13 мед рм: ГБУЗ Республики Мордовия «Поликлиника № 2»

Противомикробное действие Trigona laeviceps
(пчела без жала) из Таиланда

РЕФЕРАТ

Цель: Определить ключевые свойства Trigona laeviceps мед из Таиланда, включая его противомикробные деятельность.

Методология: содержание пролина и процентное содержание инвертный сахар оценивали, как описано. Основные белковые полосы были разрешены и проанализированы анализами SDS PAGE и MALDI TOF. Противомикробная активность была анализировали методом диффузии в лунки агара.

Результаты: Мед был кислым (pH 3,37), но вероятно без контроля (содержание пролина 1723 мг / кг) с нормальным сахаром содержание (например, инвертный сахар 15,2% (вес / вес)), но больше, чем ожидалось содержание белка (0.28 г / 100 г). Из примерно десяти различных белковых полос шесть основных были выявлены белковые полосы, из которых полоса 29 кДа могла быть пыльцой аллерген Lol p VA предшественник Lolium perenne (Райграс многолетний). Аккуратный мед является наиболее эффективным для использования в качестве контактного противомикробного средства, а Золотистый стафилококк был наиболее чувствительным к меду патогеном. все разведения.

Заключение: исследованный мед, возможно, может быть использован как противомикробное средство.Поскольку был обнаружен белок аллергена пыльцы, он может вызывают медовое опьянение.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Trigona laeviceps , Honey, Proline, Инвертный сахар, основной белок, зона ингибирования.

Chanchao C. Противомикробная активность по Trigona laeviceps (без жала пчелиный) мед из Таиланда.Пак Дж. Медицина 2009; 25 (3): 364-369.

Д-р Чанпен Чанчао
Кафедра биологии,
Факультет естественных наук,
Университет Чулалонгкорн,
Бангкок 10330, Таиланд.

Переписка

Чанпен Чанчао,
Эл. Почта: [email protected]

* Получено для публикации: 16 января 2009 г.
* Исправление получено: 22 мая 2009 г.
* Исправление принято: 25 мая 2009 г.

ВВЕДЕНИЕ

Мед — один из экономичных продуктов пчеловодства.После пчел корм для нектара из растений, ферменты медоносных пчел, такие как α-глюкозидаза, гидролизуют дисахариды в нектаре до моносахаридов, таких как глюкоза и фруктоза.

Хотя многие исследования сообщают о преимуществах дорогая, также были обнаружены некоторые недостатки. Мед часто (обычно) загрязнены дрожжами ( Saccharomyces, Schizosaccharomyces и штаммов Torula ), грибами ( Penicillium и Mucor штаммов) и бактериальными спорами ( Bacillus и Clostridium род).

Физико-химические характеристики меда, такие как состав, сладость, цвет, запах и pH несколько изменчивы и разнообразны между видами пчел и между локациями или сезонами из-за кормления из различные растительные источники.Это напрямую связано с тем, что свойства меда зависят от различных факторов, в том числе от растительных источников, климат, окружающая среда и виды пчел.

МЕТОДОЛОГИЯ

SDS-PAGE сырого протеина: белковые препараты были частично разрешается одномерным прерывистым восстанавливающим гелем с 12% и 4% (мас. / об.) ПА для разделения и укладки геля соответственно. На 15 мл загрузки образец, неочищенный белок в общем количестве 10, 20, 30 и 40 мг каждый был смешан с 1 x SDS с уменьшающей загрузкой красителя, нагретого до 80

РЕЗУЛЬТАТЫ

Чтобы охарактеризовать некоторые ключевые свойства Мед Trigona laeviceps , четыре параметра pH, содержание пролина, процент инвертного сахара и общее содержание белка были оценены (Таблица-I).Тестовый образец меда оказался относительно кислым с pH 3,37. Содержание пролина, определяемое как индикатор меда фальсификация, была определена как 1723 мг / кг и как таковая указывает на то, что изученный мед был подлинным. Общий состав инвертного сахара в меде был 15,2% (мас. / Мас.). Однако, так как вкус меда T. laeviceps был очень кислый, вероятно, вкус больше зависел от кислотности, чем от сладость.

Кроме сахара, который был основным компонентом меда, немного более высокое содержание протеина, чем обычно содержится в других сортах меда, таких как Apis mellifera (0.28 г / 100г). Образцы меда были разрешается прерывистым сокращением SDS PAGE и затем окрашивается кумасси синий. Приблизительно десять отдельных полос могут быть разрешены с помощью шести основных полосы белка (Фиг.1).

Из них были вырезаны полосы, обозначенные A — E (Рис. 1). из геля и после триптического расщепления были проанализированы на частичное содержание аминогруппы. кислоты с помощью матричной лазерной десорбции / ионизации времяпролетной массы Спектрометрия (MOLDI TOF MS), предполагаемые вероятные последовательности пептидных фрагментов были затем используется для поиска вероятных белков-кандидатов (или гомологов) по аминокислотам сходство последовательностей с использованием базы данных поиска Mascot.Соответствующие пептиды: показано в Таблице II.

Для антимикробной активности диаметр зоны ингибирования патогенов с помощью меда в различных разведениях измеряли каждый день. Что для три дня суммированы в Таблице-III, где оба меда зависят от дозы антимикробная активность и эффекты чувствительности, зависящие от вида микробов были как очевидными, так и статистически значимыми. Из микробов S. aureus был наиболее восприимчив к опосредованному медом торможению роста, но во всех как механизм действия, так и был ли он микробиостатическим или микробиоцидность не выяснена.

ОБСУЖДЕНИЕ

Поскольку мед по своим свойствам и биологической активности различается в зависимости от разные локации, времена года и виды пчел, мед Trigona laeviceps из Таиланда был выбран для этого исследования, потому что мало известно о различных сортах меда из Таиланда или от этой обыкновенной пчелы разновидность. Использовался многоцветковый и натуральный необработанный мед, так как это формат, предпочтительный для потребителя.

Критерии качества используемого меда соответствуют критериям, установленным стандарты Codex Alimentarius, которые включают выбранные параметры записано в Таблице-I. Поскольку основные компоненты меда просты моносахаридные сахара (в основном глюкоза и фруктоза), это неудивительно что мы сообщаем, что этот мед на 15,2% состоит из инвертного сахара. Тем не мение, мы также обнаружили, что мед состоит из более высокого, чем ожидалось, уровня белка (0,28% (вес / вес)), что примерно в 2,7-7 раз выше, чем обычно найдено в A.mellifera мед (40100 мг / 100г).

После разделения белков меда за счет снижения SDS PAGE и иссечение основных полос и, после триптического расщепления, MALDI TOF-MS анализ вероятных аминокислотных пептидных последовательностей, основного белка полоса (полоса C) наиболее точно соответствует аллергену пыльцы Lol p VA Preursor из Lolium perenne (Райграс многолетний) (Рис.1 и Таблица II). Этот результат до некоторой степени совпадает с результатами Gunduz et al и Finola и др. .,

Тем не менее, данное исследование является первым сообщением о том, что T. laeviceps мед может выполнять любую антимикробную активность in vitro . Антимикробная способность меда может быть комбинированной или синергетической. эффект его низкого pH (pH 3.37), высокая осмолярность и некоторые молекулы такие как перекись водорода, антимикробные пептиды или другие летучие вещества. В целом уровень pH меда находится в пределах 3,4 — 5,5. В кроме того, бактериальная колонизация или инфекция происходит при pH> 7,3.

Из приведенных выше данных, T. laeviceps мед содержит как хорошие, так и плохие моменты. Могут потребоваться некоторые меры предосторожности, чтобы чтобы избежать аллергии у гипераллергенных людей, уже сенсибилизированных к пыльце аллергенов, или к сенсибилизации других восприимчивых членов населения, как потребление меда увеличено, чтобы уменьшить страдания от пчел или пыльцы аллергены.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПОДТВЕРЖДЕНИЕ

Автор благодарит г-жу Нарерат Вонгчум за ее помощь. Это исследование финансировалось следующими гранты: Таиландский исследовательский фонд, грант № RMU5180042, и Cerebos (Таиланд) Ltd. Мы также благодарим Dr.Роберт Батчер (Консультационная служба по вопросам публикаций, Чулалонгкорн) для подготовки рукописи.

ССЫЛКИ

1. Вонгчавалит Дж., Ямамото Т., Накаи Х., Ким Ю.М., Сато Н., Nishimoto M, et al. Очистка и характеристика α-глюкозидазы I из Японская медоносная пчела ( Apis cerana japonica ) и молекулярное клонирование ее кДНК. Biosci Biotechnol Biochem 2006; 70: 2889-2898.

2. Гелдоф Н., Ван XH, Энгесет, штат Нью-Джерси.Идентификация и количественное определение антиоксидантных компонентов меда из различных цветочных источники. J Agric Food Chem 2002; 50: 5870-5877.

3. Аль-Вайли Н.С. Изучение антимикробной активности натуральный мед и его влияние на патогенные бактериальные инфекции хирургические раны и конъюнктива. J Med Food 2004; 7: 210-222.

4. Migdal W, Owczarczyk HB, Kedzia B, Holderna-Kedzia E, Мадайчик Д. Микробное обеззараживание натурального меда облучением.Radiat Phys Chem 2000; 57: 285-288.

5. Коллинз С.Х., Лайн П.М., Грейндж Дж. М.. Коллинз и Лайнс микробиологические методы. 1999. 7-е изд., Баттерворт-Хайнеманн, Оксфорд.

6. Monetto AM, Francavilla A, Rondini A, Manca L, Siravegna М., Фернандес Р. Исследование спор ботулина в меде. Анаэроб 1999; 5: 185-186.

