНК. Сначала мы определили тонкие термины GO (более общее подмножество терминов GO), связанные с ортологом Drosophila каждого гена пчелы [15].Затем, используя GeneMerge [25], мы определили тонкие термины GO, которые были чрезмерно представлены в наборе пчелиных генов, встречающихся <10, <20, <50 или <100 т.п.н. от предсказанной мРНК, по сравнению с набором всех пчелиных генов с Drosophila ортологов. Поскольку у некоторых пчелиных генов есть несколько ортологов к Drosophila , и чтобы гарантировать, что наш анализ обогащения GO не был искажен случайным выбором от одного до многих ортологов пчелиного гена рядом с miRNA, мы провели десять экспериментов с репликацией GeneMerge на каждом расстоянии и сообщили только Термины GO, для которых Бонферрони исправил E-socres, были меньше 0.05 во всех десяти повторностях.
GO анализ выявил следующее: «Физиологический процесс» как единственный GO-термин, чрезмерно представленный среди генов <10 kb от miRNA пчел в каждом повторном эксперименте; «Ответ на stess» чрезмерно представлен в каждом повторном эксперименте для генов <20 kb от miRNA пчел; нет GO-термина, чрезмерно представленного в каждой репликации <50 т.п.н. из пчелиных miRNA; «Ядро» чрезмерно представлено в каждой повторности <100 т.п.н. от miRNA пчел. Запуск GeneMerge на отрицательном контрольном наборе, состоящем из случайно выбранных пчелиных генов, не дал условий GO со значительными E-оценками, скорректированными по Бонферрони.
Чтобы сравнить термины GO, связанные с этими miRNA у пчел и мух, мы провели аналогичный анализ генов Drosophila рядом с miRNA. Мы получили тонкие термины GO, связанные с генами Drosophila , происходящими <10, <20, <50 или <100 т.п.н. из Drosophila ортологов этих miRNA пчел, и запустили GeneMerge, чтобы найти избыточно представленные термины GO. Как и прежде, сообщаются только те термины GO, у которых скорректированные Бонферрони E-баллы были менее 0,05 во всех десяти повторных экспериментах.Данные эксперимента GO обобщены в файле дополнительных данных 7. Интересно, что термин GO «физиологический процесс», который был чрезмерно представлен среди генов пчел <10 т.п.н. от miRNA, также был чрезмерно представлен среди генов Drosophila <20, <50 и <100 т.п. из миРНК. Как и раньше, запуск GeneMerge на наборе отрицательного контроля, состоящем из случайно выбранных генов Drosophila , не дало результатов GO-членов со значительными E-оценками, скорректированными по Бонферрони.
По сравнению с пчелой, было гораздо больше GO-терминов, которые были значительно обогащены среди генов рядом с miRNA в геноме Drosophila .Например, четыре тонких термина GO («развитие», «морфогенез», «связывание РНК» и «сигнальная трансдукция») были чрезмерно представлены во всех повторах на каждом расстоянии в Drosophila , и было 29 терминов GO, значительно обогащенных среди генов < 100 kb от miRNA мух (файл дополнительных данных 7). Напротив, в геноме пчелы не было терминов ГО, обогащенных на каждом расстоянии, и только 1 термин ГО («ядро»), обогащенный среди генов <100 т.п.н. из миРНК пчел. Это несоответствие между пчелой и Drosophila , вероятно, вызвано повышенной чувствительностью в эксперименте Drosophila по сравнению с экспериментом с пчелами.В эксперименте Drosophila использовались аннотации GO Drosophila напрямую, тогда как эксперимент с пчелами основывался на существовании и обнаружении ортологов Drosophila для каждого гена пчелы.