Инвитро мед офис: Новый медофис ИНВИТРО в Челябинске

Содержание

Медицинская компания ИНВИТРО в Республике Беларусь. Клинико-диагностические лаборатории

26 городов
присутствия

1 лабораторный
комплекс

49 медицинских
офисов

INVITRO предлагает медицинскому сообществу и жителям Беларуси широкие диагностические возможности, более 1800 видов лабораторных исследований, современные технологии и методы их выполнения. Компания обладает более чем 20-летним опытом работы в сфере медицинских исследований, который планомерно интегрируется в систему здравоохранения Беларуси.

INVITRO предоставляет услуги в корпоративном секторе. Мы сотрудничаем с государственными и частными медицинскими учреждениями, научными центрами и страховыми компаниями.

Интернет-клуб ИНВИТРО

Уважаемый посетитель!

Рады приветствовать вас на сайте интернет-клуба ИНВИТРО!

ИНВИТРО – крупнейшая в России частная медицинская компания, с 1995 года работает на рынке услуг в области лабораторной диагностики. На сегодняшний день компания предлагает более 1700 видов лабораторных исследований, эффективно помогая врачам и пациентам заботиться о здоровье на протяжении всей жизни. Спектр медицинских анализов, выполняемых

ИНВИТРО в клинико-диагностических целях, включает гематологические и общеклинические исследования, исследование гемостаза, биохимический анализ крови на инфекции методом иммуноферментного анализа, коагулологические, гормональные, генетические, иммунологические, микробиологические, гистологические, онкоцитологические исследования, диагностику паразитарных инфекций, ПЦР-диагностику, определение маркеров воспалительного процесса и аутоиммунных заболеваний и лекарственный мониторинг. Помимо лабораторных исследований, в медицинских офисах сети и диагностических центрах ИНВИТРО можно пройти инструментальные и рентгенологические исследования, обследования методами компьютерной диагностики.

Международная сеть ИНВИТРО включает девять высокотехнологичных комплексов и более 900 медицинских офисов, работающих в четырех странах – России, Беларуси, Украине и Казахстане. Интернет-клуб ИНВИТРО – это возможность заочно проконсультироваться с лучшими врачами по назначению анализов или интерпретации их результатов. Просто заполните специальную форму на сайте нашего интернет-клуба, и врач-специалист ответит на ваш вопрос в ближайшее время. Кроме того, актуальную медицинскую информацию о самых распространенных заболеваниях и методах их диагностики можно найти на сайте «То, что доктор прописал».

Обращаем внимание, что, согласно нашим правилам работы, в интернет-клубе ИНВИТРО не обсуждаются вопросы лечения. Просим понять, что в силу большого количества запросов врачи-консультанты ИНВИТРО не вступают в переписку с пациентами – для получения развёрнутого ответа приглашаем вас на консультацию в один из наших медицинских офисов. Помните, что в рамках интернет-консультации доктор может дать лишь короткие рекомендации, которые не станут полноценной заменой очной беседе со специалистом. Если вам нужна экстренная консультация, целесообразнее сразу обратиться в медицинский офис, т.к. ответ доктора появится на сайте в течение 2-3 дней.

В Магнитогорске открылся пятый медицинский офис ИНВИТРО. В честь открытия всех пациентов ждут скидки до 50% » Новости на Верстов.Инфо

11 июля 2018

Теперь, когда в Магнитогорске открылся уже пятый медофис компании ИНВИТРО, местным жителям стало проще заботиться о своем здоровье, имея доступ к качественным услугам в области лабораторной диагностики. Новый медицинский офис работает без выходных, предлагая более 1800 видов лабораторных исследований без записи, очередей и длительного ожидания результатов.

Современная система штрихкодирования пробирок гарантирует идентификацию каждой пробы и исключает возможность перепутать образцы, а благодаря продуманной системе логистики результаты многих исследований готовы уже через сутки после дня взятия биоматериала.

Чтобы узнать о готовности результатов анализов, вы можете подключить бесплатное SMS-уведомление. А получить их можно удобным способом на выбор: по электронной почте, через личный кабинет на сайте www.invitro.ru, а также по телефону или лично в медицинском офисе.

В честь открытия для всех посетителей ИНВИТРО по адресу: г. Магнитогорск, ул. Пушкина, д. 28, действует акция «Летний Chek Up». Это – 6 комплексов популярных исследований на обследование щитовидной железы, печени и другие со скидками до 50%. Чтобы воспользоваться акционным предложением – необходимо прийти в ИНВИТРО по адресу: г. Магнитогорск, ул. Пушкина, д. 28 и назвать кодовое слово «Верстов». Акция действует до 31.08.2018.

На правах рекламы
Если вы заметили ошибку в тексте, выделите ее и нажмите Ctrl+Enter
Запись к врачу в медицинскую лабораторию по адресу 2, центральный район, жилой массив олимпийский, воронеж
Все клиники в Воронеже
Запись к врачу по телефону в медицинскую лабораторию — Инвитро по адресу 2, Центральный район, жилой массив Олимпийский, Воронеж
Запомни телефон:
Открыто. Закроется через 1 минуту. Местное время 18:59
Пн Вт Ср Чт Пт Сб Вс
7:00 — 19:00
7:00 — 19:00
7:00 — 19:00
7:00 — 19:00
7:00 — 19:00
8:30 — 15:00
8:30 — 15:00
Оцените работу заведения:
Голосов: 21 чел. Рейтинг: 4 из 5.
Каким образом вы записываетесь к врачу? (Кол-во голосов: 100974)
Через интернет
По телефону
Лично в клинике
Я не болею
Чтобы проголосовать, кликните на нужный вариант ответа.Результаты
Инвитро
Рейтинг: 4 21 оценка
Записываясь на прием к врачу в медицинскую лабораторию «Инвитро» обратите внимание на особенности:
методы диагностикиУЗИ
оплата картойДа
форма собственностичастная
Рабочее время в которое можно записаться на прием к врачу Пн-Пт 07:00 — 19:00, Сб-Вс 08:30 — 15:00
Инвитро находится по адресу:
2, Центральный район, жилой массив Олимпийский, Воронеж
Интересно: Как записаться на прием к врачу через портал «Госуслуги»
О компании
Диагностический центр Инвитро — мед. учреждение, располагающее новейшим медицинским оборудованием грамотным штатом сотрудников. Принимает учреждение в следующее время — пн-пт 7:00–19:00; сб,вс 8:30–15:00.
Недорогие услуги заведения, правильный подход к лечению клиента — лишь часть того, что популяризует заведение среди местных жителей.
На нашем портале можно произвести запись на прием к врачу в учреждение «Диагностический центр Инвитро» , а также ознакомиться со стоимостью на услуги мед. учреждения, посмотреть перечень предоставляемых услуг. Сделать запись в в диагностический центр можно круглосуточно благодаря нашему веб-сайту.
По выше приведенным телефонным номерам можете задавать имеющиеся вопросы, консультируйтесь у мед персонала о насущных проблемах.
Продуманный и личный подход к каждому пациенту — девиз компании «Диагностический центр Инвитро». Наш адрес: Россия, Воронеж, Центральный район, жилой массив Олимпийский, 2.
Записывайтесь на прием к врачу онлайн к нам в диагностический центр,мы с радостью примем Вас!
Фото объекта
Все клиники в Воронеже
Официальный сайт: Инвитро
Построить маршрут по карте до объекта медицинская лаборатория, диагностический центр, либо до ближайших объектов:
Московский просп., 112, Воронеж
Московский пр., д. 112
Московский просп., 112, Воронеж
Московский просп., 112, Воронеж
Московский просп., 112, Воронеж
Где сдать анализы в Сарове
Сдать анализы в Сарове в лаборатории «Гемотест»

Самыми популярным сейчас являются тесты на ковид. В лабораториях «Гемотест» в Сарове вы можете сделать ПЦР-тест на SARS-CoV-2 и тест на антитела IgM/IgG. Мазок на коронавирус в Сарове необходим для получения Справки об отсутствии ковида. Так-же вы можете сдать анализы крови, мочи и анализ кала согласно графику работы медицинских лабораторий и офисов. В большинстве офисов можно сделать УЗИ, ЭКГ, кольпоскопию, получить быстрые результаты анализов и их расшифровку у врача-консультанта.
В «Гемотест» можно получить официальную справку подтверждающую отрицательный COVID-статус. Справка об отсутствии ковида может понадобиться при выезде за пределы территории Российской Федерации, при перемещении между регионами внутри страны, либо по дополнительному требованию (на работе, в аэропорту/санатории/отеле).

В лабораториях «Гемотест» в Сарове можно сдать различные анализы крови.
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, Казанское ш., д. 4
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, просп. Гагарина, д. 66, пом. П1
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»