7. Гундуз А., Туреди С., Рассел Р.М., Аяз Ф.А. Клинический обзор отравлений грейанотоксином / бешеным медом в прошлом и настоящем. Клинический токсикол 2008; 46: 437-442.

8. Azeredo LDC, Azeredo MAA, de Souza SR, Dutra VML. Содержание белка и физико-химические свойства в образцах меда Apis mellifera разного цветочного происхождения. Food Chem 2003; 80: 249-254.

9. Клакасикорн А., Вонгсири С., Деованиш С., Дуангпхакди О. Новый рекорд по безжалостным пчелам (Meliponini, Trigona) в Таиланде. Нат Хист Дж Чулалонгкорн Унив 2005; 5: 1-7.

10. Сидней В. Официальные методы анализа. 1984. 14-е изд., Ассоциация официальных химиков-аналитиков, Inc., Вирджиния.

11. Bradford MM. Быстрый и чувствительный метод для качественно микрограмм количества белка, используя принцип связывание белкового красителя. Анальная биохимия 1976; 72: 248-254.

12. Perez C, Pauli M, Bazerque P. Анализ антибиотика, проведенный метод диффузии в лунках агара. Acta Biologiae et Medicine Experimentalis 1990; 15: 113-115.

13. Salomao K, Pereira PRS, Campos LC, Borba CM, Cabello PH, Marcucci MC и др. Бразильский прополис: взаимосвязь между химическими веществами состав и антимикробная активность.eCAM 2008; 5: 317-324.

14. Finola MS, Lasagno MC, Marioli JM. Микробиологические и химическая характеристика меда из Центральной Аргентины. Food Chem 2007; 100: 1649-1653.

15. Molan PC. Антимикробная активность меда. 1. В характер антибактериальной активности. Пчелиный мир 1992; 73: 5-28.

16. Маркучи М.С., Ферререс Ф., Гарк а-Вигера С., Банкова В.С., де Кастро С.Л., Дантас А.П. и др. Фенольные соединения из бразильского прополиса с фармакологической активностью.J. Этнофармакол 2001; 74: 105-112.

17. Купер Р.А., Молан П.С., Хардинг К.Г. Антибактериальная активность меда против штаммов золотистого стафилококка из инфицированных ран. J R Soc Med 1999; 92: 283-285.

ДОМ | ПОИСК | ТЕКУЩИЙ ВЫПУСК | МИМО ВОПРОСЫ

Профессиональный Медицинские публикации
Кабинет № 522, 5 этаж, Центр «Панорама»
Корпус № 2, п / я. Box 8766, Saddar, Карачи — Пакистан.
Телефоны: 5688791, 5689285 Факс: 5689860
pjms @ pjms.com.pk

Хани Ли и Ли Сан Юн клянутся отомстить в постерах для «One The Woman» — KpopHit

SBS «One the Woman» выпустили новые индивидуальные постеры для Хани Ли и Ли Сан Юн!

«Одна женщина» — это предстоящая комедийная драма о коррумпированном прокуроре по имени Чо Ён Джу, который пытается восстановить свои воспоминания после амнезии и смены жизней с невесткой чеболя по имени Кан Ми На, которая выглядит точно так же ее. Хани Ли играет двойные роли Чо Ён Джу и Кан Ми На, в то время как Ли Сан Юн играет вместе с Хан Сын Ук, чеболем в третьем поколении , который все еще испытывает чувства к своей первой любви.

Название «Одна женщина» относится к тому факту, что Чо Ён Джу и Кан Ми На выглядят одинаково, и что Чо Ён Джу в конечном итоге меняет жизнь с Кан Ми На после амнезии, но также является каламбуром на «Чудо-женщине». . » На новых плакатах, обнародованных 13 сентября, Хани Ли и Ли Сан Юн смело позируют перед цифрой «1». Уверенная, харизматичная и бесстрашная, надпись на плакате Чо Ён Джу гласит: «Я покажу вам, насколько страшной может быть пыль после того, как я наступил на вас на пути вверх.

Хан Сын Ук, который снаружи кажется нежным и красивым, скрывает сильное желание мести внутри после того, как его выгнали из линии престолонаследия после загадочной смерти его отца. Он потерял не только свое социальное положение, но и свою первую любовь, Кан Ми На, и был вынужден переехать в Соединенные Штаты. Там он добился успеха, основав свою собственную компанию, и вернулся в Корею, чтобы узнать правду о смерти своего отца. Подпись к его плакату гласит: «Я решил.Я собираюсь вернуть все, как было раньше ».

Производственный персонал заявил: «Плакаты с персонажами показывают, что Чо Ён Джу и Хан Сын Ук дают сильные предупреждения злодеям из этой истории».

Премьера спектакля «Одна женщина» состоится 17 сентября в 22:00. KST. Посмотрите тизер здесь!

Смотрите Хани Ли в «Огненном жреце» ниже!

Источник (1)

Какие чувства вызывает у вас эта статья?

Многолетнее исследование заболеваемости медоносных пчел в США

% PDF-1.4 % 1 0 объект > эндобдж 10 0 obj /Заголовок /Тема / Автор /Режиссер / Ключевые слова / CreationDate (D: 20210917081529-00’00 ‘) / CrossMarkDomains # 5B1 # 5D (springer.com) / CrossMarkDomains # 5B2 # 5D (springerlink.com) / CrossmarkDomainExclusive (истина) / CrossmarkMajorVersionDate (25 мая 2016 г.) / ModDate (D: 20160526180407 + 08’00 ‘) / doi (10.1007 / s13592-016-0431-0) >> эндобдж 2 0 obj > эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 5 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 7 0 объект > транслировать 10.1007 / s13592-016-0431-02016-05-25 истинный пружинный элемент

Прокариотические вирусные сообщества, связанные с пчелами выявить широкое вирусное разнообразие и значительный потенциал метаболического кодирования

Значимость

В этом исследовании используется очистка вирусоподобных частиц и последующее объективное секвенирование генома для идентификации прокариотических вирусов, связанных с Apis mellifera .Интересно, что бактериофаги, обнаруженные у медоносных пчел, демонстрируют большое разнообразие и охватывают различные вирусные таксоны. Это разнообразие резко контрастирует с современными знаниями об относительно простом бактериальном микробиоме пчел. Идентификация множества вспомогательных метаболических генов предполагает, что эти бактериофаги обладают кодирующим потенциалом для вмешательства в основные микробные пути, связанные со здоровьем и, возможно, также с болезнью. Это исследование проливает свет на забытую часть микробиоты пчел и открывает возможности для исследований in vivo взаимодействия бактериофагов с их бактериальным хозяином, что, вероятно, имеет сильно недооцененные последствия для здоровья пчел.

Abstract

Медоносные пчелы ( Apis mellifera ) производят огромную экономическую ценность благодаря своей деятельности по опылению и играют центральную роль в биоразнообразии целых экосистем. Недавние исследования показали, что микробиота кишечника оказывает существенное влияние на развитие пчел, пищеварение и гомеостаз в целом. В этом исследовании для характеристики прокариотических вирусных сообществ, связанных с медоносными пчелами, использовалось глубокое секвенирование, что до сих пор было слепым пятном в исследованиях.Подавляющее большинство популяций прокариотических вирусов являются новыми на уровне рода, и большинство кодируемых белков обладают неизвестными функциями. Тем не менее, было предсказано, что геномы бактериофагов могут инфицировать почти все основные бактерии пчелиного кишечника, а функциональная аннотация и открытие вспомогательных метаболических генов предполагают возможность влиять на микробный метаболизм. Кроме того, неоткрытые гены, участвующие в синтезе кластеров вторичных метаболических биосинтетических генов, отражают множество ранее неиспользованных ферментативных ресурсов, скрытых в сообществе пчелиных бактериофагов.

Опыление является важным аспектом для всей экосистемы, и медоносные пчелы ( Apis mellifera ) считаются наиболее экономически важными насекомыми-опылителями товарных культур во всем мире. Помимо производства меда и других ценных продуктов, медоносные пчелы вносят значительный вклад в опыление насекомыми, экономическая стоимость которого оценивается в 153 миллиарда евро (1). В течение последних десятилетий стало ясно, что управляемые семьи медоносных пчел находятся под давлением широкого спектра факторов стресса, таких как паразиты (2), бактериальные патогены (3), вирусные патогены (4) и другие, например, химические стрессоры. (5).В последнее время все больше и больше внимания уделяется микробиоте пчел, и в ряде исследований предпринимались попытки охарактеризовать микробиом пчелиного кишечника (6, 7). Эти исследования показали, что в бактериальной части микробиома кишечника медовой пчелы преобладают от 5 до 10 различных видов бактерий. Выявленные виды принадлежали к трем различным типам бактерий: Proteobacteria, Firmicutes и Actinobacteria (6). Анализ транскриптома дополнительно предоставил информацию о функциональном потенциале, кодируемом бактериальным микробиомом кишечника (8).На основе этих представлений была предложена модель микробного метаболического пути с разными ролями для разных бактерий. Вкратце, гликозидазы и пептидазы (кодируемые вышеупомянутым ядром бактериального микробиома) первоначально расщепляют полисахариды и белки растений. Эти продукты далее ферментируются до органических кислот, газов и спиртов, которые затем метаболизируются метаногенами и видами Clostridia . Тот факт, что медоносные пчелы не могут выжить только на необработанной пыльце (9), подчеркивает важность микробного ферментативного переваривания в гомеостазе медоносных пчел.Эти результаты были недавно обобщены в исследовании с использованием общесистемной метаболомики (10). Это исследование подтверждает, что микробиота пчелиного кишечника играет центральную роль в переваривании и метаболизме компонентов, полученных из пыльцы. Дополнительные данные о существовании взаимодействий между хозяином и микробом выявили положительное влияние микробиоты пчелиного кишечника на увеличение массы тела хозяина в отделах кишечника, а также увеличение эндогенной экспрессии генов, участвующих в развитии и иммунитете, чувствительности к сахарозе, и инсулиноподобная передача сигналов (11).

Взятые вместе, эти результаты указывают на важную роль микробиоты пчелиного кишечника в доступности питания, развитии пчел и общем гомеостазе. Эта роль дополнительно усиливается наблюдением, что вызванный диетой бактериальный дисбиоз кишечника связан с пагубным воздействием на развитие, смертность и восприимчивость к болезням (12). Тот факт, что как диета медоносных пчел, так и разнообразие бактерий, присутствующих в кишечнике медоносных пчел, гораздо менее различаются, чем их человеческий аналог, привел к предложению использовать медоносных пчел в качестве модельных систем для исследования микробиоты и, кроме того, в качестве полезного инструмента в изучении эволюция и экология взаимодействий хозяин-микроб (13).Несмотря на недавние достижения в изучении метагенома кишечника медоносных пчел, работа, проведенная с бактериофагами, ассоциированными с медоносными пчелами, была основана только на нескольких изолятах и, таким образом, остается необъективной (14, 15). Часто постулируется, что (прокариотические) вирусы представляют собой наиболее распространенные биологические единицы во всем мире и выполняют важные роли в своих соответствующих экосистемах. Например, бактериофаги играют важную роль в круговороте углерода, азота и фосфора в океанах (16) и, как предполагается, влияют на экологию почвы (17).Наличие вспомогательных метаболических генов (AMG: здесь определяется как гены, присутствующие в бактериофагах, но происходящие от бактерий, способных модулировать микробный метаболизм) внутри бактериофагов, и недавнее открытие систем связи, приводящих к лизису и решениям о лизогении (18), отражают важное влияние, которое эти вирусы оказывают на своих предполагаемых хозяев и экосистемное равновесие в целом. У людей бактериофаги использовались в качестве альтернативы антибиотикам (19) и даже предлагалось использовать в качестве биомаркеров при многих состояниях (20).

Множество функций, которые прокариотические вирусы могут выполнять в своей биосфере, в сочетании с тем фактом, что бактериальный микробиом медоносной пчелы играет решающую роль в здоровье пчел, подразумевает, что вирусный микробиом также может играть важную роль в гомеостазе пчел. В этой работе мы представляем начальную характеристику прокариотического вирусного микробиома, связанного с медоносными пчелами, полученного из здоровых и ослабленных колоний, с использованием стратегий обогащения вирусоподобными частицами в сочетании с коротким считыванием секвенирования Illumina.

Результаты

Идентификация прокариотического вируса с помощью секвенирования следующего поколения.

Образцы, содержащие 300 различных колоний фламандских медоносных пчел, собранные в рамках исследования EpiloBEE (21) ( SI Приложение , рис. S1), были обогащены на вирусы (как ДНК-, так и РНК-вирусы) в соответствии с протоколом NetoVIR. (22) и упорядочены. Эти образцы были изначально отобраны, чтобы как можно лучше представить фламандскую популяцию медоносных пчел. В общей сложности было проанализировано 102 пула, содержащих образцы из ульев, которые были сопоставимы (получены из здоровых или слабых колоний) и максимально сопоставимы географически и по подвидам ( SI Приложение , таблица S14, доступная на GitHub).Две пчелы из трех семей были объединены вместе, за исключением последних трех групп, которые содержали двух пчел из одной семьи. Каждому пулу было назначено 5 миллионов считываний с конца по 150 п.н., и они были секвенированы с использованием платформы Illumina NextSEQ. Этот подход дал в общей сложности 686 940 647 считываний, при среднем значении 5798 403 считывания на пул (минимум: 2 096 600 операций чтения; максимум: 26 307 071 считывание). После сборки отдельных библиотек de novo полученные контиги были разрушены на 95% нуклеотидной идентичности с охватом 80%, и предполагаемые прокариотические вирусные последовательности были идентифицированы с помощью VIRSorter (23) и подхода с наименьшим общим предком с использованием DIAMOND (24). .Эукариотические вирусы были исключены с помощью режима дезактивации вирома в VIRSorter и путем ручного анализа выходных данных DIAMOND. Эти подходы позволили идентифицировать 4842 неизбыточных предполагаемых прокариотических вирусных контига с минимальной длиной 500 п.н. Было предсказано, что из этих контигов 20 являются кольцевыми (и, следовательно, полными геномами) ( SI Приложение , рис. S2). Из этих 20 полных геномов 11 можно отнести к известным семействам бактериофагов ( Microviridae , Siphoviridae , Myoviridae и Podoviridae ), а 7 можно отнести к бактериальным хозяевам ( Bifidobacterium , Lactobacillus , Hafnia и Pluralibacter ) (см. Ниже).Кривые накопления видов (при условии, что свернувшиеся контиги отражают отдельные виды вирусов) не показывают выхода на плато, подразумевая, что, несмотря на большие усилия по отбору проб и обогащение вирусными частицами, пространство последовательностей прокариотических вирусов не было полностью исследовано (рис. 1 A ). Это наблюдение также отражается в сильной корреляции между длиной контига и средним охватом контига (среднее количество считываний, перекрывающих каждую базу после удаления 10% наиболее и наименее покрытых оснований) (коэффициент корреляции Спирмена = 0.74, P значение <1,10 ⁻⁴ ) ( SI Приложение , рис. S3). Считывания из отдельных пулов были сопоставлены с представителями контигов, и было оценено присутствие каждого контига в пуле (присутствие определялось как tpmean охват> 10). Большинство контигов размером более 5 т.п.н. были разделены между менее чем пятью пулами, а 20 контигов были разделены между более чем пятью пулами (рис. 1 B ). Попарное сравнение совместного использования контигов между пулами отражается в сети, которая представляет 70 из 102 секвенированных пулов (рис.1 С ). Максимальное количество контигов, совместно используемых двумя пулами, составляло 15. Никаких четких шаблонов кластеризации не наблюдалось при применении алгоритма кластеров Маркова (MCL) (25) или кластеризации k -means. Максимальная наблюдаемая в сети клика состояла из 21 пула. Затем размерность матрицы охвата была уменьшена с использованием анализа главных координат (PCoA), а шаблоны кластеризации для статуса выборки (здоровье или заболевание), года выборки (2012 по сравнению с 2013 годом) и местоположения (провинции Бельгии) были протестированы с использованием тест Адониса.Существенного влияния на статус выборки не наблюдалось, но и местоположение, и год выборки были значительными, хотя и с низким значением R-квадрата ( SI Приложение , рис. S4). Полученные предполагаемые контиги прокариотического вируса показывают широкий диапазон процентного содержания гуанин-цитозин (GC), составляющий примерно от 25 до 70% (рис. 1 D ). После декорирования контигов ортологическими группами прокариотического вируса [pVOGs (26)] примерно половина контигов (2346 контигов, или 48,5%) имели соотношение pVOG и открытой рамки считывания (ORF) более 50% (рис.1 E ). Некоторые из контигов, которые оказались ниже этого соотношения, имели размер более 10 т.п.н., что означает, что большое количество предполагаемых вирусных белков не было представлено в базе данных pVOG. Эти результаты предполагают, что большое количество извлеченных вирусных генов не представлено в базе данных pVOG. При построении графика средней «вирусности» (частота присутствия pVOG в вирусах по сравнению с частотой присутствия pVOG в бактериях) аннотированных pVOG в пределах контига было показано, что небольшое большинство контигов упало выше 0.5 ( SI Приложение , рис. S5). Бимодальное распределение отражает то, что большое количество контигов демонстрирует четкий вирусный сигнал (средняя вирусность близка к 1), в то время как обогащение контигов со средней вирусностью, близкой к нулю, является следствием того, что контиги вообще не несут обнаруживаемого pVOG (оранжевые точки на SI Приложение , рис. S5).

Прокариотические вирусы, ассоциированные с пчелами, демонстрируют высокое индивидуальное разнообразие и содержат большое количество неизвестных вирусных белков.( A ) Кривые накопления видов в зависимости от количества секвенированных пулов. Вертикальные линии указывают SD на основе 100 перестановок. ( B ) График роя, отражающий предполагаемые вирусные контиги размером более 5 т.п.н., которые присутствовали в одном образце или более (всего 140). Присутствие определяется как покрытие> 10. Точка представляет собой один контиг. В поле показаны значения трех квартилей, а усы простираются до 1,5 интерквартильных диапазонов нижнего и верхнего квартилей. На графике нарисованы все 140 точек.( C ) Взвешенная по краям схема компоновки со встроенной пружиной, изображающая образцы как узлы, а ребра как количество общих между ними контигов. Толщина кромки отражает количество контигов. Зеленые узлы изображают пулы, полученные из здоровых колоний; красные узлы обозначают пулы, полученные из слабых колоний. Толщина краев варьируется от 1 до 15. ( D ) GC процент всех репрезентативных предполагаемых вирусных контигов как функция их log10-трансформированного охвата в пуле, из которого был получен репрезентативный.Длина, преобразованная в Log10, обозначается интенсивностью цвета. ( E ) Количество pVOG, обнаруженных в предполагаемых вирусных контигах, нормализованное на количество предсказанных ORF как функцию их покрытия, преобразованного в log10. Длина, преобразованная в Log10, обозначается интенсивностью цвета.

Присвоение хозяину вирусных контигов прокариот.