Нижегородская область,
Нижний Новгород, просп. Гагарина, д.101, корп. 4
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, просп. Кирова, д. 8
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, просп. Кораблестроителей, д. 4
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, просп. Ленина, д. 26
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, просп. Союзный, д. 2
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Бекетова, д. 21/16
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Ванеева, д. 6
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Звездинка, д. 7
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Карла Маркса, д. 20
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Народная, д. 38
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Плотникова, д. 3
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Янки Купалы, д. 38
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Гемотест»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, Юбилейный б-р, д. 2
Телефон для записи: +7 (800) 550-47-89
Сдать анализы в Сарове в лаборатории «Хеликс»
Самыми популярным сейчас являются тесты на ковид. В лабораториях «Хеликс» в Сарове вы можете сделать ПЦР-тест на SARS-CoV-2 и тест на антитела IgM/IgG. Мазок на коронавирус в Сарове необходим для получения Справки об отсутствии ковида. Так-же вы можете сдать анализы крови, мочи и анализ кала согласно графику работы медицинских лабораторий и офисов. В большинстве офисов можно сделать УЗИ, ЭКГ, кольпоскопию, получить быстрые результаты анализов и их расшифровку у врача-консультанта.
В «Хеликс» можно получить официальную справку подтверждающую отрицательный COVID-статус. Справка об отсутствии ковида может понадобиться при выезде за пределы территории Российской Федерации, при перемещении между регионами внутри страны, либо по дополнительному требованию (на работе, в аэропорту/санатории/отеле).
В лабораториях «Хеликс» в Сарове можно сдать различные анализы крови.
Телефон для записи в Сарове: +7 (831) 200-34-46
Телефон для записи: +7 (800) 700-03-03
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Хеликс»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Ошарская, д. 63
Телефон для записи: +7 (831) 200-34-46
Телефон для записи: +7 (800) 700-03-03
Сдать анализы в Сарове в лаборатории «Инвитро»
Самыми популярным сейчас являются тесты на ковид. В лабораториях «Инвитро» в Сарове вы можете сделать ПЦР-тест на SARS-CoV-2 и тест на антитела IgM/IgG. Мазок на коронавирус в Сарове необходим для получения Справки об отсутствии ковида. Так-же вы можете сдать анализы крови, мочи и анализ кала согласно графику работы медицинских лабораторий и офисов. В большинстве офисов можно сделать УЗИ, ЭКГ, кольпоскопию, получить быстрые результаты анализов и их расшифровку у врача-консультанта.
В «Инвитро» можно получить официальную справку подтверждающую отрицательный COVID-статус. Справка об отсутствии ковида может понадобиться при выезде за пределы территории Российской Федерации, при перемещении между регионами внутри страны, либо по дополнительному требованию (на работе, в аэропорту/санатории/отеле).
В лабораториях «Инвитро» в Сарове можно сдать различные анализы крови.
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, Мещерский б-р, д. 7, корп. 3
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Казанское шоссе, д. 5
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, пр-т Гагарина, д. 104
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, пр-т Гагарина, д. 107
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, пр-т Кирова, д. 1А
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, пр-т Ленина, д. 48
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Коминтерна, д. 260
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Коминтерна, д. 6/1
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Культуры, д. 7, корп. 1
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Горького, д. 184
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Родионова, д.17
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, Московское шоссе, д. 179
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, пр-кт Ленина, д. 76
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Бекетова, д. 11/1
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Веденяпина, 14
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. М. Горького, д. 80/1
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе «Инвитро»
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Ульянова, д. 12
Телефон для записи: +7 (800) 200-36-30
Сдать анализы в Сарове в лаборатории
Самыми популярным сейчас являются тесты на ковид. В лабораториях в Сарове вы можете сделать ПЦР-тест на SARS-CoV-2 и тест на антитела IgM/IgG. Мазок на коронавирус в Сарове необходим для получения Справки об отсутствии ковида. Так-же вы можете сдать анализы крови, мочи и анализ кала согласно графику работы медицинских лабораторий и офисов. В большинстве офисов можно сделать УЗИ, ЭКГ, кольпоскопию, получить быстрые результаты анализов и их расшифровку у врача-консультанта.
можно получить официальную справку подтверждающую отрицательный COVID-статус. Справка об отсутствии ковида может понадобиться при выезде за пределы территории Российской Федерации, при перемещении между регионами внутри страны, либо по дополнительному требованию (на работе, в аэропорту/санатории/отеле).
В лабораториях в Сарове можно сдать различные анализы крови.
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе
Нижегородская область,
Нижний Новгород, пер. Спортсменский, 12
5260156369
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Бекетова, 13
5262146334
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе
Нижегородская область,
Нижний Новгород, ул. Красносельская, 11А
5262252413
Сдать медицинские анализы в лабораторной службе
Нижегородская область,
Выкса, ул. Красные Зори, 16/8
5262215034
Второй офис «Инвитро» открылся в Южно-Сахалинске. Сахалин.Инфо
10:53 22 ноября 2018
Второй офис одной из крупнейших в России частных медицинских компаний «Инвитро» открыл двери для пациентов в Южно-Сахалинске и предлагает скидку 30% на исследования до 26 ноября включительно.
Новый медицинский офис «Инвитро» — это более 2000 видов лабораторных анализов, в том числе исследования гинекологического и урологического материала, кабинет УЗ-диагностики, возможность пройти кольпоскопию и получить бесплатную услугу врача-консультанта. Он поможет подобрать необходимые анализы, ответит на вопросы о процедурах и подскажет, к какому специалисту следует обратиться с результатами для постановки диагноза.
Кроме того, в новом офисе уже начали прием эндокринолог и педиатр. Прием данных специалистов до конца ноября будет тоже с приятной скидкой — 20%.
Обратиться в медицинский офис «Инвитро» можно самостоятельно или по направлению лечащего врача. Возможность сдать все анализы в одном месте — это удобно и выгодно: комплексные предложения составлены не только с учетом медицинской целесообразности, но и с максимальной скидкой. Результаты исследований действительны во всех государственных медицинских учреждениях на территории России.
Основанная в 1995 году врачом-реаниматологом Александром Островским, сегодня медицинская компания «Инвитро» располагает крупнейшей в Восточной Европе сетью медицинских офисов в 6 странах и 9 наиболее современными лабораторными комплексами. В 2017 году компания стала лауреатом премии Правительства РФ в области качества. Точность и оперативность значат очень много для наших клиентов, и мы всегда помним об этом. Уже второй год подряд «Инвитро» подтверждает качество своей работы по международной сертификации Westgard QC Inc. В декабре 2017 года компания получила сертификат на 2018 год.
Благодаря продуманной логистике пациенты получают результаты многих исследований уже через сутки после дня взятия биоматериала. Мы используем авиа и автоперевозки в зависимости от местонахождения медицинского офиса. Специальные контейнеры позволяют поддерживать оптимальный температурный режим для сохранения свойств биоматериала при транспортировке.
Подключив бесплатное SMS-уведомление, вы можете оперативно узнать о готовности результатов исследований. Получить их можно любым удобным способом на выбор: по электронной почте, в личном кабинете на сайте, по телефону с помощью кодового слова или придя в медицинский офис. Персональные данные пациентов строго конфиденциальны.
График работы нового медицинского офиса: в будние дни с 7:30 до 20:00, в субботу с 8:00 до 15:00 и воскресенье с 9:00 до 15:00.
Подробности об услугах медицинской компании и правилах подготовки к взятию биоматериала доступны на сайте invitro.ru и по телефонам: 605-333, 603-333, 8-900-660-33-33, а также WhatsApp: 8-900-660-53-33.
Южно-Сахалинск, проспект Победы, 76 и проспект Мира, 250.
Инстаграм.
Имеются противопоказания, необходима консультация специалиста.
Лицензия №ЛО-43-01-002895 от 1 ноября 2018.
Вовремя / УЗИ-кабинет *МедикСан* / Медицинские центры города Барановичи на vovremia.com
Все было отлично, живу в Минске давно, но всегда обслуживание авто делал у них по приезду. хвалил и рекомендовал ребят всем. хотя мне говорили что я «не мамонт» и зря переплачиваю) Да, дороже, но за первые 2 года обслуживания ни одного нюанса не было. Даже были приятные плюшки — не успели вовремя — скидку на ремонт делали. Но это было давно. но от любви до ненависти один шаг). Началось года 3 назал. Был гольф 5 максимально простое авто — в принципе даже я слышал что сайлентблоки меняются в сборе с рычагами. мастер приговорил только сайлентблоки к замене(без рычагов) их же магазин «подобрал» эти сайлентблоки отдельно хотя на лице у парня в магазине читалось что-то не то в этот момент, так понимаю просто не мог найти в каталоге эту позицию. На вопрос а «разве не с рычагом» — нет, все гуд. и конечно же звонок с сто в момент ремонта — «нужно заказывать рычаги и что-то еще» ремонт в цене сразу Х2 ладно но и запчасть ждать сутки, а я напомню из Минска и мне на работе быть нужно через сутки. Ну ладно один раз не считается Бывает.
Следующий раз замена передних колодок и дисков на пассате — проезжаю 300 метров и бац ошибочка по тормозам — износ колодок. Приезжаю, говорю непорядок, приемщик не понимает что этот символ обозначает на приборке, ему в принципе и не нужно вдаваться в эти детали его дело принять и отдать и быть связующим звеном. Выходит «мастер» и сразу в лицо «все норм сделал все отлично проблем быть не может это у вас ЗАДНИЕ КОЛОДКИ НУЖНО МЕНЯТЬ». надо же какое совпадение) кстати, задние колодки собирался менять в следующий визит, но сам факт что в задних колодках нет датчика износа и ошибки по ним просто не может быть не смутил никого) авто не Тесла и не знать что в пассате нет датчика, я думаю, непорядок. Загнали еще 20 мин -поправили. Потом еще замена масла — перелили на 2 см выше максимально уровня.
по факту из условных последних 5 обращений 4 заканчивались некими вопросами для меня. Ну на этом решил свое обслуживание тут прекратить.(кроме мойки авто))
Возможно просто невезение) но думаю проблема с кадрами первоочередная. Знаю что найти толковых ребят тяжело в любой сфере, так как сам с этим сталкиваюсь. Вроде даже репортаж был с директором где он про это проблему рассказывал.
Если раньше приезжал к вам за качеством обслуживания авто и сервисом для клиента. То на сегодня только за сервисом смыла ездить не вижу. Все же сервис это второстепенное в сто.
В общем прошу учесть мой негативный опыт в дальнейшем развитии компании.
Мед медицинского класса убивает устойчивые к антибиотикам бактерии in vitro и устраняет колонизацию кожи | Клинические инфекционные болезни
Аннотация
Справочная информация . Устойчивость микробов к антибиотикам срочно требует разработки новых противомикробных средств. С древних времен мед успешно использовался для лечения инфицированных ран из-за его антибактериальной активности. Однако сообщалось о больших вариациях в антибактериальной активности различных видов меда in vitro, что препятствует его применению в современной медицине.
Методы . Мы оценили бактерицидную активность ревамила (Bfactory) in vitro, меда медицинского качества, производимого в контролируемых условиях, и оценили его эффективность в отношении уменьшения колонизации кожи предплечья у здоровых добровольцев в контролируемом исследовании с участием субъектов.
Результаты . Используя Bacillus subtilis в качестве тестового штамма, мы продемонстрировали, что вариация бактерицидной активности 11 партий медицинского меда была <2-кратной.Чувствительные к антибиотикам и устойчивые к антибиотикам изоляты Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae и Klebsiella oxytoca были убиты в пределах 24% -40% (содержание меда на 10% / vol. . После 2 дней применения меда степень колонизации кожи предплечья у здоровых добровольцев уменьшилась в 100 раз (P <0,001), а количество положительных культур кожи уменьшилось на 76% (P <0,001).
Выводы .Ревамил является многообещающим противомикробным средством для местного применения для профилактики или лечения инфекций, в том числе вызванных бактериями с множественной лекарственной устойчивостью.
Устойчивые к антибиотикам бактерии представляют очень серьезную угрозу для здоровья населения [1, 2]. Для всех видов антибиотиков, в том числе основных лекарственных средств «последней инстанции», частота бактериальной резистентности растет во всем мире [1, 2]. Еще более тревожным является то, что разрабатывается очень мало новых антибиотиков, потому что многие крупные фармацевтические компании отказались от разработки антибиотиков [3].Следовательно, срочно необходимы альтернативные противомикробные стратегии.
С давних времен известно, что мед обладает антимикробными свойствами, а также ранозаживляющим действием [4–6]. О микробной устойчивости к меду никогда не сообщалось, что делает его очень многообещающим противомикробным средством для местного применения. Действительно, активность меда in vitro против устойчивых к антибиотикам бактерий [7–9] и сообщения об успешном применении меда при лечении хронических раневых инфекций, не поддающихся лечению антибиотиками [5], привлекли значительное внимание [10–12]. ].
В настоящее время данные о том, что мед является эффективным противомикробным средством, ограничены. Хотя эффективность меда для лечения ожогов и послеоперационных ран была продемонстрирована в рандомизированных контролируемых исследованиях, эти исследования касались небольшого числа пациентов и / или не имели четко определенных конечных точек [13, 14], либо мед использовался в качестве последнего средства. курортное лечение, потому что стандартные методы лечения не помогли [5]. Кроме того, антимикробная активность меда, собранного в естественной среде, сильно варьируется [15, 16], что вызывает озабоченность с точки зрения клинического применения [14].
Мед лечебный «Ревамил» (Бфабрика) производят пчелы в закрытых теплицах. Мы оценили воспроизводимость от партии к партии и бактерицидный спектр этого медицинского меда in vitro и проверили его эффективность в снижении микробной колонизации кожи у здоровых добровольцев.
Материалы и методы
Мед
Во всех экспериментах использовался
Revamil, стандартизированный медицинский мед с маркировкой CE. Концентрация меда выражается в процентах объема меда к общему объему (объем / объем).В исследовании с участием добровольцев использовались градуированные γ-стерилизованные шприцы с медом Ревамил.
Исследования in vitro
Микроорганизмы . Бактерицидная активность меда медицинского качества оценивалась в отношении следующих микроорганизмов: Escherichia coli ML-35 [17], Pseudomonas aeruginosa PAO1 (Американская коллекция типовых культур 15692), клинических изолятов Enterobacter cloacae и Klebsiella oxytoca . , β-лактамаза расширенного спектра (БЛРС) — продуцирующие штаммы всех вышеупомянутых видов, устойчивые к гентамицину E.coli , метициллин-чувствительные и устойчивые штаммы Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus aureus , а также чувствительные к ванкомицину и устойчивые к ванкомицину штаммы Enterococcus faecium.