Предполагаемые геномные последовательности бактериофагов могут быть связаны с их конкретным хозяином за счет использования кодируемых ими последовательностей спейсеров CRISPR и сходства с транспортной РНК (тРНК).Мы создали набор данных бактериального микробиома кишечника пчел путем сопоставления данных, доступных на IMG / M и от Ellegaard et al. (27) ( SI Приложение , Таблица S15). Этот сопоставленный набор данных включает бактериальные последовательности из шести различных родов, включая Lactobacillus , Bifidobacterium , Commensalibacter , Gilliamella , Snodgrassella и Frischella . Чтобы свести к минимуму возможность того, что любой из предполагаемых контигов прокариотических вирусов имеет бактериальное происхождение, плотность кодирования и частота сдвига цепи были рассчитаны как для набора контигов бактерий, так и для набора контигов бактериофага (рис.2 А ). Оба эти параметра значительно различались между двумя наборами. В среднем плотность кодирования (определяемая как количество предсказанных генов на килобазу) была выше в наборе вирусных данных (2,50), чем в наборе данных по бактериям (1,07) (тест Манна – Уитни U , значение P = 5,10 ⁻¹⁶⁴ ). Средняя частота сдвига цепи (определяемая как частота, с которой два соседних гена начинаются в разных кадрах) была выше в наборе бактериальных данных (0,84), чем в наборе вирусных данных (0.63) (критерий Манна – Уитни U , значение P = 4,10 ⁻⁸⁷ ). Эти наблюдения вместе с тем фактом, что не существует единственных копий бактериальных маркерных генов [как определено Lee et al. (28)] могут быть идентифицированы в предполагаемом наборе контигов прокариотических вирусов, что позволяет предположить, что набор вирусных контигов не содержит или не содержит бактериального загрязнения. В общей сложности 76 предполагаемых контигов бактериофагов могут быть связаны с конкретными бактериями с использованием этих подходов. Эти контиги были в диапазоне длин от 1 до 107 т.п.н., и четыре, как предполагалось, были кольцевыми (и, таким образом, отображали полноразмерные геномы).Из этих 76 контигов 32 можно отнести к роду Lactobacillus , 17 — к роду Gilliamella и 27 — к роду Bifidobacterium . Никакие вирусные контиги не могли быть связаны с группой бактерий Frischella , Snodgrassella и Commensalibacter , поскольку эти бактериальные геномы не содержали какой-либо детектируемой матрицы CRISPR. Однако один удар тРНК был обнаружен против рода Frischella (рис. 2 B ).Большинство вирусных контигов, называемых хозяином, были связаны с одной бактерией, но 17 из них показали попадания CRISPR-спейсера против более чем одного вида бактерий. Один предполагаемый вирусный контиг может быть даже связан с пятью разными бактериями, но ни один из связанных вирусных контигов не может быть отнесен к более чем одному роду, что предполагает ограниченный круг хозяев. Только пять из предполагаемых вирусных контигов содержали сигнатуру тРНК, которая могла быть связана с конкретными бактериями. Два из этих контигов дали хиты почти против всех видов Bifidobacterium или Lactobacillus , включенных в этот анализ.Один из этих контигов также поразил только включенных видов Frischella , хотя не было обнаружено доказательств CRISPR-spacer, подтверждающих это. Поскольку пчелы отбирают образцы окружающей среды, нельзя исключать, что некоторые из извлеченных вирусных последовательностей отражают бактериофаги окружающей среды, а не истинные вирусы пчелиного кишечника. Для этого был проведен дополнительный поиск CRISPR-спейсеров с использованием спейсеров, имеющихся в базе данных CRISPR (CRISPRdb) (29). Эти результаты подтверждают 19 из 76 предыдущих ударов по специфическим для пчелиного кишечника бактериям.Кроме того, было обнаружено 50 дополнительных совпадений, из которых 32 были для бактериальных родов, присутствующих в кишечнике пчел (6 Lactobacillus совпадений, 3 Bifidobacterium совпадений, 18 Bartonella совпадений, 5 Gilliomella совпадений). 18 оставшихся выявленных предполагаемых хозяев потенциально отражают бактерии окружающей среды ( SI, приложение , таблица S19, доступно на GitHub).

Полученные прокариотические вирусы демонстрируют значительную разницу в геномных переменных и инфицируют широкий спектр известных бактерий пчелиного кишечника.( A ) Частота сдвига цепей в зависимости от плотности кодирования (количество ORF на килобазу). Данные из набора бактериальных данных выделены синим цветом; данные из набора вирусных данных обозначены оранжевым цветом. Также обозначены прямоугольные диаграммы для отдельных параметров, а звездочки обозначают значимость (критерий Манна – Уитни U ; значение P для плотности кодирования = 5,10 ⁻¹⁶⁴ ; значение P для частоты сдвига цепей = 4,10 ⁻⁸⁷ ) . В поле показаны значения трех квартилей, а усы простираются до 1.5 межквартильных диапазонов нижнего и верхнего квартиля. Независимо нарисованные точки выходят за пределы этого диапазона. ( B ) Филогенетическое дерево максимального правдоподобия для бактериальных последовательностей, включенных в усилия по вызову хозяина. Целые числа серого цвета обозначают значения начальной загрузки. Дерево окрашено по родам бактерий. Количество контигов, связанных с конкретным видом бактерий, указано наложенными друг на друга горизонтальными полосами (количество CRISPR-спейсеров и сходство тРНК). Оттенки серого указывают количество конкретных видов бактерий, которые дали попадания в один контиг (спейсеры CRISPR), или указывают на конкретный вирусный контиг (сходство тРНК).Одиночные контиги, отображающие попадания CRISPR-спейсера в несколько бактерий, обозначены цветными налоговыми звеньями между кончиками. Один цвет соответствует одному контигу.

Классификация контигов прокариотических вирусов.

Пытаясь классифицировать вновь открытые последовательности, мы запустили vConTACT2 (30) на предполагаемых последовательностях прокариотических вирусов, полученных с использованием базы данных REFSEQ 88 по прокариотическим вирусам. Этот метод использует сети обмена генами для таксономического определения прокариотических вирусов исключительно на основе их последовательности.Алгоритм классифицирует последовательности как «синглтоны» (без общего содержания гена), «выбросы» (слабо связанные с кластером последовательностей) или как часть кластера (30). Из 4842 неизбыточных контигов прокариотических вирусов (> 500 п.н.) 3010 были одиночными, 582 — выбросами, 181 показали сильное перекрытие между более чем одним установленным кластером (не учитывая их однозначную классификацию), а 1034 могли быть однозначно сгруппированы (рис. 3). А ). Сгруппированные контиги представлены 403 кластерами вирусного генома (которые считаются эквивалентными таксономическому уровню рода).Из этих кластеров вирусного генома 368 кластеров вообще не содержали последовательностей REFSEQ. Остальные 35 кластеров (представляющих 85 контигов) в основном относились к семействам Siphoviridae и Myoviridae , хотя семейства Podoviridae , Inoviridae , Microviridae и Cystoviridae также были представлены (Fig. Cystoviridae ). B и C и SI Приложение , таблица S16). Полученная сеть сгруппированных последовательностей генома показывает, что вновь обнаруженные последовательности широко разбросаны по всем известным последовательностям REFSEQ (рис.3 D ), несмотря на то, что эта сеть отражает только около 20% восстановленных последовательностей (остальные последовательности являются одиночными). Из 537 вирусных контигов размером более 5 т.п.н. 71 (13,2%) были синглетонами, 126 (23,5%) были выбросами, 67 (12,5%) имели слишком большое перекрытие, чтобы их можно было однозначно классифицировать, а 273 (50,1%) можно было классифицировать. однозначно сгруппированы. Из сгруппированных последовательностей 73 можно отнести к вирусному семейству. Хотя относительное количество присвоенных контигов по сравнению с другими категориями было выше в наборе данных с большими вирусными контигами ( SI Приложение , рис.S6 A ) по сравнению с небольшими контигами (рис. 3 A ), отнесение к разным вирусным семействам оставалось сопоставимым с полным набором данных (рис. 3 B и C по сравнению с SI, приложение , рис. . S6 B и C ). Сетевая проекция также показала, что, несмотря на потерю значительного числа небольших кластеров, вирусное разнообразие остается широко распространенным. Относительное увеличение кластеризованных вирусных последовательностей наблюдается только при рассмотрении контигов размером более 5 т.п.н., в сочетании с наблюдением, что большинство одноэлементных контигов короче по длине, чем другие группы ( SI, приложение , рис.S7), отражают, что более короткая последовательность затрудняет процесс классификации в этом наборе данных. Поскольку в вирусах отсутствуют универсальные маркерные гены, и очень немногие из восстановленных белков могут быть объединены в кластеры (см. Ниже), филогенетические деревья были составлены для пяти крупнейших кластеров белков (ПК), как идентифицировано vConTACT2. Эти пять самых больших кластеров белков содержали эталонные белки, помеченные как «рибонуклеотидредуктаза» (PC1), «эндонуклеаза» (PC2), «ssDNA-связывающий белок» (PC3), «эндонуклеаза» (PC4) и «тимидилатсинтаза» (PC5).Количество белков (идентифицированных в этом исследовании) в каждом кластере белков сильно варьировало. PC1 содержал 27 идентифицированных белков (всего 400 белков), PC2 содержал 70 идентифицированных белков (всего 389 белков), PC3 содержал 83 идентифицированных белка (всего 331 белок), PC4 содержал 34 идентифицированных белка (всего 302 белка) и PC5 содержал 8 идентифицированных белков (всего 283 белка). Идентифицированные последовательности не попадают в отдельные клады и, по-видимому, рассредоточены по всему филогенетическому спектру соответствующих деревьев ( SI Приложение , рис.S8 A ). Учитывая отсутствие больших кластеров белков, содержащих многие из идентифицированных последовательностей, длины ветвей между всеми вершинами деревьев кластеров белков были рассчитаны и связаны с минимальной длиной пути между соответствующими геномами в сети vConTACT2. Эти минимальные длины пути были рассчитаны с использованием алгоритма Беллмана – Форда. Оба показателя имели значительную положительную корреляцию (коэффициент ранговой корреляции Спирмена = 0,43; значение P = 0,0), хотя при разделении между типами (вирусный контиг, связанный с пчелами, эталонный вирус или вирусный контиг, связанный с пчелами, и эталоны вместе взятые), корреляция коэффициенты варьировались от 0.От 44 до 0,82 ( SI Приложение , рис. S8 B ). Эти результаты подразумевают, что расстояния между подключенными узлами в сети vConTACT2 также можно интерпретировать (в некоторой степени) как филогенетические расстояния.

Подавляющее большинство извлеченных прокариотических вирусов нельзя с уверенностью классифицировать. ( A ) Подсчеты, показывающие статус классификации предполагаемых вирусных контигов с использованием vConTACT2. «Назначенные кластеры» обозначают извлеченные контиги, попадающие в кластеры, содержащие ссылочные последовательности; «Clustered Not-Assigned» означает извлеченные контиги, попадающие в кластеры без ссылочных последовательностей.( B ) Количество кластеров, которые содержали как уверенно кластеризованные большие контиги, так и контрольные последовательности. ( C ) Количество кластеров, которые содержали как уверенно кластеризованные контиги, так и эталонные последовательности. ( D ) Масштабируемая сеть генома с макетом размещения с направленным усилием, содержащая извлеченные кластерные предполагаемые прокариотические вирусы (красный) и вирусное семейство эталонных последовательностей (другие цвета). Наиболее распространенные вирусные семейства обозначены желтым (Myoviridae), зеленым (Podoviridae) и оранжевым (Siphoviridae).

Функциональный потенциал и селекционные признаки генов прокариотических вирусов, ассоциированных с пчелами.

Чтобы получить представление о функциональном потенциале, кодируемом извлеченными бактериофагами, для аннотаций доменов были использованы InterProScan (31) и eggNOG-mapper (32, 33). Чтобы уменьшить вычислительную нагрузку, белковые последовательности предсказанных генов были свернуты до 50% идентичности аминокислот перед анализом. Эта процедура уменьшила количество предполагаемых белков с 24420 до 18747, хотя подавляющее большинство кластеров содержало менее пяти белковых последовательностей (рис.4 A и SI Приложение , рис. S9 A ). В попытке идентифицировать AMG мы взорвали вирусные белковые последовательности против белков, закодированных в том же наборе данных бактериального микробиома пчелиного кишечника, который использовался для вызова хозяина ( SI, приложение , таблица S15). Перед бластингом набор данных бактериального белка был сгруппирован с использованием тех же параметров, что и для вирусных белков. Вирусный белок считался подлинным AMG, когда выравнивание имело значение е менее 1e-5. Из 18 747 кластеров вирусных белков 2744 были идентифицированы как AMG (рис.4 В ). Чтобы оценить долю идентифицированных AMG, происходящих из областей профага, PHASTER (34) запускали на бактериальных контигах ( SI, приложение , таблица S17). Бактериальные белки, обнаруженные при поиске AMG, оценивались независимо от того, попали они в эти области или нет. Всего было обнаружено 45 профаговых областей, и 95 из 1506 (примерно 6%) бактериальных аналогов идентифицированных AMG попали в эти области. Примерно 65% представителей кластера вирусных белков (12 286) показали значительные совпадения с базой данных EggNOG, различными базами данных, используемыми InterProScan, или обоими (рис.4 А ). Из всех категорий кластеров ортологичных групп (COG), к которым могут быть отнесены вирусные белки, категория S имела наибольшее количество назначенных кластеров («Функция неизвестна», 4293 кластера), за которой следовали типичные сигнатуры вирусной репликации («Репликация, рекомбинация и репарация »[468 кластеров],« Биогенез клеточной стенки / мембраны / оболочки »[212 кластеров] и« Транскрипция »[166 кластеров]) ( SI Приложение , Рис. S9 B ). Полный перечень образцов генной онтологии (GO), нанесенный на древовидные карты с помощью REVIGO (35), выявляет характеристики, аналогичные категориям COG, и общее отсутствие подробной аннотации полученных вирусных белков ( SI, приложение , рис.S10). В попытке дополнительно выяснить функциональный потенциал, образцы GO были спроецированы на пути, частью которых они являются, с помощью картирования путей Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) (36) (рис. 4 C ). Некоторые из извлеченных путей отражают функции, которые могут напрямую влиять на бактерии и участвуют в формировании биопленок, распознавании кворума и хемотаксисе бактерий. Другие представленные пути отражают широкий спектр основных метаболических функций, включая метаболизм липидов, углеводов, нуклеотидов и аминокислот.Интересно, что также были представлены деградация ксенобиотиков, биосинтез гликанов и метаболизм терпеноидов и поликетидов. Бактериальные аннотации для ранее определенных AMG также проецировались на пути, и были идентифицированы перекрывающиеся аннотации путей (рис. 4 C , прямоугольники с красной рамкой). Интересно, что почти все идентифицированные пути в кластерах вирусных белков были представлены бактериальными аннотациями для набора AMG. Это наблюдение дополнительно подтверждает идею о том, что контиги прокариотических вирусов содержат кодирующий потенциал, чтобы влиять на состояние метаболизма и гомеостаз бактерий.

Функциональная аннотация показывает большое метаболическое перекрытие между белками бактериальных и прокариотических вирусов. ( A ) Количество вирусных и бактериальных белков, включенных в анализ (синий), количество кластеров, оставшихся после коллапса на 50% идентичности AA (оранжевый), и количество белковых кластеров, обнаруженных посредством Eggnog-Mapper или InterProScan. ( B ) Диаграмма Венна, изображающая количество кластеров белка и количество предполагаемых идентифицированных AMG. ( C ) Функциональная сеть, изображающая пути KEGG, представленные в кластерах вирусных белков.Вес ребра отражает количество присоединений GO, связанных с каждым путем, в диапазоне от 1 до 43. Все веса ребер, превышающие 1, обозначены числом на оконечном узле. Пути, обведенные красным прямоугольником, отображают функциональные пути, кодируемые вирусными генами, которые также отражаются бактериальными представителями AMG.

В попытке дополнительно охарактеризовать сигнатуры вторичных метаболитов, а также другие функции путей, которые отражают роль вторичных метаболитов, был запущен antiSMASH (37).Всего было идентифицировано четыре кластера генов, каждый из которых содержит один ген с сигнатурой бактериоцина ( SI, приложение , рис. S11). Четыре гена, содержащие сигнатуру бактериоцина, имели аминокислотное сходство с белками GenBank в диапазоне от 34 до 97%. Из идентифицированных кластеров генов от 13 до 53% соседних генов показали сходство с другими генами, представленными в базе данных antiSMASH. Наконец, была предпринята попытка охарактеризовать селекционные сигнатуры в кодируемых генах. Чтобы достичь этого, были вызваны однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) для репрезентативного контига, присутствующего в каждом пуле, и несинонимичные vs.Скорости синонимичных замен были рассчитаны с использованием SNPgenie (38). Большинство генов имело отношение πN / πS ниже 1, но 52 белка показали положительную селекционную сигнатуру по крайней мере в одном пуле ( SI, приложение , рис. S12). Из этих 52 белков 11 были функционально аннотированы. Эти функции включают в себя в основном капсидные и хвостовые домены, но также функции трансгликозилазы и эндопептидазы (см. SI, приложение , таблица S18, доступная на GitHub).