Чувствительность к оксациллину штаммов S. aureus и S. epidermidis и чувствительность к ванкомицину штаммов E. faecium определяли с помощью Etest (AB Biodisk; Solna) в соответствии с инструкциями производителя.БЛРС были идентифицированы, как описано в другом месте [18].
Анализ микробротонного разведения . Бактерицидную активность меда количественно оценивали с помощью анализа разведения микробов. Бактерии из культур в логарифмической фазе в триптиказо-соевом бульоне (Difco) дважды промывали инкубационным буфером (10 ммоль / л фосфатный буфер [pH 7,0] и 0,03% вес / объем триптиказо-соевый бульон) и разбавляли до 5 × 10 ⁶ КОЕ / мл в этом буфере на основе оптической плотности. Перед каждым экспериментом 50% об. / Об. Раствор меда (густота 1.4 г / мл) в инкубационном буфере был свежеприготовленным. Аликвоты бактериальных суспензий по 20 микролитров смешивали с аликвотами по 80 мкл меда различных концентраций и инкубировали на роторном шейкере при 150 об / мин при 37 ° C. В указанные моменты времени на кровяной агар наносили дубликаты аликвот по 10 мкл неразбавленных и 10-кратно серийно разведенных инкубационных смесей. Чашки инкубировали при 37 ° C и проверяли на рост через 24 часа.
Исследование меда для лечения колонизации кожи у здоровых добровольцев
Дизайн исследования .Мы исследовали способность меда медицинского класса уменьшать микробную колонизацию кожи на предплечьях здоровых добровольцев. Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике исследований Академического медицинского центра Амстердама. В сентябре и октябре 2006 г. для исследования были набраны 42 здоровых взрослых добровольца. Перед включением в исследование от всех добровольцев было получено письменное информированное согласие. Критериями исключения были инфекционные кожные заболевания или другие кожные заболевания, которые можно рассматривать как влияющие на колонизацию.
Образцы двух участков кожи (диаметром 2 см) на левом предплечье брали ватными тампонами, смоченными 0,9% NaCl (физиологический раствор). На 1 из этих пластырей наносили 0,5 мл меда, покрывая площадь ∼2 см в диаметре. На покрытые медом и контрольные участки кожи накладывали прозрачную полиуретановую повязку (Tegaderm; 3M Health Care). Через 2 дня мед собирали, используя сухие ватные палочки, и образцы кожи отбирали, используя увлажненные ватные палочки. Колонизацию кожи определяли как присутствие в собранном меде и мазке с кожи в общей сложности> 5 КОЕ.
Идентификация бактериальной микрофлоры кожи . Идентификацию бактериальных изолятов из обработанных медом участков кожи проводили с использованием секвенирования гена 16S рРНК. Одиночные колонии суспендировали в 100 мкл деминерализованной воды, суспензию кипятили в течение 10 минут и центрифугировали при 20 000 g в течение 3 минут. Пять микролитров супернатанта служили матрицей для ПЦР-амплификации ∼900 п.н. гена рРНК с использованием праймеров P515F и P13B [19] в течение 25 циклов при 95 ° C в течение 1 мин, 62 ° C в течение 1 мин и 72 ° C в течение 2 минут, с последним продлением на 10 минут при 72 ° C.Продукты ПЦР секвенировали с праймерами P515F и P13B с использованием набора для циклического секвенирования ABI Prism Big Dye Terminator, версия 2.0 (Applied Biosystems), и перекрывающиеся последовательности из обеих цепей выравнивали и проверяли с помощью программного пакета CodonCode 1.5.2 ( CodonCode Corporation). База данных рибосом Project II Центра микробной экологии [20] использовалась для идентификации бактерий на уровне рода. Тест пробирки коагулазы использовался для различения S.aureus и коагулазонегативные стафилококки.
Статистика . Процент положительных посевов мазков с кожи обработанных медом и контрольных участков кожи в исследовании с участием добровольцев был проанализирован с помощью теста Макнемара для сопоставленных исследований случай-контроль. Для исследования значимости различий в количестве КОЕ (GraphPad Prism, версия 4.03) был проведен одномерный анализ с помощью парного критерия суммы рангов Вилкоксона [21].
Результаты
Воспроизводимость бактерицидной активности меда от партии к партии .Мы сравнили активность 11 партий медицинского меда Revamil в тесте на микроразведение с Bacillus subtilis в качестве целевого микроорганизма. Бактерицидная активность во всех партиях различалась менее чем в 2 раза (рисунок 1).
Рисунок 1
Бактерицидная активность 11 партий медицинского меда Revamil против Bacillus subtilis. B. subtilis инкубировали в течение 2 часов в меде 0–40% об. / Об. С шагом 5%. Самые высокие разведения меда, вызывающие 1000-кратное снижение количества КОЕ, указаны как средние значения для независимых трехкратных инкубаций.Планки погрешностей представляют собой SEM.
Рисунок 1
Бактерицидная активность 11 партий медицинского меда Revamil против Bacillus subtilis. B. subtilis инкубировали в течение 2 часов в меде 0–40% об. / Об. С шагом 5%. Самые высокие разведения меда, вызывающие 1000-кратное снижение количества КОЕ, указаны как средние значения для независимых трехкратных инкубаций. Планки погрешностей представляют собой SEM.
Активность меда против грамположительных бактерий .Чувствительные к антибиотикам и устойчивые к антибиотикам штаммы S. aureus, S. epidermidis и E. faecium подвергались воздействию разбавленного меда (рис. 2). Метициллин-чувствительные и резистентные изолятов S. aureus были одинаково чувствительны к меду (рис. 2). При 40% об. / Об. Мед полностью уничтожил инокулят всех протестированных изолятов, а 20% об. / Об. Мед обладал сильной бактерицидной активностью против всех метициллин-устойчивых изолятов S. aureus и 2 из 3 метициллин-чувствительных S.aureus (рисунок 2).
Рисунок 2
Чувствительность грамположительных бактерий к меду. Чувствительный к метициллину Staphylococcus aureus (MSSA), устойчивый к метициллину S. aureus (MRSA), чувствительный к метициллину Staphylococcus epidermidis (MSSE), устойчивый к метициллину S. Enterococcus faecium (VSEF) и устойчивый к ванкомицину E.faecium (VREF) подвергали воздействию меда в указанных концентрациях в течение 24 часов, после чего выживание определяли количественно в КОЕ / мл.
Рисунок 2
Чувствительность грамположительных бактерий к меду. Чувствительный к метициллину Staphylococcus aureus (MSSA), устойчивый к метициллину S. aureus (MRSA), чувствительный к метициллину Staphylococcus epidermidis (MSSE), устойчивый к метициллину S. Enterococcus faecium (VSEF) и устойчивый к ванкомицину E.faecium (VREF) подвергали воздействию меда в указанных концентрациях в течение 24 часов, после чего выживание определяли количественно в КОЕ / мл.
S. epidermidis оказался еще более восприимчивым; все протестированные изоляты были полностью уничтожены медом с концентрацией 10% об. / об. Что касается изолятов S. aureus , не было заметных различий в чувствительности между чувствительными к метициллину и устойчивыми к метициллину изолятами S. epidermidis (рисунок 2). Для E. faecium инкубация в меде с 30% об. / Об. Привела к заметному снижению количества КОЕ для всех протестированных изолятов, включая изоляты, чувствительные к антибиотикам, и изоляты, устойчивые к антибиотикам (рис. 2).
Активность меда против грамотрицательных бактерий . Почти все протестированные грамотрицательные бактерии, включая штаммы, продуцирующие БЛРС, были уничтожены через 24 часа инкубации в 20% об. / Об. Меде (рис. 3). Только для чувствительных к антибиотикам изолятов E. cloacae и устойчивых к антибиотикам K. oxytoca (продуцирующих БЛРС) для уничтожения всего инокулята требовалось не менее 30% об. / Об. Меда (рис. 3).
Рисунок 3
Чувствительность различных грамотрицательных бактерий к меду.Чувствительные к антибиотикам изоляты (A) и β-лактамазы расширенного спектра — продуцирующие изоляты (B) из Escherichia coli (квадраты), Pseudomonas aeruginosa (треугольники, направленные вверх), Enterobacter cloacae (ромбы), Klebsiella oxytoca направленные вниз треугольники) и устойчивые к гентамицину E. coli (кружки) подвергались воздействию меда в указанных концентрациях в течение 24 часов, после чего выживание определяли количественно в КОЕ / мл.
Рисунок 3
Чувствительность различных грамотрицательных бактерий к меду.Чувствительные к антибиотикам изоляты (A) и β-лактамазы расширенного спектра — продуцирующие изоляты (B) из Escherichia coli (квадраты), Pseudomonas aeruginosa (треугольники, направленные вверх), Enterobacter cloacae (ромбы), Klebsiella oxytoca направленные вниз треугольники) и устойчивые к гентамицину E. coli (кружки) подвергались воздействию меда в указанных концентрациях в течение 24 часов, после чего выживание определяли количественно в КОЕ / мл.
Уменьшение колонизации кожи предплечья за счет применения меда .Чтобы определить потенциал меда для местного применения in vivo, мы количественно определили способность меда снижать микробную колонизацию кожи предплечий здоровых добровольцев. Через 48 часов после нанесения меда средний уровень колонизации кожи снизился в 100 раз по сравнению с контрольной инкубацией со 110 КОЕ / мазок в контрольной группе до 1 КОЕ / мазок в группе, обработанной медом (P <. 001) (рисунок 4A). Процент положительных культур кожи, определенных как культуры с> 5 КОЕ, снизился с 79% в контрольной группе до 19% в группе, обработанной медом (P <.001) (рисунок 4A). В группе, получавшей мед, медиана колонизации снизилась с 26,5 КОЕ до 1 КОЕ (P <0,001) через 48 часов после нанесения, тогда как в контрольной группе медиана увеличилась с 21,5 КОЕ до 110 КОЕ (P <0,001). ) после аналогичного инкубационного периода (рисунок 4A). Наблюдались большие различия в исходной колонизации кожи среди субъектов, в пределах от 0 до> 1000 КОЕ / мазок, но колонизация контрольных и обработанных медом участков кожи на одной и той же руке была сходной для большинства субъектов в начале эксперимента ( рисунок 4B, левая панель).Через 48 часов после нанесения (рис. 4В, правая панель) 39 из 42 обработанных медом пластырей показали меньшую колонизацию, чем соответствующие необработанные контрольные пластыри на той же руке. После обработки медом колонизация кожи уменьшилась на 38 из 42 участков по сравнению с колонизацией до лечения (рисунок 4C, правая панель), тогда как для контрольных участков кожи увеличенная колонизация наблюдалась на 30 из 42 участков через 48 часов после нанесения повязка (рисунок 4C, левая панель).
Рисунок 4
Эффективность меда в уменьшении колонизации кожи предплечья. A , Количество образцов с положительной культурой и количество КОЕ, культивируемых из контрольных и обработанных медом участков кожи. Аликвоту 0,5 мл меда наносили на 1 участок кожи предплечья, а второй участок на той же руке служил контролем без лечения. Оба пластыря были покрыты полиуретановой повязкой. До и после 2 дней применения были взяты образцы кожных пятен для количественной оценки уровня микробной колонизации кожи. B , Колонизация контрольных и обработанных медом участков кожи на одной и той же руке отдельных субъектов в начале эксперимента (левая панель) и через 48 часов (правая панель).C , Колонизация отдельных участков кожи в начале эксперимента и через 48 ч для контрольных участков (левая панель) и обработанных медом участков (правая панель). Процент положительных посевов мазков с кожи обработанных медом и контрольных участков кожи был проанализирован с помощью теста Макнемара для сопоставленных исследований случай-контроль, а для исследования статистической значимости различий был проведен одномерный анализ с помощью парного критерия суммы рангов Вилкоксона. в количестве КОЕ.
Рисунок 4
Эффективность меда в уменьшении колонизации кожи предплечья. A , Количество образцов с положительной культурой и количество КОЕ, культивируемых из контрольных и обработанных медом участков кожи. Аликвоту 0,5 мл меда наносили на 1 участок кожи предплечья, а второй участок на той же руке служил контролем без лечения. Оба пластыря были покрыты полиуретановой повязкой. До и после 2 дней применения были взяты образцы кожных пятен для количественной оценки уровня микробной колонизации кожи. B , Колонизация контрольных и обработанных медом участков кожи на одной и той же руке отдельных субъектов в начале эксперимента (левая панель) и через 48 часов (правая панель). C , Колонизация отдельных участков кожи в начале эксперимента и через 48 ч для контрольных участков (левая панель) и обработанных медом участков (правая панель). Процент положительных посевов мазков с кожи обработанных медом и контрольных участков кожи был проанализирован с помощью теста Макнемара для сопоставленных исследований случай-контроль, а для исследования статистической значимости различий был проведен одномерный анализ с помощью парного критерия суммы рангов Вилкоксона. в количестве КОЕ.
Для каждого субъекта были изолированы и охарактеризованы все фенотипически отличные бактерии, которые выжили на обработанных медом участках кожи. Из 18 изолятов 14 (78%) были идентифицированы как коагулазонегативные стафилококки, и видов Bacillus, Micrococcus, Brevundimonas и Corynebacterium были идентифицированы один раз. При оценке их восприимчивости к меду in vitro инокуляты всех этих изолятов были убиты медом ≤30% об. / Об. Через 24 часа инкубации, что демонстрирует, что эти бактерии не были изначально устойчивы к меду.
Обсуждение
Мы демонстрируем, что мед медицинского качества Revamil обладал воспроизводимой бактерицидной активностью in vitro и был одинаково активен против устойчивых и чувствительных к антибиотикам изолятов для всех протестированных видов. Применение Revamil в течение 2 дней на коже предплечья здоровых добровольцев было высокоэффективным в плане снижения как частоты положительных культур кожи, так и количества культивированных КОЕ (оба P <0,001 для сравнения с контролями).
Мед имеет несколько хорошо известных свойств, ответственных за его антимикробную активность.К ним относятся высокая осмолярность из-за высокой концентрации сахаров (~ 80% мас. / Об.) [22], низкий pH (3,2–4,5 для неразбавленного меда) и выработка перекиси водорода, которая после разбавления меда продуцируется глюкозооксидазой пчел [6, 23]. Кроме того, в активность вносят вклад неизвестные цветочные или пчелиные компоненты [24, 25]. К сожалению, существует большая разница в антимикробной активности меда, собранного из разных сред [13, 16], возможно, связанная с пространственными и временными вариациями в источниках нектара [15].Даже мед, собранный в одном месте, может иметь значительные различия в антибактериальной активности от партии к партии [15]. Непредсказуемая антибактериальная активность таких нестандартных препаратов меда затрудняет его внедрение в качестве противомикробного средства.
Revamil производится в теплицах в стандартных условиях. При <2-кратном изменении активности для 11 различных партий этот мед показал хорошую воспроизводимость активности от партии к партии, что является важным критерием для клинического применения.
Поскольку многие инфекции становятся все более и более сложными для лечения из-за повышенной устойчивости патогенов к антибиотикам [26–28], необходимы новые противомикробные препараты. Ревамил обладал сильной бактерицидной активностью in vitro в отношении устойчивых к антибиотикам грамположительных и грамотрицательных бактерий. Инокуляты всех протестированных штаммов S. epidermidis были полностью уничтожены через 24 часа инкубации в 20% об. / Об. Меда, а 40% об. / Об. Меда убили все протестированных штаммов S. aureus и E. faecium .Чувствительные к антибиотикам и устойчивые к антибиотикам штаммы всех протестированных грамотрицательных бактерий были уничтожены медом с концентрацией 20–30% об. / Об. Следовательно, мед медицинского качества может использоваться для местной антибактериальной профилактики или для лечения местных инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам бактериями.
Насколько нам известно, наше исследование является первым в контролируемом исследовании, в котором количественно оценивается эффективность меда в уменьшении микробной колонизации кожи. К сожалению, оценить мед вслепую очень сложно, потому что не существует подходящего контрольного вещества, напоминающего мед.Поэтому мы провели открытое исследование с участием субъектов, чтобы оценить эффективность меда в уменьшении колонизации кожи по сравнению с контролем без лечения. Среднее количество КОЕ, культивируемых с кожи, уменьшилось в 100 раз после нанесения меда в течение 2 дней, и 81% обработанных медом участков кожи дали отрицательные результаты культивирования по сравнению с 21% для контрольных участков. У 3 субъектов мед оказался неэффективным, но мы показали, что бактерии, выделенные у этих субъектов, были восприимчивы к меду in vitro.Возможно, изолированные бактерии вышли из более глубоких участков кожи во время отбора проб и не были затронуты медом, нанесенным на поверхность кожи.
Двумя основными показаниями к применению меда могут быть лечение раневых инфекций и местная профилактика в местах, где микроорганизмы могут вызвать инфекцию, таких как места введения катетера [29]. В небольших рандомизированных контролируемых исследованиях сообщалось об эффективности меда в сокращении времени, необходимого для заживления, и в сокращении времени до отрицательных результатов посева при ожоговых ранах [30–34] и послеоперационных раневых инфекциях [35].Другое сравнительно небольшое исследование показало, что при использовании туннельных катетеров для гемодиализа с манжетами после применения меда наблюдался сравнительно безбактериальный период по сравнению с периодом после лечения мупироцином [36]. Это указывает на то, что мед может быть ценной альтернативой мупироцину, но необходимы более крупные рандомизированные испытания с использованием четко определенного меда для оценки эффективности меда как противомикробного агента.
Таким образом, мы показали, что медицинский мед Revamil обладает воспроизводимой от партии к партии бактерицидной активностью широкого спектра и является хорошим дезинфицирующим средством для кожи человека.Таким образом, этот мед имеет отличный потенциал в качестве противоинфекционного средства для местной профилактики или для местного лечения кожных инфекций, вызванных чувствительными к антибиотикам или устойчивыми к ним бактериями.
Благодарности
Финансовая поддержка . P.H.S.K. был поддержан грантом SENTER (TSGE2055) Министерства экономики Нидерландов, который был предоставлен Bfactory, производителю Revamil.
Возможный конфликт интересов .Все авторы: без конфликтов.
Список литературы
1.,
Парадокс антибиотиков: как неправильное употребление антибиотиков разрушает их лечебные свойства. Кембридж: Perseus Publishing
,
2002
2,.
Устойчивость к антибактериальным препаратам во всем мире: причины, проблемы и ответные меры
,
Nat Med
,
2004
, vol.
10
(стр.
122
—
9
) 3.
Почему большая фармацевтика отказывается от открытия антибактериальных препаратов?
,
Curr Opin Microbiol
,
2003
, т.
6
(стр.
427
—
30
) 4,,.
Традиционные подходы к заживлению ран
,
Clin Dermatol
,
1999
, vol.
17
(стр.
93
—
8
) 5.
Клинические наблюдения за ранозаживляющими свойствами меда
,
Br J Surg
,
1988
, vol.
75
(стр.
679
—
81
) 6.
Антибактериальная активность меда. 1. Природа антибактериальной активности
,
Bee World
,
1992
, vol.
73
(стр.
5
—
28
) 7,,.
Чувствительность полирезистентных штаммов Burkholderia cepacia к меду
,
Lett Appl Microbiol
,
2000
, vol.
31
(стр.
20
—
4
) 8,,.
Эффективность меда в подавлении штаммов Pseudomonas aeruginosa от инфицированных ожогов
,
J Burn Care Rehabil
,
2002
, vol.
23
(стр.
366
—
70
) 9,,.
Чувствительность к меду грамположительных кокков, имеющих клиническое значение, выделенных из ран
,
J Appl Microbiol
,
2002
, vol.
93
(стр.
857
—
63
) 10.
Сладкое решение для инфекций супербактерий?
,
Lancet Infect Dis
,
2003
, т.
3
стр.
608
11.
Бактерии не могут сопротивляться меду
,
Lancet Infect Dis
,
2003
, vol.
3
стр.
116
12,,.
Мед: сильнодействующее средство для заживления ран?
,
J Round Ostomy Continence Nurs
,
2002
, vol.
29
(стр.
295
—
300
) 13,.
Клиническое использование меда в качестве повязки на рану: обновление
,
J Wound Care
,
2004
, vol.
13
(стр.
353
—
6
) 14,,,,,.
Систематический обзор использования меда в качестве перевязочного материала
,
BMC Complement Altern Med
,
2001
, vol.
1
стр.
2
15.
Антибактериальная активность меда. 2. Вариация силы антибактериальной активности
,
Bee World
,
1992
, vol.
73
(стр.
59
—
76
) 16,,.
Обзор антибактериальной активности некоторых новозеландских медов
,
J Pharm Pharmacol
,
1991
, vol.
43
(стр.
817
—
22
) 17,,,,,.
Взаимодействие дефенсинов человека с Escherichia coli: механизм бактерицидной активности
,
J Clin Invest
,
1989
, vol.
84
(стр.
553
—
61
) 18,,, et al.
Широко распространенный перенос генов устойчивости между видами бактерий в отделении интенсивной терапии: значение для эпидемиологии больниц
,
J Clin Microbiol
,
2005
, vol.
43
(стр.
4862
—
4
) 19,,,.
Идентификация некультивируемой палочки болезни Уиппла
,
N Engl J Med
,
1992
, vol.
327
(стр.
293
—
301
) 20
Проект базы данных рибосом II: классификатор — начало
21
Программное обеспечение GraphPad
,
QuickCalcs: онлайн-калькуляторы для ученых
22,,.
Научное обоснование использования сахарного песка для лечения инфицированных ран
,
Ланцет
,
1982
, т.
1
(стр.
560
—
1
) 23,.
Исследования медового ингибина. 2. Химический анализ
,
J Apic Res
,
1963
, vol.
2
(стр.
93
—
100
) 24.
Природа и происхождение антибактериальных веществ в меде
,
Lebensm Wiss Technol
,
1997
, vol.
30
(стр.
748
—
53
) 25,,.
Сравнение чувствительности видов бактерий, поражающих раны, к антибактериальной активности меда манука и другого меда
,
J Appl Bacteriol
,
1992
, vol.
73
(стр.
388
—
94
) 26,,.
Обновление информации о инфекциях Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii в медицинских учреждениях
,
Curr Opin Infect Dis
,
2005
, vol.
18
(стр.
306
—
13
) 27.
Проблема VISA / GISA: терапевтическое значение
,
Clin Microbiol Infect
,
2001
, vol.
7
Дополнение 4
(стр.
8
—
15
) 28.
MRSA — верхушка айсберга
,
Clin Microbiol Infect
,
2006
, vol.
12
Suppl 2
(стр.
3
—
10
) 29,,.
Обзор факторов риска катетерной инфекции кровотока, вызванной чрескожно введенными центральными венозными катетерами без манжетов: значение для профилактических стратегий
,
Medicine (Baltimore)
,
2002
, vol.
81
(стр.
466
—
79
) 30.
Местное применение меда при лечении ожогов
,
Br J Surg
,
1991
, vol.
78
(стр.
497
—
8
) 31.
Медовая заправка против кожуры вареного картофеля при лечении ожогов: проспективное рандомизированное исследование
,
Burns
,
1996
, vol.
22
(стр.
491
—
3
) 32.
Проспективное рандомизированное клинико-гистологическое исследование заживления поверхностных ожоговых ран медом и сульфадиазином серебра
,
Burns
,
1998
, vol.
24
(стр.
157
—
61
) 33.
Марля, пропитанная медом, в сравнении с полиуретановой пленкой (OpSite) при лечении ожогов — проспективное рандомизированное исследование
,
Br J Plast Surg
,
1993
, vol.
46
(стр.
322
—
3
) 34.
Марля, пропитанная медом, в сравнении с амниотической мембраной при лечении ожогов
,
Ожоги
,
1994
, vol.
20
(стр.
331
—
3
) 35,.
Влияние местного меда на послеоперационные раневые инфекции, вызванные грамположительными и грамотрицательными бактериями после кесарева сечения и гистерэктомии
,
Eur J Med Res
,
1999
, vol.
4
(стр.
126
—
30
) 36« и др.
Рандомизированное контролируемое испытание местного применения меда в месте выхода (Medihoney) по сравнению с мупироцином для профилактики катетер-ассоциированных инфекций у гемодиализных пациентов
,
J Am Soc Nephrol
,
2005
, vol.
16
(стр.
1456
—
62
)
© 2008 Американского общества инфекционистов
Активность меда манука и полигексаметиленбигуанида in vitro на мицелиальных грибах и токсичность для линий клеток человека | Медицинская микология
Аннотация
Инвазивные грибковые инфекции мягких тканей все чаще рассматриваются как важные факторы, непосредственно влияющие на заболеваемость и смертность.Они усложняют клиническое лечение, требуя агрессивной хирургической обработки раны и системной противогрибковой терапии. Чтобы оценить новые актуальные подходы к терапии, мы исследовали противогрибковую активность и цитотоксичность меда манука (MH) и полигексаметиленбигуанида (PHMB). Активность множественных концентраций MH (40%, 60%, 80%) и PHMB (0,01%, 0,04%, 0,1%) против 13 клинических изолятов плесени оценивали с использованием метода «time-kill» между 5 мин и 24 часами. Концентрации были выбраны для представления текущего клинического использования.Жизнеспособность клеток исследовали параллельно для эпидермальных кератиноцитов человека, дермальных фибробластов и остеобластов, что позволило определить концентрацию 50% жизнеспособности (LD50). Противогрибковая активность обоих агентов больше коррелировала со временем воздействия, чем с концентрацией. Exophiala и Рост Fusarium был полностью подавлен через 5 минут для всех концентраций PHMB и через 12 и 6 часов, соответственно, для всех концентраций MH. Только Lichtheimia показало устойчивый рост к обоим агентам через 24 часа.Анализы жизнеспособности показали зависящую от концентрации и времени токсичность для PHMB. Для MH время воздействия предсказывало цитотоксичность только тогда, когда все типы клеток анализировались в совокупности. Это исследование демонстрирует, что MH и PHMB обладают в основном зависящей от времени противогрибковой активностью, но также оказывают токсичность in vitro на клетки человека, что может ограничивать клиническое использование. Необходимы дальнейшие исследования для определения идеальных стратегий лечения для оптимизации противогрибковой активности против плесени при одновременном ограничении цитотоксичности в отношении тканей хозяина in vivo .
Введение
Инвазивные грибковые инфекции мягких тканей (ИФИ), возникающие после боевых ран у пациентов с подавленным иммунитетом и как последствия стихийных бедствий, все чаще признаются серьезными осложнениями, напрямую влияющими на заболеваемость и смертность. ^1–5 Смертность инфекций, связанных с видами Mucorales, Aspergillus и Fusarium , достигает 25–38%.⁶ Хотя основным методом лечения остается агрессивная хирургическая обработка раны, это не всегда возможно из-за того, что это происходит в отдаленных районах, во время стихийного бедствия, когда инфраструктура разрушена, или когда квалифицированный хирург недоступен немедленно. Кроме того, для достижения хирургического контроля над инфекцией может потребоваться ампутация конечностей с весьма болезненными последствиями. Системные противогрибковые препараты используются дополнительно, чтобы ограничить распространение инфекции, хотя клинические данные, подтверждающие их эффективность при таких нечастых инфекциях, отсутствуют.Системные противогрибковые препараты также обладают значительной потенциальной токсичностью и лекарственными взаимодействиями, которые ограничивают их использование. ⁷ Недавние сообщения об ИФИ мягких тканей и признание терапевтических ограничений системных противогрибковых агентов побудили нас исследовать местные терапевтические агенты, которые можно безопасно наносить на открытые раны. Предыдущие исследования, посвященные этому подходу, показали потенциальную противогрибковую активность, но с некоторыми доказательствами цитотоксичности. ^8,9 Местные противогрибковые препараты, которые являются безопасными и эффективными, могут быть полезным дополнением к системным противогрибковым средствам и хирургическим вмешательствам для дальнейшего снижения заболеваемости и смертности от этих инфекций.
Мед использовался для лечения ран на протяжении веков, но потерял популярность после появления типичных противомикробных препаратов. ^10,11 В последние годы развитие широкой устойчивости к противомикробным препаратам привело к возобновлению исследований альтернативных потенциальных методов лечения, включая переоценку применения меда. ^12,13 Предлагаемые механизмы действия, которые до конца не изучены, включают осмотический эффект, содержание перекиси водорода, кислотность и потенциальный иммуномодулирующий эффект.^14–21 Мед обладает антибактериальными свойствами против устойчивых к антибиотикам бактерий, а также некоторых грибов, включая Candida spp. и Aspergillus spp. ^{12,13,22–34} Потенциальные проблемы при местном применении меда на ранах включают внесение спор или бактериальных загрязнителей, а также стандартизацию антибактериальной активности в каждой партии. ^{22,26,35–37} Чтобы смягчить эти опасения, коммерческий рынок произвел стандартизированный, одобренный FDA состав меда (известный как Manuka Honey [MH]), стерилизованный гамма-излучением, который был включен в различные коммерческие доступные раневые повязки.
Полигексаметиленбигуанид (ПГМБ) представляет собой композитную смесь катионных полиаминов, обычно используемых в растворах антисептиков для контактных линз, косметических консервантах и дезинфицирующих средствах для бассейнов с 1950-х годов. Бигуаниды, такие как PHMB, проникают в мембраны бактериальных клеток и увеличивают проницаемость клеток, что в конечном итоге приводит к потере функции мембраны и гибели клеток. ³⁸ Исследования in vitro продемонстрировали активность PHMB против Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Fusarium solani, Acanthamoeba sp., Listeria monocytogenes, Aspergillus flavus, Pseudomonas aeruginosa и Proteus vulgaris . ^39–45 PHMB клинически использовался для лечения амебного кератита. ⁴⁶ Против нитчатых грибов PHMB ранее тестировался только на штаммах, полученных от глазных инфекций и домашних животных. ^47–53 Помимо использования в косметике и продуктах для глаз, в настоящее время на рынке продается несколько одобренных FDA продуктов для очищения ран, в которых в качестве основного активного ингредиента используется PHMB.Учитывая тяжелую заболеваемость, связанную с ИФИ мягких тканей, последствия и ограничения доступных в настоящее время традиционных методов лечения, а также наличие нескольких одобренных FDA соединений для местного применения, мы исследовали противогрибковую активность PHMB и MH в отношении группы плесени, выделенной из клинических мягких тканей. тканевые инвазивные грибковые инфекции, возникающие в нашем учреждении. Кроме того, мы провели тестирование цитотоксичности in vitro против типов клеток человека, представляющих тяжелые глубокие раны (т.е., травматическая ампутация), чтобы оценить потенциальную пригодность этих соединений для использования при открытых ранах.
Материалы и методы
Тринадцать клинических изолятов плесени из репозитория молекулярной эпидемиологии инфекционных заболеваний Военного медицинского центра Сан-Антонио (SAMMC) были выбраны для использования в этом исследовании. ^8,54 Все клинические изоляты были собраны у пациентов в ходе лечения. Отдельные штаммы были идентифицированы с помощью морфологии плесени, фенотипических характеристик и анализа последовательности ДНК в соответствии с опубликованными руководствами по морфологии и оптимальной лабораторной практикой, основанной на опыте, в Лаборатории тестирования грибков Центра медицинских наук Университета Техаса, Сан-Антонио, Техас, США.^55–57 После идентификации они хранились в хранилище штаммов для будущих исследований. Все изоляты плесени отдельно хранили при -80 ° C в триптическом соевом бульоне с 15% глицерина. Изоляты плесени включали один Lichtheimia sp., Три Aspergillus flavus , один Aspergillus fumigatus , один Aspergillus terreus , два Mucor circinelloides , один Fusarium sp. Apophysomyces sp.и два Actinomucor elegans.
Анализ временного уничтожения грибков
Анализ «time-kill» проводили для определения противогрибковой активности MH (Links Medical Products, Inc, Ирвин, Калифорния) и PHMB (BOC Sciences, Creative Dynamics Inc., Ширли, Нью-Йорк). ^8,54 Были протестированы три различные концентрации MH (40%, 60%, 80%) и PHMB (0,01%, 0,04%, 0,1%) вместе с водой в качестве контроля. Концентрации MH были выбраны на основе предыдущих исследований, подтверждающих минимальные ингибирующие концентрации меда, а также цитотоксичность.^7,24
Концентрации PHMB были выбраны для представления клинически доступных продуктов для орошения и очищения ран или их десятикратного разведения (0,01%), представляющего нижнюю границу, с которой сравнивается потенциальная токсичность. Изоляты плесени выращивали на скошенных картофельных агарах (Remel, Lenexa, KS) при 35 ° C в течение 7-10 дней. Стандартные суспензии конидий / гиф 5 × 10 ⁴ КОЕ / мл были приготовлены в соответствии с руководящими принципами ⁵⁴ Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), и аликвоты суспензий подвергались воздействию различных растворов и разведений для местного применения в течение 24 часов.В разные моменты времени (0, 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 час, 1,5 часа, 3 часа, 6 часов, 12 часов и 24 часа) аликвоты 100-кратных разведений высевали на чашки с картофельными хлопьями и агаром. Предварительно определенные временные интервалы были выбраны на основе рекомендаций по использованию коммерчески доступных медовых продуктов медицинского качества. Планшеты инкубировали при 35 ° C и подсчет колоний определяли после инкубации в течение 24 часов или, при необходимости, для медленно растущих плесневых грибов (2–3 дня до появления счетных колоний). Анализ проводили в двух экземплярах.