Обсуждение

Это исследование дает беспристрастный взгляд на прокариотические вирусные сообщества, связанные с медоносными пчелами.Тот факт, что кривая накопления видов не достигла фазы плато, означает, что полное разнообразие прокариотических вирусов не было исследовано, несмотря на большие усилия по отбору проб в сочетании с обогащением вирусоподобных частиц. Тот факт, что некоторые пулы содержали большое количество ридов эукариотических вирусов [также реплицирующихся в кишечнике медоносных пчел (39)], мог привести к неоптимальному зондированию бактериофагов в этих пулах. Полученные прокариотические вирусные последовательности демонстрируют большое разнообразие, что отражается количеством аннотированных генов и количеством pVOG, которые могут быть описаны.Общее отсутствие классификации контигов и тот факт, что большинство кодируемых генов не могут иметь описанную функцию, отражает это наблюдение. Кроме того, неуплощенная кривая накопления видов в сочетании с сильной положительной корреляцией между охватом и длиной подразумевает, что многие из описанных контигов являются фрагментированными геномами. В отличие от кишечного бактериального микробиома, сообщества прокариотических вирусов демонстрируют высокий уровень индивидуализма, когда очень мало последовательностей обнаруживается во многих пулах.Остается загадкой, могло ли это наблюдение быть следствием усилий по отбору проб или действительно отражать отсутствие вирома центральной кишки. Невозможно описать значительную корреляцию между сообществами бактериофагов, полученных от здоровых и слабых пчел, но как местоположение, так и год отбора пробы имели значительный эффект (хотя и с низким значением R-квадрата). Это наблюдение подкрепляет идею высокой индивидуальности и предполагает динамичный характер сообществ бактериофагов. Отнесение вирусных последовательностей к хозяину привело к отнесению только 1% контигов к их соответствующим бактериям.Поскольку оба метода (последовательности CRISPR-спейсера и сходство тРНК), используемые для определения хозяина, не обладают очень высокой чувствительностью, вероятно, что количество вирусных последовательностей, инфицирующих членов бактериального микробиома ядра кишечника, намного выше. С другой стороны, поскольку для обнаружения вирусов использовались целые пчелы, а не вскрытие кишечника, нельзя исключить, что некоторые последовательности представляют собой фаговые сообщества, связанные с почвой или растением. Перекрывающиеся результаты поиска CRISPRdb и поиска по пчелам показали, что большинство последовательностей действительно являются настоящими кишечными бактериофагами, но нельзя полностью исключить «загрязнение» окружающей среды.Наблюдение за тем, что почти все члены бактериального микробиома кишечника теперь имеют связанные с ними вирусные последовательности, подтверждает идею о том, что по крайней мере часть описанного здесь вирусного сообщества действительно является частью вирома пчелиного кишечника. Поскольку методы обогащения вирусных частиц никогда не работают идеально, возникает вопрос, что некоторые из извлеченных последовательностей могли происходить от бактерий. Поскольку бактериофаги также могут быть интегрированы в бактериальные геномы как профаги, процесс идентификации может быть подвержен ошибкам.Чтобы гарантировать, что последовательности, полученные в этом исследовании, происходят от вирусов, а не от бактериального заражения, были рассчитаны плотности кодирования и сдвиг цепи, которые значительно отличались от набора бактериальных данных. Оба параметра были выбраны, поскольку новый алгоритм идентификации бактериофагов определил их как наиболее информативные при различении вирусов и бактерий (40). Кроме того, никакие гены бактериальных маркеров не удалось идентифицировать с помощью Anvi’o (41), используя профили бактериальной скрытой марковской модели (HMM) с одной копией гена, определенные Lee et al.(28). Более того, большое количество терминов GO, связанных с предполагаемыми вирусными белками, содержит вирус-специфические сигнатуры, и перекрытие между кластерами бактериальных и вирусных белков (определяемых здесь как AMG) остается относительно небольшим. Можно было бы ожидать гораздо большего перекрытия между этими наборами кластеров, если бы они были загрязнены бактериальными последовательностями. Взятые вместе, эти данные подтверждают идею о том, что очень немногие или никакие из последовательностей, использованных в этом исследовании, имеют бактериальное происхождение. Классификация предполагаемых вирусных последовательностей привела к тому, что примерно 20% всех последовательностей были сгруппированы в 403 предполагаемых вирусных рода (кластеры генома), но многие из кластеров содержали только две последовательности или не содержали эталонного генома из установленного (Международного комитета по таксономии вирусов [признанный ICTV] род или семейство вирусов.Тот факт, что примерно 50% (273 из 537) контигов размером более 5 т.п.н. могут быть сгруппированы, отражает то, что короткая длина последовательности может препятствовать способности классифицировать эти последовательности. Поскольку точность алгоритма vConTACT2 оценивается более чем в 95% (на основе родов ICTV) (30), надежность классификации больших последовательностей высока. Доля кластеризованных последовательностей (примерно 20% всех последовательностей и примерно 50% последовательностей размером более 5 т.п.н.) выше, чем в аналогичном исследовании вирусов вечной мерзлоты (17% последовательностей кластеризованы более чем 10 т.п.н.) (42) и в кишечнике человека. наборы данных (кластеризовано 18% последовательностей размером более 10 т.п.н.) (43).Несмотря на относительно высокую долю сгруппированных последовательностей, результаты классификации отражают поразительно большое разнообразие прокариотических вирусных сообществ, связанных с пчелами, и то, какая часть вирусного разнообразия все еще остается неиспользованной. Это подтверждается тем фактом, что только очень небольшое количество предполагаемых последовательностей фагов, связанных с пчелами, присутствовало в крупнейших кластерах белков, созданных для классификации. Те же паттерны разнообразия отражены и в аннотации белков. Большинство предсказанных белковых кластеров остаются без аннотации.Из белков, которые, по прогнозам, находятся под сильным направленным отбором, только 20% можно было назначить функцию. Поскольку вероятно, что эти белки выполняют краеугольные функции в репликации вируса или важные функции в жизненном цикле вируса, отсутствие аннотации этих белков отражает, насколько мало известно об этих процессах. Из белков, которые можно было бы аннотировать значимым образом, подавляющее большинство было специфичным для процессинга / метаболизма нуклеиновых кислот и чаще всего происходило из последовательностей полимеразы, которые часто легче всего идентифицировать с очень специфическими доменами.Представленные пути содержат множество метаболических функций, включая пути переработки углеводов, белков и липидов. Многие из этих функций также представлены бактериальным аналогом микробиома пчелы, подразумевая, что виром пчелиного кишечника содержит кодирующий потенциал для широкого спектра метаболических функций и может напрямую вмешиваться в экосистему кишечника. Лучше всего представленные пути, такие как обработка генетической информации и метаболизм нуклеотидов, скорее всего, отражают стратегию перестройки фагов для настройки метаболизма бактериальных клеток в сторону репликации вируса, которая была описана ранее (44).Пути метаболизма липидов и нуклеотидов, скорее всего, указывают в одном направлении. Наличие путей обработки информации об окружающей среде предполагает, что некоторые из извлеченных бактериофагов могут исследовать окружающую среду. Было показано, что двухкомпонентная система может использоваться вирусами для создания сенсорной системы окружающей среды (45). Наличие более основных метаболических путей, таких как энергетический и углеводный обмен, означает, что бактериофаги в микробиоме пчел могут модулировать метаболическое состояние, а не захватывать микробную клетку и истощать ее ресурсы, как было показано ранее (46).Пути образования биопленок, определения кворума и хемотаксиса также были представлены в извлеченных вирусных сообществах, что свидетельствует о способности вирусных сообществ вмешиваться в микробные процессы на уровне бактериальной популяции. Наличие метаболических путей, вовлеченных во вторичные метаболиты и даже терпеноиды и поликетиды, поставило вопрос о том, могут ли какие-либо другие гены участвовать во взаимодействиях бактерий и бактерий. Открытие четырех кластеров генов бактериоцинов подразумевает, что эти бактериофаги не влияют напрямую только на своего хозяина и их метаболизм, но кодируют возможность оказывать влияние на другие бактерии в той же экосистеме на всем протяжении своего хозяина.Некоторые из идентифицированных генов бактериоцина были довольно расходящимися, и очень немногие из соседних генов в кластере вообще давали хоть какой-то удар. Эти данные предполагают, что, хотя основные взаимодействия хозяина и микробов у медоносных пчел известны, взаимодействия вирусов и бактерий в кишечнике пчел сильно взаимосвязаны. Наконец, мы можем выделить потенциальную роль, которую прокариотическое вирусное сообщество может играть в кишечнике и микробном метаболизме и, таким образом, косвенно влиять на развитие, здоровье и гомеостаз пчел.

Материалы и методы

Подготовка библиотеки и секвенирование следующего поколения.

Образцы были взяты из фламандской части проекта EpiloBEE за оба года отбора (осень 2012 и 2013 гг.) Из разных ульев. В рамках этого исследования здоровье колонии определялось ретроспективно путем оценки того, какие колонии пережили зиму или нет. Были взяты две медоносные пчелы на каждую колонию и гомогенизированы в течение 1 мин в фосфатно-солевом буфере с использованием керамических шариков (Precellys, Bertin Technologies) при частоте 4000 Гц с использованием гомогенизатора тканей (Minilys, Bertin Technologies).Гомогенаты из трех колоний были объединены в равные объемы по соображениям целесообразности. Образцы были объединены в зависимости от статуса (слабые или здоровые колонии), подвида и местоположения (см. SI, приложение , таблица S14, доступная на GitHub). После объединения гомогенаты были подготовлены для секвенирования с использованием протокола NetoVIR (22). Вкратце, гомогенаты центрифугировали (17000 × г в течение 3 минут), фильтровали (0,8 мкм) и обрабатывали смесью нуклеаз (бензоназа, Novagen) и микрококковой нуклеазой (New England Biolabs).

Затем нуклеиновые кислоты (как ДНК, так и РНК) были экстрагированы с использованием набора для экстракции вирусов РНК (Qiagen), подверглись обратной транскрипции и амплифицированы с использованием набора WTA2 (Sigma-Aldrich) и подготовлены для секвенирования с использованием набора Nextera XT (Illumina ). Библиотеки были количественно определены с помощью кубитового флуориметра, а размеры вставок были определены с помощью биоанализатора (Agilent). Для секвенирования рассматривались только библиотеки с молярностью выше 4 нМ и средним размером 300 п.н. или более. Парное секвенирование выполняли с использованием платформы Illumina NextSEQ, назначая 5 миллионов кластеров на пул (10 миллионов считываний с базовой длиной 150).Всего было секвенировано 102 пула (300 колоний).

Обработка считывания, идентификация и классификация контигов бактериофагов.