Анализ клеточной токсичности
Кожные кератиноциты человека (HEK-001; ATCC CRL 2404; American Tissue Type Collection, Manassas, VA) выращивали в бессывороточной среде для кератиноцитов (GIBCO, Grand Island, NY) с 5 нг / мл человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста и 2 мМ L-глутамин. Дермальные фибробласты и остеобласты человека (PromoCell, Гейдельберг, Германия) выращивали в среде Игла, модифицированной по Дульбекко, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 Ед / мл пенициллина и 10 мкг / мл стрептомицина.Все клеточные линии выращивали и поддерживали при 37 ° C в 5% диоксиде углерода. Токсичность MH и PHMB для различных клеточных линий оценивали путем проведения анализов жизнеспособности клеток, как описано ранее. ^8,54 Вкратце, конфлюэнтные монослои клеток, засеянные в 96-луночные планшеты, подвергали воздействию тех же концентраций, которые использовались для анализов времени уничтожения, в течение 5 мин, 15 мин, 30 мин, 1 ч, 1,5 ч, 3 ч, 6 ч и 24 ч. После воздействия клетки промывали и ресуспендировали в забуференном фосфатом физиологическом растворе, pH 7.4 (PBS, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Жизнеспособность клеток после воздействия оценивали с помощью анализа CellTiter Fluor (Promega, Madison, WI) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве отрицательного контроля использовали стерильный PBS. Жизнеспособность клеток выражалась в процентах по сравнению с контрольной группой. Эксперименты проводили в трех повторностях.
Статистические методы
Чтобы определить, является ли токсичность для клеток человека или грибов наилучшим образом предсказанной по времени или концентрации, была проведена множественная линейная регрессия с использованием обобщенной линейной модели для согласования данных о времени, концентрации и жизнеспособности с экспоненциальным распределением с использованием функции обратной связи.Из полученной модели было определено время до 50% жизнеспособности (т.е. LD50). Были определены медианы и 25–75% межквартильный размах (IQR). JMP версии 9.0.0 (SAS Institute Inc., Кэри, Северная Каролина) использовался для всех статистических расчетов, а графики медианного IQR были построены с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния), версия 5.01.
Результаты
Тест на время уничтожения грибков
Результаты анализа на время уничтожения различались в зависимости от грибкового изолята, времени воздействия и местной концентрации.Визуальный осмотр тестов на время уничтожения (рис. 1, 2) продемонстрировал преимущественно зависящую от времени противогрибковую активность обоих агентов. Большинство протестированных изолятов показали снижение КОЕ после 3-часовой временной точки. Только Exophiala sp. и изолятов Fusarium oxysporum показали значительное снижение КОЕ до 3-часовой временной точки. В этих последних изолятах все концентрации PHMB были способны полностью подавить рост КОЕ к 5-минутной временной точке.Подобное снижение КОЕ за счет MH не наблюдалось до 3-часовой и 6-часовой временной точки для Fusarium oxysporum и Exophiala sp. соответственно. Apophysomyces показал только 2-логарифмическое сокращение для обоих агентов, за исключением 60% MH, для которого наблюдалось 5-логарифмическое снижение. В этом случае КОЕ существенно не уменьшились до последней 24-часовой временной точки. Мы наблюдали значительные различия в противогрибковой активности местных агентов, протестированных в этом исследовании.Изоляты Aspergillus показали большую чувствительность к MH, чем PHMB. Изоляты 2 и 3 A. flavus показали снижение ≥ 3-log при воздействии 60% и 80% MH. Изолят 1 A. flavus и A. terreus показали снижение ≥ 3 log при воздействии 80% MH. Для всех изолятов A. flavus и A. terreus 40% MH были сопоставимы с PHMB с уменьшением менее чем на 1 log за 24 часа. Напротив, изолят 2 Mucor circinelloides оказался более чувствительным к PHMB через 24 часа, но относительно устойчив к MH.Все концентрации MH приводили к 2-логарифмическому снижению в 24-часовой временной точке, тогда как все концентрации PHMB демонстрировали противогрибковую активность уже через 6 часов. M. circinelloides был полностью подавлен через 24 часа при всех концентрациях PHMB, тогда как MH смог достичь 1-логарифмического снижения против этой плесени только через 24 часа. Концентрация местных средств была особенно важна в отношении двух изолятов Actinomucor elegans . Для обоих изолятов воздействие каждого местного агента приводило к снижению роста на 4 логарифма.Однако более низкие концентрации PHMB были особенно активны против изолятов. Изолят 2 A. elegans был снижен на 5-логарифмические единицы через 3 часа на 0,01% и 0,04% концентрации PHMB. Парадоксально, но только 1-логарифмическое снижение наблюдалось с 0,1% PHMB, и никакого снижения не наблюдалось через 3 часа для любой концентрации MH. MH действительно проявлял фунгицидную активность через 12 часов для концентраций 80% и через 24 часа для концентраций 40% и 60%. Lichtheimia оказался наименее чувствительным из грибковых изолятов к PHMB и MH, демонстрируя устойчивый рост без единого логарифмического снижения в течение 24-часового воздействия.
Рисунок 1.
Кривые «время-убить» для грибковых клинических изолятов после воздействия полигексаметиленбигуанида (0,01%, 0,04% и 0,1%) от 5 минут до 24 часов. Сообщаемые значения представляют собой среднее значение двух независимых анализов и представлены как логарифм снижения групп обработки по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся лечению, водой. Круги: 0,01% PHMB; квадраты 0,04% PHMB; треугольники 0,1% PHMB.
Рисунок 1.
Кривые времени уничтожения для грибковых клинических изолятов после воздействия полигексаметиленбигуанида (0.01%, 0,04% и 0,1%) от 5 минут до 24 часов. Сообщаемые значения представляют собой среднее значение двух независимых анализов и представлены как логарифм снижения групп обработки по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся лечению, водой. Круги: 0,01% PHMB; квадраты 0,04% PHMB; треугольники 0,1% PHMB.
Рисунок 2.
Кривые «время-убить» для грибковых клинических изолятов после воздействия меда манука (40%, 60% и 80%) от 5 минут до 24 часов. Сообщаемые значения представляют собой среднее значение двух независимых анализов и представлены как логарифм снижения групп обработки по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся лечению, водой.Круги: 40% MH; квадраты 60% MH; треугольники 80% MH.
Рис. 2.
Кривые времени уничтожения для грибковых клинических изолятов после воздействия меда Манука (40%, 60% и 80%) от 5 минут до 24 часов. Сообщаемые значения представляют собой среднее значение двух независимых анализов и представлены как логарифм снижения групп обработки по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся лечению, водой. Круги: 40% MH; квадраты 60% MH; треугольники 80% MH.
Анализ клеточной токсичности
Для MH анализы жизнеспособности не продемонстрировали статистически значимой зависимости от концентрации или времени воздействия, когда клеточные линии считались монотипичными (например,г., только кератиноциты). Однако, когда клеточные линии рассматривались в совокупности, время оказалось статистически значимым предиктором токсичности в многофакторном анализе (рис. 3). Что касается PHMB, анализы жизнеспособности клеточных линий, рассматриваемых по отдельности и в совокупности, продемонстрировали как зависящую от концентрации, так и зависящую от времени цитотоксичность. Исключением были фибробласты, для которых только время было статистически значимым предиктором цитотоксичности (таблица 1).
Рисунок 3.
Средняя летальная доза 50 (LD50, сплошные линии) и 25–75% межквартильный диапазон (пунктирные линии) для линий клеток человека после воздействия различных концентраций PHMB и MH (верхние графики) и с течением времени (нижние графики) in vitro . Множественный линейный регрессионный анализ использовали для определения того, насколько местная концентрация или время воздействия лучше всего предсказывают потерю жизнеспособности клеток в трех линиях клеток человека. Примечание: Сплошные линии на каждом графике отображают среднее значение, а пунктирные линии вверху и внизу представляют одно стандартное отклонение от среднего.
Рисунок 3.
Средняя летальная доза 50 (LD50, сплошные линии) и 25–75% межквартильный диапазон (пунктирные линии) для линий клеток человека после воздействия различных концентраций PHMB и MH (верхние графики) и с течением времени (внизу) графики) in vitro . Множественный линейный регрессионный анализ использовали для определения того, насколько местная концентрация или время воздействия лучше всего предсказывают потерю жизнеспособности клеток в трех линиях клеток человека. Примечание: Сплошные линии на каждом графике отображают среднее значение, а пунктирные линии вверху и внизу представляют одно стандартное отклонение от среднего.
Таблица 1. Жизнеспособность клеток
фибробластов, кератиноцитов и остеобластов, подвергшихся воздействию различных концентраций меда манука (MH) и полигексаметиленбигуанида (PHMB).
8080
. . Фибробласты . Кератиноциты . Остеобласты .
. . . . .
. . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0.5 часов . 3 ч . 6 часов . 24 часа .
MH 40% 98 70 65 50 87 71 64 51 82 66980 9097 9097 9097 9097 60% 96 74 59 46 76 74 59 43 77 51 45 81 71 41 25 68 43 37 27 70 44 30 12
PHMB 909.01% 99 66 33 28 83 69 56 39 88 35 25 18
62 46 30 25 62 44 36 27 59 36 38 23
0.1% 43 15 6 9 44 14 5 8 24 4 5 5
209 . . Фибробласты . Кератиноциты . Остеобласты .
. . . . .
. . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0.5 часов . 3 ч . 6 часов . 24 часа .
MH 40% 98 70 65 50 87 71 64 51 82 66980 9097 9097 9097 9097 60% 96 74 59 46 76 74 59 43 77 51 45 81 71 41 25 68 43 37 27 70 44 30 12
PHMB 909.01% 99 66 33 28 83 69 56 39 88 35 25 18
62 46 30 25 62 44 36 27 59 36 38 23
0.1% 43 15 6 9 44 14 5 8 24 4 5 Табл. , кератиноциты и остеобласты, подвергшиеся воздействию различных концентраций меда манука (MH) и полигексаметиленбигуанида (PHMB).
8080 9113
Инвазивные грибковые инфекции мягких тканей после травм могут значительно усложнить клиническое течение, требуя агрессивной хирургической обработки и системной противогрибковой терапии. Из-за инвазивного характера и связанной с этим смертности ИФИ агрессивная хирургическая обработка раны остается основой терапии и может потребовать весьма болезненных ампутаций, таких как дисартикуляция бедра при инфекциях ран нижних конечностей.В свете неудовлетворительного статуса доступных в настоящее время методов лечения, цель этого исследования заключалась в оценке двух клинически доступных, одобренных FDA соединений, PHMB и MH, в качестве потенциальных адъювантных местных методов лечения с целью снижения потребности в системных противогрибковых средствах и серийных препаратах. хирургическая обработка раны. Мы обнаружили, что PHMB и MB были активны, хотя и в разной степени, против большого количества изолятов плесени. Механизм действия, с помощью которого MH проявляет свои противомикробные эффекты, остается областью активных исследований.Однако проведенные на сегодняшний день исследования могут помочь определить более медленное начало действия. Kwakman et al. исследовали антибактериальные свойства отдельных компонентов MH, отметив, что MH имеет более высокую концентрацию метилглиоксаля (MGO), который медленно оказывает бактерицидное действие. Было высказано предположение, что это также является основной причиной более медленной бактерицидной активности MH против метициллин-резистентного Staphylococcus aureus (MRSA). ¹⁴ Они также обнаружили, что MH имеет более низкие концентрации перекиси водорода и пчелиного дефенсина-1, оба из которых, как было обнаружено, обладают более высокими показателями бактерицидной активности в других протестированных монофлерных медах.Возможно, что антимикробные свойства MH, ответственные за его активность против MRSA, также способствуют противогрибковой активности, наблюдаемой в этом исследовании. Если бы тесты на время уничтожения были продлены на более длительный срок, возможно, наблюдалось бы большее сокращение грибковых изолятов. Эта задержка до начала антимикробной активности может в течение 24-часовых периодов времени, изученных в этом исследовании, привести к нашим наблюдениям преимущественно зависящей от времени противогрибковой активности ЗГ.
В этом исследовании фунгицидная активность наблюдалась при всех трех концентрациях PHMB. Рост примерно половины исследованных грибковых изолятов снижался на> 2 log КОЕ после воздействия PHMB, и скорость уничтожения не увеличивалась далее пропорционально концентрации PHMB. В этом нет ничего удивительного, учитывая его нынешнее использование в качестве антисептика в растворах для контактных линз для предотвращения роста грибков, ведущих к глазной инфекции. ⁵⁰ PHMB был наиболее эффективным против изолятов Fusarium и Exophiala , но имел минимальную активность против A.flavus и A. terreus . Это согласуется с ролью A. flavus как причины глазной грибковой инфекции. Поскольку мы не продемонстрировали фунгицидную активность, зависящую от концентрации, необходимы дальнейшие исследования дополнительных грибковых характеристик, которые могут служить индикаторами клинической восприимчивости к PHMB.
Токсические клеточные эффекты агентов, которые потенциально могут ограничить клиническое использование, были оценены с помощью анализов клеточной токсичности. Когда все три линии клеток человека были исследованы в совокупности, было обнаружено, что MH обладает зависимой от времени клеточной токсичностью в более поздние моменты времени.Основная причина этого неясна. Хотя это может отражать большую статистическую мощность, достигнутую большим количеством наблюдений, это также может отражать осмотический эффект меда, который, как известно, является частью его антибактериальных свойств. ^15,17,58 Ранее это было отмечено как основное средство бактерицидной активности меда против Helicobacter pylori . ⁵⁸ В то время как наше исследование показало, что MH токсичен для клеток человека, исследования эксплантатов тканей человека для MH предполагают эпидермальную цитосовместимость со скромной ранней стимуляцией эпидермальных кератиноцитов и фибробластов по сравнению с контролем.⁵⁹ Точно так же пропитанные медом повязки лучше всего подходили для заживления частичных ожогов на 4–5 дней быстрее, чем обычные повязки. ³⁶ Использование меда медицинского качества для ускорения заживления ран с хроническим венозным застоем и пролежней не поддерживалось. ³⁶
На основе анализов жизнеспособности клеток мы обнаружили, что PHMB, протестированный в концентрациях или ниже, используемых в настоящее время для ухода за человеческими ранами, токсичен для культивируемых человеческих клеток в зависимости от времени и концентрации.Эти результаты контрастируют с предыдущими исследованиями клеточной токсичности PHMB. ^39–44 В одном исследовании, в котором PHMB применялся к мышиным фибробластам и E. coli , антибактериальные эффекты превышали цитотоксические эффекты. ³⁹ Предостережение к этому исследованию состоит в том, что культуры клеток подвергались воздействию PHMB только достаточно долго, чтобы количество бактерий уменьшилось на 3 логарифма. Однако исследования с использованием PHMB в качестве компонента перевязочного материала для ран ³⁹ показали, что повязки сохраняют антимикробную эффективность без повреждения жизнеспособных тканей.Примечательно, что степень, в которой тестирование цитотоксичности in vitro культивируемых клеток (которые не имеют базальной мембраны или более высокой тканевой архитектуры) точно предсказывает токсичность in vivo тканей человека, неясна. Использование PHMB в офтальмологической медицине также предполагает определенную степень клинической безопасности. ⁴⁶
Несмотря на доказательства цитотоксичности в культивируемых клетках, использование MH и PHMB все еще может иметь значение. Забуференный гипохлорит натрия (раствор Дакина) также показал токсичность в исследованиях с использованием культивированных клеток человека.Исследование Kozol et al. в 1988 г. оценил влияние раствора Дакина на миграцию нейтрофилов в фибробластах и эндотелиальных клетках на модели кролика, чтобы служить суррогатным маркером жизнеспособности клеток. Они также оценили прямую клеточную токсичность с помощью электронной микроскопии и триптанового синего. ⁶⁰ В их исследовании все концентрации раствора Дакина были цитотоксичными, несмотря на то, что они были ниже, чем в настоящее время используется в клинической практике. Точно так же клеточная токсичность была обнаружена при воздействии раствора Дакина на кератиноциты человека, о чем свидетельствует снижение поглощения нейтрального красного красителя.Снижение поглощения нейтрального красного было интерпретировано как потеря клеточной целостности, поскольку он поглощался только лизосомами интактных клеток. ⁶¹ Исследование Homeyer et al. аналогично продемонстрировал токсичность как раствора Дакина, так и масла Melaleuca alternifolia (чайного дерева) при воздействии на культуры клеток человека в концентрациях, используемых в настоящее время в клинической практике. ⁹ Важно отметить, что и MH, и PHMB показали в целом большую активность против роста грибов, чем M.alternifolia при воздействии аналогичных нитчатых грибов. Таким образом, несмотря на многочисленные исследования, свидетельствующие о клеточном повреждении компонентов клеток, важных для заживления ран, раствор Дакина продолжает использоваться в качестве местного дополнения в клинической практике. Его использованию приписывают снижение использования системных антибиотиков, снижение общей микробной нагрузки и практическое применение для ран, которые иначе не поддаются перевязкам. ⁶²
В будущих исследованиях следует изучить безопасность PHMB и MH при более низких концентрациях.Повторение исследования с более низкими концентрациями MH может потенциально снизить токсичность для линий клеток человека, позволяя при этом исследовать фунгистатические свойства агента. PHMB продемонстрировал зависящую от концентрации клеточную токсичность и бинарный противогрибковый эффект «все или ничего». В отношении более восприимчивых изолятов PHMB был одинаково фунгицидным, но имел небольшую активность против менее чувствительных изолятов. Тестирование при более низких концентрациях, чем использованные здесь, может лучше определить концентрации, которые оптимизируют противогрибковую активность и цитотоксичность клеток хозяина.Кроме того, потенциальные фунгистатические свойства, присущие агенту, могут проявляться при более низких концентрациях. Аналогичным образом, воздействие на культуры клеток как PHMB, так и MH, одновременно или последовательно, может лучше определить переносимость человеческих клеток к этим агентам и лучше охарактеризовать их потенциальную клиническую эффективность. Доказано, что мед медицинского качества эффективен против множества бактериальных биопленок, а также против биопленок Candida . Насколько нам известно, не проводилось исследований эффективности меда на биопленках мицелиальных грибов.Дальнейшее исследование этих свойств может принести клиническую пользу. ^63,64
Ограничения нашего исследования включали использование только одного типа меда медицинского качества. Предыдущие исследования показали, что различные коммерчески доступные и широко используемые меды медицинского качества обладают разными механизмами действия для достижения уничтожения бактерий. ¹⁴ Тем не менее, мы решили использовать только одобренный FDA мед медицинского класса, который, следовательно, можно было бы легко использовать в клинической практике.Практическим ограничением исследования была оценка воздействия MH и PHMB на отдельные штаммы грибов. Отсутствие тестирования всех известных грибковых штаммов позволяет получить ограниченное представление о противогрибковой эффективности агента. Различные изоляты одного и того же вида потенциально могут обладать разными профилями чувствительности к MH и PHMB. Попытки минимизировать этот эффект были предприняты при тестировании нескольких штаммов A. flavus, Actinomucor sp . и Mucor sp . Однако среди этих видов грибов с несколькими штаммами все штаммы вели себя одинаково при тестировании.Дополнительные ограничения включали использование культур клеток, а не живых тканей для анализов токсичности, как упоминалось ранее.
В заключение мы оценили противогрибковую активность двух агентов, предложенных для дополнительной местной терапии инвазивных грибковых инфекций мягких тканей: Manuka Honey и полигексаметилен бигуанид. Мы подвергли воздействию этих агентов множество нитчатых грибов, обнаружив переменную активность. Мы также наблюдали значительную цитотоксичность этих агентов по отношению к культивируемым линиям клеток человека.Токсичность преимущественно зависела от времени для MH и как от времени, так и от концентрации для PHMB. Остается неизвестным, ограничивает ли клеточная токсичность при испытанных концентрациях и более длительное время воздействия клиническую пользу. Использование этих агентов с аналогичными концентрациями в коммерчески доступных продуктах подтверждает гипотезу о том, что клиническое использование не приведет к токсичности для клеток. По-прежнему возможно местное нанесение одного или обоих агентов на травматические раны и места хирургического вмешательства.Необходимы дальнейшие исследования для оценки цитотоксичности обоих агентов с использованием более клинически релевантной системы, такой как ex vivo, тканевых эксплантатов, in vivo, животных моделей и, в конечном итоге, испытания на людях, прежде чем можно будет рекомендовать широкое клиническое использование.
Благодарности
Поддержка этой работы (IDCRP-024) была предоставлена Программой клинических исследований инфекционных заболеваний (IDCRP), программой Министерства обороны США, осуществляемой через Департамент профилактической медицины и биостатистики Университета военной службы здравоохранения.Этот проект финансируется Министерством обороны Глобальной системой эпиднадзора за возникающими инфекциями и реагированием на них (GEIS) [HT9404-12-1-0011], подразделением Центра наблюдения за состоянием здоровья вооруженных сил, Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальных институтов. здравоохранения, в соответствии с межучрежденческим соглашением Y1-AI-5072, и Департаментом военно-морского флота в рамках программы для раненых, больных и раненых [HU001-10-1-0014].
Выраженные взгляды принадлежат авторам и не обязательно отражают официальную точку зрения Университета медицинских наук Университета военной службы Генри М.Фонд Джексона по развитию военной медицины, Inc., Национальные институты здравоохранения или Департамент здравоохранения и социальных служб, Армейский медицинский центр Брук, Институт хирургических исследований армии США, Медицинский департамент армии США, Управление армии США Главный хирург, Министерство обороны или департаменты армии, военно-морского флота или военно-воздушных сил. Упоминание торговых наименований, коммерческих продуктов или организаций не означает одобрения со стороны правительства США.
Декларация интересов
Авторы не сообщают о конфликте интересов.Только авторы несут ответственность за содержание и написание статьи.
Список литературы
1.
Neblett Fanfair
R
,
Benedict
K
,
Bos
J
et al.
Некротический кожный мукормикоз после торнадо в Джоплине, штат Миссури, в 2011 году
.
N Engl J Med
2012
;
367
:
2214
—
2225
. 2.
Warkentien
T
,
Rodriguez
C
,
Lloyd
B
et al.
Инвазивные плесневые инфекции после боевых травм
.
Clin Infect Dis
2012
;
55
:
1441
—
1449
. 3.
Мюррей
C
,
Wilkins
K
,
Molter
N
et al.
Инфекции, осложняющие уход за ранеными в ходе операций «Свобода Ирака» и «Несокрушимая свобода»
.
J Trauma
2011
;
71
(
дополнение
):
S62
—
S73
.4.
Паолино
K
,
Генри
J
,
Hospenthal
D
et al.
Инвазивные грибковые инфекции, вызванные боевыми травмами
.
Mil Med
2012
;
177
:
681
—
685
. 5.
Мюррей
C
,
Obremskey
W
,
Hsu
J
et al.
Профилактика инфекций, связанных с боевыми травмами конечностей
.
J Trauma
2011
;
71
(
дополнение
):
S235
—
S257
.6.
Lloyd
B
,
Weintrob
A
,
Rodriguez
C
et al.
Эффект раннего скрининга на инвазивные грибковые инфекции у военнослужащих США с ранениями в результате взрывов взрывов
.
Хирургическая инфекция
2014
;
15
:
619
—
626
.7.
Льюис
Р.
Современные концепции противогрибковой фармакологии
.
Mayo Clin Proc
2011
;
86
:
805
—
817
.8.
Барсумиан
A
,
Санчес
C
,
Mende
K
et al.
Токсичность и активность раствора Дакина, ацетата мафенида и амфотерицина В in vitro в отношении мицелиальных грибов и клеток человека
.
J Orthop Trauma
2013
;
27
:
428
—
436
.9.
Homeyer
D
,
Sanchez
C
,
Mende
K
et al.
Активность масла Melaleuca alternifolia (чайного дерева) in vitro в отношении нитчатых грибов и токсичность для клеток человека
.
Med Mycol
2015
;
53
:
285
—
294
.10.
Sipos
P
,
Gyory
H
,
Hagymasi
K
et al.
Особые методы заживления ран, использовавшиеся в Древнем Египте, и мифология
.
World J Surg
2004
;
28
:
211
—
216
. 11.
Sheikh
D
,
Zaman
S
,
Naqvi
S
et al.
Исследования антимикробной активности меда
.
Pak J Pharm Sci
1995
;
8
:
51
—
62
.12.
Langemo
D
,
Hanson
D
,
Anderson
J
et al.
Использование меда для заживления ран
.
Adv Уход за кожными ранами
2009
;
22
:
113
—
118
. 13.
Ли
D
,
Sinno
S
,
Khachemoune
A
.
Мед и ранозаживляющие
.
Am J Clin Dermatol
2011
;
12
:
181
—
190
.14.
Kwakman
P
,
Zaat
S
.
Антибактериальные компоненты меда
.
IUBMB Life
2012
;
64
:
48
—
55
.15.
Kwakman
P
,
te Velde
A
,
de Boer
L
et al.
Как мед убивает бактерии
.
FASEB J
2010
;
24
:
2576
—
2582
.16.
Аль-Вайли
N
,
Salom
K
,
Butler
G
et al.
Мед и микробные инфекции: обзор в поддержку использования меда для микробного контроля
.
J Med Food
2011
;
14
:
1079
—
1096
. 17.
Исраили
Z
.
Антимикробные свойства меда
.
Am J Ther
2014
;
21
:
304
—
323
.18.
Molan
P
.
Возможности меда при лечении ран и ожогов
.
Am J Clin Dermatol
2001
;
2
:
13
—
19
,19.
Olaitan
PB
,
Adeleke
OE
,
Ola
IO
.
Мед: резервуар для микроорганизмов и ингибитор микробов
.
Afr Health Sci
2007
;
7
:
159
—
165
.20.
Lusby
P
,
Coombes
A
,
Wilkinson
J
.
Мед: сильнодействующее средство для заживления ран?
J Рана, остома, удержание мочи Nurs
2002
;
29
:
295
—
300
. 21.
Аль-Вайли
N
,
Салом
K
,
Аль-Гамди
A
.
Мед для заживления ран, язв и ожогов: данные, подтверждающие его использование в клинической практике
.
Sci World J
2011
;
11
:
766
—
787
. 22.
Blair
S
,
Cokcetin
N
,
Harry
E
et al.
Необычная антибактериальная активность меда Leptospermum медицинского класса: спектр антибактериальных свойств, резистентность и анализ транскриптома
.
евро J Clin Microbiol Infect Dis
2009
;
28
:
1199
–
1208
.23.
Maeda
Y
,
Loughrey
A
,
Earle
J
et al.
Антибактериальная активность меда против метициллин-резистентных, ассоциированных с сообществами Staphylococcus aureus (CA-MRSA)
.
Дополнение Ther Clin Pract
2008
;
14
:
77
—
82
. 24.
Георгий
N
,
Раскрой
K
.
Антибактериальный мед: активность in vitro против клинических изолятов MRSA, VRE и других мультирезистентных грамотрицательных организмов
.
Ранения
2007
;
19
:
231
—
236
0,25.
Kwakman
P
,
Van den Akker
J
,
Guclu
A
et al.
Мед медицинского класса убивает устойчивые к антибиотикам бактерии in vitro и устраняет колонизацию кожи
.
Clin Infect Dis
2008
;
46
:
1677
—
1682
. 26.
AL-Waili
N
,
Al Ghamdi
A
,
Ansari
M
et al.
Различия в составе образцов меда и их влияние на антимикробную активность против мультирезистентных к лекарственным средствам бактерий и патогенных грибов
.
Arch Med Res
2013
;
44
:
307
—
316
,27.
Kuncic
MK
,
Jaklic
D
,
Lapanje
A
et al.
Антибактериальная и антимикотическая активность словенского меда
.
Br J Biomed Sci
2012
;
69
:
154
.28.
Wellford
T
,
Eadie
T
,
Llewellyn
G
.
Оценка ингибирующего действия меда на рост грибов, споруляцию и выработку афлатоксина
.
Z Lebensm Unters Forsch
1978
;
166
:
280
—
283
. 29.
Ирландский
J
,
Carter
D
,
Shokohi
T
et al.
Мед обладает противогрибковым действием против Candida видов
.
Med Mycol
2006
;
44
:
289
—
291
. 30.
Koc
A
,
Silici
S
,
Ercal
B
et al.
Противогрибковая активность турецкого меда против Candida spp. и Trichosporon spp: оценка in vitro
.
Med Mycol
2009
;
47
:
707
—
712
. 31.
Boukraa
L
,
Bouchegrane
S
.
Аддитивное действие меда и крахмала против Candida albicans и Aspergillus niger
.
Ред. Iberoam Micol
2007
;
24
:
309
—
311
.32.
Обасейки-Эбор
E
,
Афоня
T
.
Оценка in vitro противокандидозной активности медового дистиллята (HY − 1) по сравнению с некоторыми антимикотическими средствами
.
J Pharm Pharmacol
1984
;
36
:
283
—
284
.33.
Koc
A
,
Silici
S
,
Kasap
F
et al.
Противогрибковая активность продуктов пчеловодства против Candida spp. и Trichosporon spp
.
J Med Food
2011
;
14
:
128
—
134
. 34.
Mulu
A
,
Diro
E
,
Tekleselassie
H
et al.
Влияние эфиопского мёда мультифлоры на флуконазол-устойчивые виды Candida , выделенные из полости рта больных СПИДом
.
Int J STD AIDS
2010
;
21
:
741
—
745
. 35.
Сноудон
JA
,
Cliver
DO
.
Микроорганизмы в меде
.
Int J Food Microbiol
1996
;
31
:
1
—
26
,36.
Jull
AB
,
Walker
N
,
Deshpande
S
.
Мед для местного лечения ран
.
Кокрановская база данных Syst Rev
2015
;
6
:
CD005083
.37.
Alzahrani
H
,
Alsabehi
R
,
Boukraa
L
et al.
Антибактериальная и антиоксидантная активность цветочного меда различного ботанического и географического происхождения
.
Молекулы
2012
;
17
:
10540
—
10549
. 38.
Макдоннелл
G
,
Рассел
D
.
Антисептики и дезинфицирующие средства: активность, действие и устойчивость
.
Clin Microbiol Rev
1999
;
12
:
147
—
179
. 39.
Мюллер
G
,
Kramer
A
.
Индекс биосовместимости антисептических агентов по параллельной оценке антимикробной активности и клеточной цитотоксичности
.
J Antimicrob Chemother
2008
;
61
:
1281
—
1287
.40.
Butcher
M. PHMB
:
эффективное противомикробное средство для лечения бионагрузки раны
.
Br J Nurs
2012
;
21
:
S16
—
S21
.41.
Wiegand
C
,
Bauer
M
,
Hipler
U
et al.
Поли (этиленимины) для кожного применения: биосовместимость и антимикробное действие
.
Int J Pharm
2013
;
456
:
165
—
174
.42.
Chadeau
E
,
Dumas
E
,
Adt
I
et al.
Оценка механизма действия полигексаметилен бигуанида против Listeria innocua с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и анализа флуоресцентной анизотропии
.
Can J Microbiol
2012
;
58
:
1353
—
1361
. 43.
Behrens-Baumann
W
,
Seibold
M
,
Hofmuller
W
et al.
Польза полигексаметиленбигуанида при фузариозном кератите
.
Ophthalmic Res
2012
;
48
:
171
—
176
. 44.
Sibbald
R
,
Coutts
P
,
Woo
K
.
Уменьшение бактериальной нагрузки и боли в хронических ранах с помощью новой антимикробной повязки на основе полигексаметиленбигуанида: результаты клинических испытаний
.
Adv Уход за кожными ранами
2011
;
24
:
78
—
84
.45.
Rohrer
N
,
Widmer
A
,
Waltimo
T
et al.
Противомикробная эффективность 3 пероральных антисептиков, содержащих октенидин, полигексаметиленбигуанид или цитрокс: можно ли заменить хлоргексидин?
Инфекционный контроль Hosp Epidemiol
2010
;
31
:
733
—
739
. 46.
Кумар
R
,
Ллойд
D
.
Последние достижения в лечении Acanthamoeba кератита
.
Clin Infect Dis
2002
;
35
:
434
—
441
. 47.
Panda
A
,
Ahuja
R
,
Biswas
N
et al.
Роль 0,02% полигексаметиленбигуанида и 1% повидон-йода в экспериментальном кератите Aspergillus
.
Роговица
2003
;
22
:
138
—
141
. 48.
Messick
C
,
Pendland
S
,
Moshirfar
M
et al.
Активность полигексаметилен бигуанида (PHMB) in vitro против грибковых изолятов, связанных с инфекционным кератитом
.
J Antimicrob Chemother
1999
;
44
:
297
—
298
, 49.
Fiscella
R
,
Moshifar
M
,
Messick
C
et al.
Полигексаметилен бигуанид (ПГМБ) в лечении экспериментального кератомикоза Fusarium
.
Роговица
1997
;
16
:
447
—
449
.50.
Xu
Y
,
He
Y
,
Zhou
L
et al.
Действие дезинфицирующих средств для контактных линз против нитчатых грибов
.
Optom Vis Sci
2014
;
91
:
1440
—
1445
. 51.
Килвингтон
S
,
Лам
A
,
Nikolic
M
et al.
Устойчивость и рост видов Fusarium в растворах для дезинфекции контактных линз
.
Optom Vis Sci
2013
;
90
:
430
—
438
. 52.
Ребонг
R
,
Santaella
R
,
Goldhagen
B
et al.
Полигексаметилен бигуанид и ингибиторы кальциневрина в качестве новых противогрибковых средств лечения Aspergillus кератита