Считывания были обрезаны с помощью Trimmomatic (версия 0.38) (47), удалив адаптеры WTA2 и Nextera XT и 19 ведущих оснований, а 15 оставшихся оснований были обрезаны. Чтения были обрезаны с использованием скользящего окна 4 с отсечкой по шкале PHRED 20 с минимальным размером 50 п.н. Обрезанные чтения были собраны с использованием SPAdes (версия 3.12.0) (48) на метагеномной настройке с размерами kmer 21, 33, 55 и 77.Полученные контиги размером более 500 п.н. были кластеризованы по 95% нуклеотидной идентичности с охватом 80% с использованием ClusterGenomes (https://bitbucket.org/MAVERICLab/docker-clustergenomes). Предполагаемые последовательности прокариотических вирусов были идентифицированы с использованием VIRSorter (версия 1.05) (23) и путем включения последовательностей, которые имели самого низшего общего предка [как приписано KronaTools (версия 2.7.1) (49)] к любому семейству прокариотических вирусов после сопоставления с база данных неизбыточных белков (загружена 30 сентября 2018 г.) из Национального центра биотехнологической информации (NCBI).Считывания были сопоставлены с этими репрезентативными предполагаемыми прокариотическими вирусными последовательностями с помощью bwa-mem (50), а полученные файлы bam были подвергнуты постобработке с помощью BamM (https://github.com/Ecogenomics/BamM), что позволило выполнить выравнивание только с 95% идентичностью нуклеотидов. более 90% длины. Покрытия были рассчитаны из этих постобработанных файлов BAM с помощью BamM с использованием опции подсчета tpmean. Уменьшение размерности было выполнено для матрицы покрытия с использованием функции PCoA, реализованной в пакете ape в R (51), и формально протестировано с использованием теста Адониса, реализованного в пакете vegan в R (52).Предсказанные вирусные последовательности были классифицированы с использованием режима BLASTP, включенного в vConTACT2 (30), с использованием Prokaryotic Viral RefsEq. 88 база данных MCL (25) для кластеризации белков и ClusterONE (53) для кластеризации генома. Полученная сеть vConTACT2 была обработана с помощью библиотеки графического инструмента (54) на языке Python. Филогенетические деревья для пяти самых больших кластеров белков были созданы путем выравнивания последовательностей белков с помощью MAFFT (настройка l-INS-i) и обрезки полученного выравнивания с помощью trimAL (версия 1.2) с использованием предустановки gappyout. Впоследствии деревья были созданы с помощью RaxML (версия 8.2.12) (55) с использованием автоматического выбора модели. Статистические данные с филогенетических деревьев обрабатывались с помощью инструментария ete3 (56), реализованного на python.

Вызов хоста.

Бактериальные последовательности были получены из базы данных IMG / M (JGI) с помощью запроса «медоносная пчела» и дополнены последовательностями от Ellegaard et al. (27) ( SI Приложение , Таблица S15). Спейсеры CRISPR были предсказаны на основе этих бактериальных последовательностей с использованием MINCED (версия 0.2.0) (57). Эта коллекция CRISPR-спейсеров впоследствии была обработана на уровне нуклеотидов в базе данных, содержащей полученные последовательности бактериофагов, с использованием алгоритма blastN с дополнительными настройками -ungapped и -perc_identity 100. Эти настройки более консервативны, чем обычно (58), но были выбраны. для достижения максимально возможной специфичности за счет чувствительности. Параллельно с этим были предсказаны гены тРНК из полученных последовательностей бактериофагов с использованием Арагорна (версия 1.2.38) (59) и обработали бактериальные последовательности с помощью алгоритма blastN с отсечкой е-значения 1e-5. Чтобы оценить, сколько из извлеченных вирусных последовательностей происходит из окружающей среды, а не отражает истинные бактериофаги пчелиного кишечника, был проведен дополнительный анализ с использованием спейсеров CRISPR из CRISPRdb (29) с использованием тех же параметров blastN, что и раньше. Выравнивание конкатенированных белков для бактериальных последовательностей было создано с помощью Anvi’o (версия 5) (41), используя рабочий процесс «филогеномики».Полученное выравнивание было обрезано с помощью trimAl (версия 1.2) с использованием предустановки gappyout. Белковые модели были рассчитаны с помощью ProtTest3 (версия 3.4.2) (60), а филогения была создана с использованием RAxML (версия 8.2.12) (55) в рамках модели LG + I + G + F. Полученное дерево было визуализировано с помощью ggtree (версия 3.10) (61).

Функциональный анализ.

Предполагаемые вирусные гены были предсказаны с помощью генетического кода бактерий (11). Полученные белки были кластеризованы с помощью CD-HIT (версия 4.8.1) (62) с порогом 50% аминокислотного (АК) сходства. Бактериальные гены (из вышеупомянутого набора бактериальных данных) были предсказаны и сгруппированы с помощью одного и того же конвейера. Репрезентативные белковые последовательности анализировали с помощью InterProScan (версия 5.30–69.0) (31) и eggNOG-mapper (версия 1.0.2) (32). Последующий анализ проводился с помощью REVIGO (35) и KEGG Pathway Maps (36). Области профагов были идентифицированы в бактериальных контигах с помощью PHASTER (34). Антимикробные функции были извлечены из выходных данных InterProScan и eggNOG-mapper и дополнены с помощью antiSMASH (версия 5.0.0) (37) вывод. SNP вызывались с помощью freebayes (версия 1.2.0) (63) для отфильтрованных файлов BAM с использованием флагов -X, -u и -p1. Полученные файлы VCF были отфильтрованы для достижения порога качества 20. Статистика SNP впоследствии была рассчитана с помощью SNPgenie (38).

Статистика.

Кривая накопления видов была рассчитана с использованием функции «specaccum» в веганской версии R 3.5.3 (52) с использованием всех 102 секвенированных пулов. Разница между плотностью кодирования и частотой сдвига цепей, а также разница в длине контигов между кластеризованными контигами и одиночными контигами была рассчитана с помощью Python с использованием двустороннего теста Манна – Уитни U , реализованного в библиотеке SciPy.Для анализа плотности кодирования и частоты сдвига цепей использовали 24 420 предсказанных вирусных генов и 58 704 предсказанных бактериальных гена. Для разницы в длине кластеризованного контига и одиночного контига использовалось 1034 кластеризованных контига и 3010 одноточечных контигов. Корреляции рассчитывались с помощью ранжированной корреляции Спирмена, реализованной в библиотеке SciPy. Для корреляции между охватом и длиной были использованы 4842 предполагаемых вирусных контига. Корреляции между длиной ответвлений и расстояниями между узлами в сети были рассчитаны с использованием 224 714 пар.

Доступность данных.

Полученные прокариотические вирусные последовательности размером более 5 т.п.н. были отправлены в NCBI GenBank (номера доступа доступны в SI Приложение , таблица S19, доступная на GitHub). Необработанные чтения были депонированы в базу данных архива последовательного чтения NCBI (SRA) под номером доступа к проекту. PRJNA579886 (номера доступа SRA также доступны в SI, приложение , таблица S19, доступная на GitHub). Блокноты анализа размещены на GitHub (https: // github.com / Matthijnssenslab / beevir). Все промежуточные файлы результатов и сгенерированные выходные данные, а также последовательности fasta для нуклеотидов и белков также доступны через репозиторий GitHub. Полный обзор мокрой лабораторной работы и конвейера обработки данных приведен в Приложении SI , рис. S13.

Выражение признательности

Этот проект финансировался Федеральной государственной службой здравоохранения, безопасности пищевых продуктов и окружающей среды Бельгии (грант RF 16/6306 ViroBee). Мы благодарим исследование EpiloBEE (Европейская комиссия) за предоставленный доступ к образцам.ФУНТ. финансировался Исследовательским фондом Фландрии (FWO). C.K.Y финансировался Межфакультетским советом по сотрудничеству в целях развития (IRO) из KU Leuven. Вычислительная мощность для этой работы была предоставлена ​​Фламандским суперкомпьютерным центром (VSC) и финансировалась FWO и Департаментом экономики, науки и инноваций (EWI) правительства Фландрии.

Сноски

• Вклад авторов: W.D., D.C.d.G. и J.M. разработали исследование; W.D., L.B., C.K.Y. и P.M.проведенное исследование; W.D. и L.B. проанализированные данные; и W.D. и J.M. написали статью.

• Авторы заявляют об отсутствии конкурирующей заинтересованности.

• Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

• Размещение данных: Полученные прокариотические вирусные последовательности размером более 5 т.п.н. были депонированы в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (номера доступа доступны в SI Приложение , таблица S18, доступная на GitHub).Необработанные чтения были депонированы в базу данных архива чтения последовательностей (SRA) NCBI под номером доступа. PRJNA579886 (номера доступа SRA также доступны в приложении SI , таблица S18, доступная на GitHub). Блокноты для анализа доступны на GitHub (https://github.com/matthijnssenslab/beevir). Все файлы промежуточных результатов и полученные выходные данные, а также последовательности fasta для нуклеотидов и белков также доступны через репозиторий GitHub.

• См. В Интернете сопутствующее содержание, например комментарии.

• Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу https://www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1921859117/-/DCSupplemental.

• Copyright © 2020 Автор (ы). Опубликовано PNAS.

WPA 2: Глава 4

Определение переменных

  m.names <- c ("Барамгва хамдже сараджида", "Бессонница в Сиэтле", "Предсказатель воды",
             «Улетай домой», «Три мушкетера», «Candyman: Прощай, плоть»,
             "Милый, я взорвал ребенка", "Kingsman: Секретная служба", "Аджаб Прем Ки Газаб Кахани",
             «Жизнь жука», «Мужество под огнем», «Грязные милые штучки»,
             «Во имя отца», «Душевный план», «Magnum Force», «О времени»,
             «Дом из песка и тумана», «Бокура га ита Зенпен», «Чудаки 3D»,
             «Тропический гром - Пиратская сказка»)

boxoffice <- c (28686545, 218076024, 30864649, 35870837, 50375628, 13899536,
               58662452, 404561724, 15
1, 363089431, 100748262, 14156753,
               25096862, 14553807, 44680473, 89177486, 16157923, 26324268, 171685793,
               1250)

жанр <- c («Боевик», «Романтическая комедия», «Драма», «Драма», «Приключения»,
           «Ужасы», «Комедия», «Боевик», «Комедия», «Приключения», «Драма»,
           «Драма», «Драма», «Комедия», «Боевик», «Романтическая комедия», «Драма»,
           «Драма», «Комедия», «Комедия»)

время <- c (121, 100, 112, NA, NA, NA, NA, 129, NA, 96, 111, NA, NA, NA,
          NA, 123, NA, 121, 93, 106)

рейтинг <- c (NA, «PG», «R», «PG», «PG», «R», «PG», «R», NA, «G», «R»,
            «R», «R», «R», NA, «R», «R», NA, «R», «R»)  

Вопрос 1

  г.имена [10]  

  ## [1] "Жизнь жука"  

Вопрос 2

Часть A

  жанр [1: 5]  

  ## [1] «Боевик» «Романтическая комедия» «Драма» «Драма»
## [5] «Приключения»  

Часть B

  время [1: 5]  

  ## [1] 121 100 112 NA NA  

Вопрос 3

  m.names [seq (2, length (m.names), 2)]  

  ## [1] «Бессонница в Сиэтле» «Улетай домой»
## [3] «Candyman: Прощай, плоть» «Kingsman: Секретная служба»
## [5] «Жизнь жуков» «Симпатичные грязные штучки»
## [7] «Душевный план» «О времени»
## [9] «Бокура га ита Дзенпен» «Тропический гром - Пиратская сказка»  

Вопрос 4

  лог.names <- m.names == "Тропический гром - Пиратская сказка"
m.names [log.names] <- "Troping Thunder"  

Вопрос 5

  log.genre.romantic <- genre == "Романтическая комедия"
жанр [log.genre.romantic] <- "RomCom"

log.genre.horror <- genre == "Хоррор"
жанр [log.genre.romantic] <- «Очень страшное кино !!!»  