.
Invest Opthalmol Vis Sci
2011
;
52
:
7309
. 53.
Банович
F
,
Bozic
F
,
Lemo
N
.
Сравнение in vitro эффективности полигексанида и хлоргексидина против собачьих изолятов Staphylococcus pseudintermedius, Pseudomonas aeruginosa и Malassezia pachydermatis
.
Ветеринарный дерматол
2013
;
24
:
409
—
413
.54.
Институт клинических и лабораторных стандартов
.
Эталонный метод тестирования противогрибковой чувствительности в разведении бульона мицелиальных грибов
, Утвержденный стандарт, второе изд.
Документ CLSI M38-A2
.
Уэйн, Пенсильвания
:
CLSI
;
2008
.55.
Лароне
D.
Важные с медицинской точки зрения грибы: руководство по идентификации
, 5-е издание,
Вашингтон, округ Колумбия
:
ASM Press
,
2011
.56.
Sutton
D
,
Fothergilol
A
,
Rinaldi
M
.
Справочник по клинически значимым грибам
.
Филадельфия
:
Уильямс и Уилкинс
,
1998
. 57.
De Hoog
G.
Атлас клинических грибов
, второе издание.
Нидерланды
:
Centraalbureau voor Schimmelcultures
,
2000
. 58.
Osato
M
,
Reddy
S
,
Graham
D
.
Осмотическое влияние меда на рост и жизнеспособность Helicobacter pylori
.
Dig Dis Sci
1999
;
44
:
462
—
464
. 59.
Du Toit
D
,
Стр.
B
.
Оценка клеточной токсичности меда и серебряных повязок in vitro
.
J Уход за ранами
2009
;
18
:
383
—
389
.60.
Козол
р.
Действие гипохлорита натрия (раствор Дакина) на клетки раневого модуля
.
Arch Surg
1988
;
123
:
420
.61.
Cooper
M
,
Laxer
J
,
Hansbrough
J
.
Цитотоксическое действие обычно используемых местных антимикробных агентов на человеческие фибробласты и кератиноциты
.
J Trauma
1991
;
31
:
775
—
784
.62.
Корнуэлл
P
,
Arnold-Long
M
,
Barss
S
et al.
Применение раствора Дакина при хронических ранах
.
J Рана, удержание стомы Nurs
2010
;
37
:
94
—
104
.63.
Ramage
G
,
Robertson
S
,
Williams
C
.
Сила в цифрах: противогрибковые стратегии против грибковых биопленок
.
Int J Antimicrob Agents
2014
;
43
:
114
—
120
.64.
Ansari
M
,
Al-Ghamdi
A
,
Usmani
S
et al.
Влияние меда из мармелада на рост Candida albicans и образование биопленок
.
Arch Med Res
2013
;
44
:
352
—
360
.
Опубликовано Oxford University Press от имени Международного общества микологии человека и животных, 2016 г.Эта работа написана (а) государственным служащим (ами) США и находится в общественном достоянии США.
In vitro Инфекция куколок израильским вирусом острого паралича свидетельствует о нарушении транскрипционного гомеостаза у медоносных пчел (Apis mellifera)
Abstract
Продолжающееся ухудшение здоровья медоносных пчел во всем мире является серьезной экономической и экологической проблемой. Одним из основных факторов, способствующих снижению, являются патогены, в том числе несколько вирусов медоносных пчел.Однако информация о биологии пчелиных вирусов и молекулярных взаимодействиях с их хозяевами ограничена. Был разработан экспериментальный протокол для тестирования этих систем с использованием инъекций израильского вируса острого паралича (IAPV) куколкам медоносных пчел, выращиваемых ex-situ в лабораторных условиях. У инфицированных куколок развивались ярко выраженные, но изменчивые паттерны болезни. Симптомы варьировали от полного прекращения развития без видимых признаков заболевания до быстрого потемнения части или всего тела.Наблюдались значительные различия в динамике титра IAPV, что свидетельствует о значительных различиях в устойчивости к IAPV среди семей медоносных пчел и, возможно, внутри них. Таким образом, должно быть возможным селективное разведение на устойчивость к вирусам. Анализ экспрессии генов в трех отдельных экспериментах предполагает нарушение IAPV транскрипционного гомеостаза нескольких фундаментальных клеточных функций, включая активацию пути биогенеза рибосом. Эти результаты дают первое представление о механизмах патогенности IAPV.Они отражают транскрипционный обзор медоносных пчел, страдающих расстройством коллапса колоний, и, таким образом, подтверждают гипотезу о том, что вирусы играют решающую роль в ухудшении здоровья медоносных пчел.
Образец цитирования: Boncristiani HF, Evans JD, Chen Y, Pettis J, Murphy C, Lopez DL, et al. (2013) In vitro Инфекция куколок израильским вирусом острого паралича предполагает нарушение транскрипционного гомеостаза у медоносных пчел ( Apis mellifera ). PLoS ONE 8 (9): e73429.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0073429
Редактор: Эрик Ян, Университет Британской Колумбии, Канада
Поступила: 7 марта 2013 г .; Дата принятия: 19 июля 2013 г .; Опубликовано: 5 сентября 2013 г.
Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, изменять, создавать или иным образом использовать в любых законных целях. Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.
Финансирование: Работа была поддержана грантом программы постдокторских исследований в штаб-квартире USDA-ARS и грантом Национальной академии наук NRC для HFB, а также UNCG и грантом AFRI Национального института продовольствия и сельского хозяйства США (# 2010-65104-20533) в OR. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.
Введение
За последние годы ухудшение здоровья медоносной пчелы (Apis mellifera) и других опылителей вызвало обеспокоенность во всем мире. В частности, за последние шесть лет здоровье медоносных пчел демонстрирует тревожные темпы ухудшения [1], [2], [3], что ставит под сомнение устойчивость нашей системы производства продуктов питания. Существует множество возможных угроз здоровью медоносных пчел, включая пестициды, недоедание, стресс управления и патогены [3], [4], [5], [6], [7].
Многочисленные исследования показывают, что новые или появляющиеся патогены играют роль в ухудшении здоровья медоносных пчел [1], [2], [3], [7], [8], [9]. Однако недостаточные знания о патогенах медоносных пчел ставят под угрозу нашу способность оценить их важность и разработать меры контроля. Это особенно верно в отношении вирусов медоносных пчел, хотя их важность для потерь медоносных пчел стала очевидной в последние годы [6], [7], [8], [10], [11], [12]. В частности, в сочетании с эктопаразитарным пчелиным клещом Varroa destructor [13], [14], [15], который служит переносчиком, некоторые вирусы, по-видимому, становятся более вирулентными [16], [17], [18].Вирусы могут вызывать скрытые инфекции [19] и считались в основном безвредными до тех пор, пока клещи Варроа не были введены в популяцию A. mellifera почти 30 лет назад [20], [21], [22]. Повышенная вирулентность вирусов была подтверждена экспериментально путем прямого заражения пчел вирусами [23], [24], [25], [26], [27], что открыло важную область исследований для изучения.
К настоящему времени описано около двадцати вирусов медоносных пчел [4], [16], [28], [29], влияющих на морфологию, физиологию и поведение пчел.Большинство из них принадлежит семействам Dicistroviridae [30] и Iflaviridae в отряде Picornavirales. Вирусы этих семейств имеют геном с положительной смысловой РНК, покрытый икосаэдром, капсидом симметрии структуры псевдо T = 3 (около 30 нм), который отвечает за защиту РНК, специфичность хозяина и инфицирование тканей. Пикорнавирусы хорошо известны своей способностью отключать систему трансляции своих клеток-хозяев путем расщепления факторов трансляции, что приводит к снижению кэп-зависимой трансляции хозяина, консервативной стратегии репликации среди всех членов, изученных на сегодняшний день [31], [32] ].Пикорнавирусная инфекция также запускает иммунные ответы хозяина (то есть PKR), что приводит к снижению кэп-зависимой (хозяина) трансляции. Пикорнавирусы обходят этот иммунный ответ, кодируя внутренний сайт входа в рибосомы (IRES), который распознается и транслируется механизмом хозяина (неканоническая трансляция) [30], [32]. Со временем накопление продуцируемых вирусных частиц и подавление синтеза основных компонентов клетки в большинстве случаев приводит к гибели клеток [32].
Мало что известно о конкретной биологии вирусов этих семейств, поражающих медоносных пчел, хотя они содержат важные патогены пчел, такие как вирус деформированного крыла (DWV) и вирус острого паралича Израиля (IAPV).IAPV ранее был связан с необычным синдромом исчезновения медоносных пчел, называемым расстройством коллапса колоний (CCD) [8], и часто обнаруживается во многих исследованиях патогенов медоносных пчел [6], [7]. Несмотря на важность IAPV и возможность работы с IAPV в лаборатории [25], [33], мало что известно о взаимодействиях IAPV с его хозяином и, как следствие, патогенезе.
В целом, отсутствие адекватных инструментов для исследования вирусов медоносных пчел затрудняло наше понимание базовой биологии соответствующих вирусов, и мало что известно о молекулярных основах репликации и патогенеза вирусов медоносных пчел [18], [28].Поэтому многие предположения относительно их репликации сделаны на основе других пикорнавирусов (например, вируса паралича сверчка [34], [35] и вируса полиовируса человека [32]), что подчеркивает необходимость специфических механистических исследований вирусов медоносных пчел [36]. Сосредоточившись на IAPV, мы сообщаем здесь о разработке метода инокуляции куколки рабочих медоносных пчел, выращенных in vitro, который обеспечивает основу для механистических, глубоких исследований вирусов медоносных пчел. Мы сообщаем об острых, но вариабельных симптомах заболевания, сравниваем репликацию вируса среди куколок двух колоний и патрилинов в этих колониях и сообщаем об измерениях экспрессии генов в ответ на вирусную инфекцию, которые указывают на серьезное нарушение клеточного гомеостаза.
Материалы и методы
Подготовка вирусов, количественная оценка и электронная микроскопия
Первоначально примерно 20 взрослых пчел из колонии, сильно инфицированной IAPV, замораживали в жидком азоте, измельчали до мелкого порошка и гомогенизировали в 10 мл буфера для экстракции (0,1 М калий-фосфатный буфер, pH 7,5, 0,2% диэтилдитиокарбамат, 1/5 объем диэтилового эфира). Эмульгирование осуществляли путем добавления 5 мл четыреххлористого углерода и центрифугирования при 10 000 об / мин при 4 ° C в течение 10 минут (ротор: Sorvall RC-5B) и сбора супернатанта.
Супернатант, содержащий вирусы, фильтровали через 0,2-микронный фильтр (milex-GS, Millipore, # SLGS033SS) для удаления мелких остатков ткани, грибков и бактерий. Затем фильтрат центрифугировали при 30 000 об / мин (61 740 RCF) в ультрацентрифуге Beckman LB-70M с ротором 70,1 / Ti в течение шести часов при 4 ° C для осаждения частиц пикорнавируса. Осадок ресуспендировали в 0,2 мл PBS и центрифугировали против градиента CsCl (0,44 г / мл) при 52000 об / мин (185000 RFC) в течение ночи (ультрацентрифуга Beckman LB-70M, 70.1 / Ti ротор). Фракции, содержащие вирусные частицы, подвергали диализу с использованием «диализных кассет Slide-A-Lyzer» против холода (10 ° C) 0,2 мл PBS в течение ночи. ОТ-ПЦР проводилась для проверки наличия вируса острого пчелиного паралича (ABPV), израильского вируса острого паралича (IAPV), вируса кашмирской пчелы (KBV), вируса Sacbrood (SBV), вируса хронического пчелиного паралича (CBPV), черной королевы. Клеточный вирус (BQCV) и вирус деформированного крыла (DWV). IAPV и небольшие количества ABPV, DWV и BQCV были обнаружены в очищенном вирусном растворе (положительная амплификация с праймерами для ПЦР).Количественное определение вирусов проводили путем абсолютного количественного определения с использованием метода стандартной кривой, как описано ранее [37] [38]. 5,0 мкл вирусного раствора исследовали на наличие вирусных частиц и их феноменологическую характеристику с помощью электронной микроскопии. Частицы вируса отрицательно окрашивали 2% уранилацетатом на никелевой сетке, покрытой формваром, и просматривали в электронном микроскопе Hitachi H-7000 с увеличением от 150 000X до 200 000X.
IAPV легко реплицируется в куколках [25]. Таким образом, белоглазые куколки были инокулированы для размножения вируса с использованием 1.0 мкл вирусной суспензии на куколку. После 4 дней инкубации при явных симптомах заболевания (рис. 1) вирусы очищали с использованием подхода, описанного выше. qRT-PCR показала на ~ 10 ⁵ геномов IAPV больше, чем у второго наиболее детектируемого вируса, DWV после одного раунда амплификации куколки путем инъекции вируса и выделения. Эту процедуру повторяли дважды с использованием куколок из очень сильных ульев для дальнейшего снижения заражения вирусами и увеличения количества IAPV. Высокая концентрация IAPV по сравнению с другими вирусами медоносных пчел в этих очистках позволила нам сильно разбавить инокулят, уменьшив вероятность перекрестной инокуляции с другим вирусом.В экспериментах, описанных ниже, мы вводили 10 ⁴ эквивалентов генома IAPV, сохраняя при этом вероятность перекрестного заражения на незначительном уровне.
Рис. 1. Система экспериментальных исследований для отслеживания патогенности вируса во время развития куколки медоносной пчелы в лаборатории.
[A] Развитие индивидуумов, инокулированных IAPV (IAPV), инъецированных PBS (PBS) и отрицательного контроля (W / O). Группа IAPV показывает прогрессирующие симптомы заболевания по сравнению с нормально развивающейся группой PBS и контрольной группой.[B] Крупный план различных симптомов репликации IAPV в куколках белых глаз медоносных пчел: полное прекращение развития без видимых признаков заболевания (1), очевидно нормальное развитие (2), быстрое потемнение различных частей тела (3, 4), потемнение и затрудненное развитие вместе (5). [C] Контрольные пчелы завершают метаморфоз.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0073429.g001
Параметры экстракции РНК и количественной ПЦР
Куколки индивидуально гомогенизировали и подвергали экстракции общей РНК с использованием TRIzol® (Invitrogen, Carlsbad CA) в соответствии с протоколом производителя.Полученные гранулы РНК ресуспендировали в воде, обработанной диэтилпирокарбонатом, в присутствии ингибитора РНКазы (Invitrogen, Carlsbad CA) и обрабатывали ДНКазой I (Invitrogen, Carlsbad CA) для удаления любой загрязняющей ДНК. Полученную РНК количественно определяли на спектрофотометре Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Затем кДНК первой цепи синтезировали путем инкубации 2 мкг общей РНК на образец в 96-луночном планшете с мастер-смесью, содержащей 50 ед. Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 нмоль смеси dNTP, 2 нмоль поли (dT) 18, и 0.1 нмоль поли (dT) (12–18) при 42 ° C в течение 50 минут, а затем 15 минут при 70 ° C, как описано ранее [39]. КДНК разводили в соотношении 1-5 водой молекулярной чистоты.
Праймеры, использованные в этом исследовании, были проверены для относительной количественной оценки целевых генов и обычно используются у медоносных пчел [39], [40], [41]. Реакции для амплификации продуктов кДНК проводили в 96-луночных планшетах с использованием машины Applied Biosystems Step One Real Time PCR (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния). Один микролитр разведенной кДНК из каждого образца использовали в качестве матрицы для реакций RT-qPCR с использованием SYBR Green ™ (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с протоколами производителя.Реакции проводили в соответствии с фиксированным термическим протоколом, состоящим из 3 минут при 95 ° C, за которыми следовали 40 циклов трехступенчатого протокола 95 ° C в течение 20 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 1 минуты. Измерения флуоресценции проводились в каждом цикле на последнем этапе 72 ° C. После этой процедуры был проведен анализ диссоциации кривой плавления для подтверждения специфичности реакций.
Опытный образец
На основе результатов предварительных экспериментов 1 и 2 (Предварительные эксперименты S1) был разработан более обширный эксперимент по прививке IAPV для изучения временной шкалы инфекции и связанных паттернов экспрессии генов, а также для оценки пчел на изменчивость восприимчивости к IAPV.
Один микролитр инокулянта (PBS в качестве контроля или вирусный раствор, содержащий 10 ⁴ геномных эквивалентов IAPV) вводили с помощью шприцевого насоса NanoJet ™ (Chemix, США) со скоростью инфузионного потока 0,1 мкл / сек в соответствии с параметрами производителя. . Иглу вводили в латеральную часть брюшка между четвертым и пятым тергитами молодых куколок медоносных пчел с белыми глазками (рис. 2А).
Рис. 2. Для обогащения IAPV медоносных пчел с типично смешанными инфекциями были выполнены повторные циклы инокуляции куколок и более поздняя очистка вирусов от инокулированных куколок.