Вопрос 6

  boxoffice.millions <- boxoffice / 1000000  

Вопрос 7

  сводка (касса)  

  ## Мин.1st Qu. Среднее значение 3-го кв. Максимум.
## 13 
0 22860000 40280000 95680000 118500000 404600000 
  

  сд (касса)  

  ## [1] 116422556  

Вопрос 8

  стол (жанр)  

  ## жанр
## Боевик Приключение Комедия Драма Хоррор
## 3 2 5 7 1
## Фильм ужасов!!!
## 2  

Вопрос 9

  сумма (жанр == "драма")  

  ## [1] 7  

Вопрос 10

  касса [м.names == "Жизнь жука"]  

  ## [1] 363089431  

  жанр [m.names == "Жизнь жука"]  

  ## [1] «Приключения»  

  время [m.names == "Жизнь жука"]  

  ## [1] 96  

  рейтинг [m.names == "Жук-жизнь"]  

  ## [1] "G"  

Вопрос 11

  log.names.pirates <- m.names == "Пираты Карибского моря"
сумма (лог.names.pirates)  

  ## [1] 0  

Вопрос 12

A

  log.comedy <- genre == "Комедия"
m.names [лог.комедия]  

  ## [1] «Милый, я взорвал ребенка» «Аджаб Прем Ки Газаб Кахани»
## [3] "Душевный самолет" "Чудаки 3D"
## [5] "Troping Thunder"  

Б

  среднее (касса [лог.комедия])  

  ## [1] 
943  

Вопрос 13

  г.имена [касса> 50000000]  

  ## [1] «Бессонница в Сиэтле» «Три мушкетера»
## [3] «Милый, я взорвал парня» «Kingsman: Секретная служба»
## [5] «Жизнь жука» «Мужество под огнем»
## [7] «О времени» «Чудаки 3D»
## [9] "Troping Thunder"  

Вопрос 14

A

  comedy.drama <- жанр% в% c («Комедия», «Драма»)
мин (касса [комедия.драма])  

  ## [1] 14156753  

Б

  m.names [which (boxoffice == min (boxoffice [comedy.drama]))]  

  ## [1] "Dirty Pretty Things"  

Вопрос 15

A

  медиана (время, na.rm = ИСТИНА)  

  ## [1] 111,5  

Б

  медиана (время, na.rm = ИСТИНА) / 60  

  ## [1] 1.858333  

Вопрос 16

A

  г.имена [рейтинг == "R"]  

  ## [1] NA "The Water Diviner"
## [3] «Candyman: Прощай, плоть» «Kingsman: Секретная служба»
## [5] NA "Мужество под огнем"
## [7] «Грязные штуки» «Во имя отца»
## [9] "Душевный план" NA
## [11] «О времени» «Дом из песка и тумана»
## [13] NA "Jackass 3D"
## [15] "Troping Thunder"  

Б

  медиана (кассовые сборы [рейтинг == "R"], па.rm = ИСТИНА)  

  ## [1] 30864649  

Вопрос 17

A

  rating.gpg <- рейтинг% в% c ("G", "PG")
m.names [rating.gpg]  

  ## [1] «Бессонница в Сиэтле» «Улетай домой»
## [3] «Три мушкетера» «Милый, я взорвал малыша»
## [5] "Жизнь жука"  

Б

  среднее (время [rating.gpg], na.rm = T)  

  ## [1] 98  

Вопрос 18

A

  среднее (жанр == "драма")  

  ## [1] 0.35  

Б

среднее (время [время> 100], na.rm = T)

Вопрос 19

  m.names [(касса <30000000) & (genre == "Comedy")]  

  ## [1] «Аджаб Прем Ки Газаб Кахани» «Душевный план»  

Вопрос 20

  boxoffice.order <- m.names [заказ (boxoffice)]
boxoffice.order  

  ## [1] "Candyman: Farewell to Flesh" "Dirty Pretty Things"
## [3] "Душевный план" "Аджаб Прем Ки Газаб Кахани"
## [5] «Дом из песка и тумана» «Во имя отца»
## [7] "Бокура га ита Дзенпен" "Барамгва хамдже сараджида"
## [9] "Прорицатель воды" "Улетай домой"
## [11] "Magnum Force" "Три мушкетера"
## [13] «Милый, я взорвал ребенка» «О времени»
## [15] «Мужество под огнем» «Чудаки 3D»
## [17] "Тропа грома" "Бессонница в Сиэтле"
## [19] «Жизнь жука» «Kingsman: Секретная служба»  

Вопрос 21

Как назывались пять самых кассовых фильмов?

  сортировать.boxoffice <- sort (boxoffice, по убыванию = T)  

Человек-мед! - Росси Модо BB

Themra Epimedium Macun aka MAN-Honey - это натуральный афродизиак, изготовленный из натуральных ингредиентов. Его также можно назвать сорняком роговой козы, поскольку основным ингредиентом является эпимедиум (или инкариин). Он стимулирует приток крови к половым органам, таким образом усиливая половое влечение. Он сделан из натуральных продуктов, а не из химических веществ.

Трава эпимедиума выращивается в Азии и Европе.Эффект афродизиака был замечен, когда животные смотрели на его листья. После этого произошла вязка. В настоящее время это растение используется в китайской медицине для борьбы с эректильной дисфункцией. Также его назначают представителям обоего пола с низким половым влечением. Также было обнаружено, что мужчины могут испытывать увеличение количества сперматозоидов и общее сексуальное удовлетворение. Также замечено, что женщины, употребляющие эпимедиум макун после менопаузы, испытывают больше удовольствия, меньше утомляемости и гипертонии.

Исследования 2008 г. показали, что основным веществом эпимедиума является инкариин.Американский химический союз провел исследование под руководством Марио Делл’Агли и его команды, и выяснилось, что инкариин улучшает кровоток в гениталиях, в основном за счет связывания фермента SHGB, который блокирует биологическую активность тестостерона. Таким образом, он дает впечатляющие результаты в борьбе с эректильной дисфункцией. Отмечено, что он увеличивает количество сперматозоидов у мужчин за счет усиления ослабленных организмов, а также увеличивает сексуальное удовлетворение как у мужчин, так и у женщин.

Epimedium macun изготовлен из других натуральных продуктов, таких как цветочный мед, имбирь, имбирь, имбирь, корица, ваниль, пыльца, маточное молочко.Вкус представляет собой смесь сладкого и горького ароматов. Продукт вкусный и в то же время разработан для того, чтобы вести более активную половую жизнь, получать от нее больше удовольствия и забыть о проблемах с преждевременной эякуляцией или импотенцией.

Состав:

Глюкозный сироп (78,61%)
Цветочный мед (11,12%)
Меласса тутовая (3,78%)
Пыльца (1,57%)
Epimedium aka Horny Goat Weed (Incariin) (0,79%) )
Кэроб (0,63%)
Овес (0,63%)
Имбирь (0,63%)
Малый галангал (0,47%)
Корица (0,31%)
Мака (0,31%)
Американский женьшень (0,16%)
Крапива (0,16%)
Сибирский женьшень (0,13%)
Гинкго билоба (0,13%)
Красный женьшень (0,13%)
Тыква (0,11 %)
Tribilus Terrestris (0,11%)
Орех кола (0,08%)
Ванильный ароматизатор (0,08%)
Маточное молочко (0,06%)

Направление:

Перед употреблением рекомендуется тщательно перемешать содержимое банки.Достаточно одной чайной ложки продукта. Примерно через 20 минут вы почувствуете эффект повышенного сексуального влечения.

Однако все зависит от вашего веса и метаболизма ... так что лучше сначала попробовать меньшую дозу, например половину ложки, и посмотреть, что произойдет, а затем увеличить до чайной ложки.

Заявление об отказе от ответственности:

Информация, представленная на этом сайте, предназначена только для общего ознакомления и не заменяет профессиональные медицинские консультации или лечение определенных заболеваний.Вы не должны использовать эту информацию для диагностики или лечения проблемы со здоровьем или заболевания без консультации с квалифицированным поставщиком медицинских услуг. Пожалуйста, проконсультируйтесь с вашим врачом с любыми вопросами или проблемами, которые могут у вас возникнуть в отношении вашего состояния. Использование вами этого веб-сайта означает ваше согласие с опубликованными условиями использования и всеми политиками сайта.