Преимущественная репликация IAPV во время этой процедуры привела к очистке вируса с незначительным уровнем заражения другими вирусами. [A] Инокуляция куколок медоносных пчел IAPV. Несмотря на то, что инъекционные устройства различались в разных экспериментах (см. Основной текст), основное место инъекции и показанная методика были идентичны. [B] Электронно-микроскопическое изображение очищенного образца IAPV, показывающее чистые и однородные вирусные частицы (полные и пустые) около 27 нм.
https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0073429.g002
Два сильных улья без IAPV были выбраны из исследовательской пасеки UNCG, представляющих два разных источника пчел для эксперимента. Из каждого улья собирали по 200 куколок белых глаз для каждой из следующих групп обработки: без инокуляции (W / O), с инокулированным PBS (PBS) и с инокулированным IAPV (IAPV). Из каждой экспериментальной группы и улья 50 пчел были заморожены через 0, 5, 20 и 48 часов после инокуляции, и часть этих образцов была индивидуально проанализирована на вирусные титры и характер экспрессии генов.Первую временную точку непосредственно после инокуляции использовали как контроль исходного состояния пчел опытной и контрольной групп. Временная точка в пять часов после заражения была выбрана для измерения воздействия вируса до завершения цикла репликации, исходя из предположения, что IAPV соответствует среднему времени цикла репликации семейства пикорнавирусов, составляющему 7–12 часов [32], [ 34], [35]. Любые изменения экспрессии генов в этот момент времени представляют собой реакцию пчел на прививку без осложнений, связанных с повреждением тканей, связанным с вирусом.Момент времени 20 часов после заражения считался репрезентативным для событий после одного полного цикла репликации вируса, а момент времени 48 часов представлял установленное болезненное состояние, характеризующееся визуальными симптомами.
Основываясь на результатах предварительных экспериментов (Предварительные эксперименты S1), мы проверили влияние инъекции IAPV на экспрессию шести обычно используемых эталонных генов, которые, как сообщается, постоянно экспрессируются в различных экспериментальных условиях [4], [7] , [41].Мы изучали транскрипцию актина, рибосомной 28S РНК, рибосомной 18S РНК, рибосомного белка RPS5, MGST1 и гистона h3A при IAPV-инфекции. Гистон h3A не часто используется у медоносных пчел, но он был добавлен в наш эксперимент, потому что его экспрессия является конститутивной и независимой от клеточного цикла, и он обычно используется в других моделях [42]. Последовательности используемых праймеров h3A: 5′-AAAGGAAATTACGCAGAACGA-3 ‘(h3A вперед) и 5′-CGGCTAAATATTCCATAACGG-3’ (h3A Reverse). Кроме того, в этих образцах были количественно определены титры IAPV и DWV.
Patrilines Генотипирование
Одну заднюю ногу удаляли из каждой куколки и хранили при -20 ° C перед экстракцией ДНК для определения подсемейства (патрилин) для каждой особи. ДНК выделяли из каждой ноги стандартным методом Chelex 100® [43]. Вкратце, каждый образец инкубировали в течение 60 мин при 55 ° C, 15 мин при 99 ° C, 1 мин при 37 ° C и 15 мин при 99 ° C в 150 мкл 5% раствора Chelex 100® с 5 мкл 0,35. мг / мкл протеиназы К.
Идентификация подсемейства
для каждого образца определялась с использованием микросателлитных аллелей в соответствии с ранее описанными методами [44].Этот геномный анализ отцовства был проведен с использованием двух мультиплексных реакций ПЦР (Plex 1 и Plex 2) с 10 мкл реакционных объемов, содержащих примерно 100 нг образца ДНК, 1 × буфер для ПЦР (Takara® без MgCl ₂), 1 мг / мл BSA, 1,5 ед. Полимеразы Taq, 300 мкМ dNTP и 1,5 мМ (Plex 1) или 1,1 мМ (Plex 2) MgCl ₂. Согласно [45], наборы праймеров в Plex 1 включали 2,0–2,5 пМоль Am061, Am052, Am010 и Am553, а наборы праймеров в Plex 2 включали 2,5–3,5 пм Am043, Am098, Am125 и Am059.Все реакции проводили с использованием термоциклера Thermo® Px2 в течение 7 минут при 95 ° C, за которыми следовали 30 циклов по 30 секунд при 95 ° C, 30 секунд при 55 ° C (Plex 1) или 54 ° C (Plex 2) и 30 циклов. сек при 72 ° C, затем последние 10 мин при 72 ° C. Продукты ПЦР обрабатывали на анализаторе ДНК ABI 3730® в лаборатории геномных наук в NCSU. Данные были получены с помощью Genemapper 4.0 (ABI) для оценки размеров микросателлитных фрагментов. Локусы с плохой амплификацией были исключены из анализа, и для анализа использовались только образцы, для которых можно было оценить более половины локусов.Данные были проанализированы с помощью компьютерного пакета Colony 1.2 для определения принадлежности к подсемейству для каждого образца [46].
Анализ экспрессии генов
Все эксперименты показали, что абсолютные количества (значения Ct) стандартных референсных генов были затронуты обработкой IAPV (см. Результаты) и что они не соответствовали критерию стабильности экспрессии. Поэтому в основном эксперименте (сырые данные S1) оценивался более широкий набор потенциальных эталонных генов. Однако в отсутствие внутреннего контроля уровень транскриптов этих генов и IAPV нельзя было нормализовать обычными методами ΔCt или ΔΔCt [47], [48].Вместо этого транскрипты оценивали по значениям Ct, исходя из предположения, что количество матрицы после количественной оценки и соответствующего разведения не различается систематически между группами лечения. Чтобы гарантировать согласованность, фиксированный порог флуоресценции для каждого гена и каждого эксперимента определяли вручную, чтобы избежать несоответствий между прогонами RT-qPCR. Тесты на техническую погрешность показали высокую воспроизводимость для нескольких генов с вариациями между повторными значениями Ct в среднем 1,3% (минимум: 0.002%, максимум: 2,6%).
Все статистические анализы этого исследования были выполнены с использованием пакета R Stats Package, версия 2.15.0, http://www.r-project.org/ или SPSS 20.0 (IBM). Тепловые карты были созданы с помощью пакета Heatmap.Plus R Package версии 1.3. Паттерны экспрессии генов анализировали с помощью параметрических линейных моделей, используя время и лечение в качестве фиксированных эффектов. Были проведены апостериорные тесты Бонферрони и Шеффе, результаты которых не различались. В ходе эксперимента титры вирусов у инокулированных особей сравнивали среди колоний и патрилинов внутри колоний.Патрилины, которые были представлены только одной особью, были исключены из родительской линии, но не из анализа колонии. Таким образом, вместо одного вложенного ANOVA использовались отдельные ANOVA.
Результаты
Очистка IAPV
Попытки выделить чистый IAPV непосредственно от естественно инфицированных взрослых пчел оказались безуспешными из-за совместного инфицирования пчел другими вирусами медоносных пчел. ПЦР-тесты неоднократно приводили к положительной амплификации нескольких вирусов, таких как BQCV, ABPV и DWV.Коинфекция кажется скорее правилом, чем исключением, и, как правило, редко можно найти пчел, инфицированных одним вирусом [49]. Однако наша искусственная инокуляция куколок привела к избирательному увеличению IAPV по сравнению с другими вирусами. После трех раундов инокуляции куколок и последующей очистки вируса количество IAPV было по крайней мере на 10 ⁵ копий генома выше, чем у всех других распространенных вирусов медоносных пчел, обнаруженных в нашем первоначальном инокуляте (BQCV, ABPV, DWV). После серийных разведений IAPV был единственным вирусом, который можно было обнаружить с помощью ПЦР.Электронно-микроскопический анализ этого образца показал однородные вирусные частицы около 27 нм (рис. 2В), соответствующие частицам пикорнавируса. Анализ последовательности подтвердил, что эти частицы принадлежат к IAPV.
In vitro Стандартизация системы инфекций IAPV
Место для инъекции вирусного инокулята медоносной пчеле было выбрано на основании способности куколок полностью развиваться и становиться взрослыми после фиктивных инъекций. Когда было выбрано соединение между последними стернитами брюшка (рис. 2А), более 95% пчел смогли завершить развитие после инокуляции PBS.Эта область очень мягкая, что позволяет игле легко вводить иглу с минимальным физическим повреждением куколок. Кроме того, нимфы Varroa destructor часто наблюдались в том же регионе, когда куколки готовились к прививкам, что позволяет предположить, что этот район является привлекательным местом для кормления.
В процессе стандартизации оба контроля без инокуляции (W / O) и пчелы с введенным буфером PBS (PBS) развивались нормально (рис. 1A), достигая кульминации в полном развитии через 144 часа (рис. 1C).Пчелы, инокулированные IAPV, демонстрировали сильную, но изменчивую симптоматику с течением времени (рис. 1A и 1B), подавляли метаморфоз и, в конечном итоге, смерть. Симптомы варьировались от полного прекращения развития без видимых признаков заболевания (рис. 1B-1), быстрого потемнения частей тела (рис. 1B-3 и 1B-4), одновременного потемнения и задержки развития (рис. 1B-5) до очевидно нормальное развитие (рис. 1B – 2) с возможной внезапной смертью. Титр IAPV увеличился у всех инокулированных пчел, но не наблюдали корреляции между симптоматикой и титром вируса, определенным с помощью RT-qPCR в конце эксперимента.
Вариация чувствительности к IAPV
В эксперименте изучали инфекции IAPV у куколок из двух неродственных колоний, чтобы сравнить эти две колонии и патрилины внутри колоний. Анализы RT-qPCR не показали первоначальных доказательств инфекции IAPV ни в одной из экспериментальных колоний, и даже исходный посевной материал был ниже нашего предела обнаружения (рис. 3). Двухфакторный дисперсионный анализ показал, что две колонии значительно различались по накоплению вирусных титров (F ^Colony _(1,104) = 5.3, Р = 0,023; F ^Время _(3,104) = 69,7, P <0,001; F ^{Взаимодействие} _(3,104) = 8,0, P <0,001). В частности, значительная разница между колониями была обнаружена через 20 часов (F ^Colony _(1,42) = 39,2, P <0,001; Рисунок 3). Апостериорные тесты также выявили значительную разницу между всеми временными точками, за исключением периода от 0 до 5 часов. Внутри колоний некоторые различия по патрилину были предполагаемыми (рисунок S1), но не значимыми после поправки Бонферрони (Колония 1: F ^{20 ч} _(2,12) = 4.5, p _{нескорректированная} = 0,025; F ^{48 ч} _(3,14) = 0,2, p _{нескорректированный} = 0,917; Колония 2: F ^{20 h} _(1,12) = 0,5, p _{нескорректированный} = 0,476; F ^{48 ч} _(5,18) = 2,2, p _{нескорректированный} = 0,094). DWV был обнаружен в 55 образцах, и на его титры значительно повлияло только лечение (лечение F ₍₂₁₈₁₎ = 4,5, p = 0,012, с взаимодействием между лечением и временем (лечение F ^{× время} _(6,181) = 4.5, p <0,001): лечение повлияло только на титры DWV через 20 и 48 часов, и апостериорные тесты показали, что индивидуумы, которым вводили PBS, имели значительно более высокие титры DWV, чем пчелы, инокулированные W / O и IAPV (рис. 4).
Рис. 3. Увеличение титра IAPV у пчел, инокулированных IAPV, из двух исследованных колоний позволяет предположить, что источник колонии влияет на кинетику репликации IAPV.
От первоначально неопределяемых уровней IAPV увеличивается более постепенно во второй колонии, что приводит к значительно более низким титрам через 20 часов после инокуляции, чем в первой колонии.Каждая полоса представляет собой экспериментальную группу пчел, прошедших индивидуальную оценку. Столбцы с разными буквами значительно различаются (апостериорные тесты ANOVA, p <0,001).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0073429.g003
Рис. 4. Уровни транскриптов показали влияние колоний, времени и лечения.
Наблюдаемые паттерны экспрессии указывают на то, что инфекция IAPV нарушает биогенез рибосом и другие клеточные функции. Пчелы колонии 01, которым вводили IAPV, быстро накапливали IAPV и демонстрировали почти повсеместную активацию генов.Общая картина более сложна в колонии 02, возможно, из-за более постепенного накопления IAPV и смешанных эффектов инфекции DWV. Средняя полоса показывает медианное значение, а прямоугольники — 25–75 процентилей; планки ошибок — это 10–90 процентилей, а выбросы обозначены точками. Значимость апостериорных сравнений обозначена * (<0,05), ** (<0,01) или *** (<0,001).
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0073429.g004
Симптоматические различия также наблюдались между двумя колониями (Таблица 1).Как правило, куколки из колонии 1 демонстрировали некоторые признаки завершения развития, о чем свидетельствует наличие коричневой пигментации глаз и затемнение живота. Куколки из Колонии 2 демонстрировали более сильное истощение: у некоторых особей наблюдалась пигментация глаз или потемнение живота. Корреляции между титром вируса и симптоматикой не обнаружено.
Транскрипционные последствия инфекции IAPV
Трехфакторный дисперсионный анализ ANOVA выявил значительный лечебный эффект на экспрессию всех шести генов (таблица 2).В целом, экспрессия генов также различалась в разные моменты времени, но различия для актина не были значительными. Напротив, две колонии различались только экспрессией актина (таблица 2). Апостериорные тесты основных лечебных эффектов показали значительно более высокую экспрессию гена у пчел, инокулированных IAPV, по сравнению с двумя контрольными группами для актина, 28S рРНК и mGST1. Напротив, 18S рРНК была значительно меньше экспрессирована у пчел, инокулированных IAPV, чем в обеих контрольных группах. Для гистона h3A была обнаружена значительно более низкая экспрессия в группе, не получавшей лечения, чем в группе, получавшей PBS и вирус, и все группы лечения значительно различались по экспрессии RPS5 в следующем порядке: «контрольная группа» <«PBS-инъекция» <«IAPV. -внедренный ».Результаты апостериорного тестирования временных эффектов были более сложными (Результаты S1).
Модели ANOVA также выявили множество важных условий взаимодействия (результаты S1), указывающих на временные и специфичные для колонии эффекты лечения (рис. 4). Полная модель ANOVA объясняет большую часть вариаций экспрессии гена для RPS5 (65,8%), за которым следуют актин (62,1%), mGST (40,7%), h3A (38,0%), 18S рРНК (35,0%) и 28S рРНК (18,9%). %). Дополнительно выполненные ANCOVA показали, что все ассоциации между IAPV и транскриптами также были значительными, независимо от лечения или времени (таблица 2).Никаких корреляций между экспрессией генов и симптоматикой обнаружено не было.
Обсуждение
Вирусы медоносных пчел играют важную роль в недавнем ухудшении здоровья медоносных пчел [8], [9], [16], [17], [50], [51], но очень мало известно о том, как вирус инфекции повреждают медоносных пчел. Разработанная модель исследования является важным шагом к столь необходимым механистическим исследованиям вирусов медоносных пчел. С одной стороны, куколки медоносных пчел не требуют кормления и могут легко содержаться в лабораторных условиях до полного развития и развития взрослых особей.Они очень важны при патологии нескольких вирусов [16]. С другой стороны, IAPV оказался отличным выбором, поскольку его преимущественная репликация в куколках [25] позволяет получать инокулят, который практически не содержит заражающих вирусов. Кроме того, IAPV имеет отношение к здоровью пчел [8], но не является повсеместным в популяции пчел, что позволяет проводить эксперименты с пчелами, свободными от IAPV.
Наш эксперимент показал значительные различия в репликации IAPV между двумя исследованными колониями, а также предположил, что отцовские вариации, хотя небольшие размеры выборки на патрилин исключали значимость после поправки на множественное тестирование.Факторы окружающей среды не следует игнорировать и могут включать в себя уровни прополиса [52] и пестицидов [53] в колониях или питание личинок [54]. Колония 01 показала более резкое увеличение титров вируса, тогда как IAPV увеличивалось более постепенно в колонии 02. Однако относительная устойчивость пчел из колонии 02 только задерживала накопление IAPV, и титры IAPV неизменно были высокими у куколок через 48 часов. Выявление генотипических вариаций восприимчивости к вирусу улучшило бы перспективы селективного разведения для улучшения здоровья медоносных пчел.В любом случае наше исследование демонстрирует значительную неоднородность амплификации вируса и ответов генов (см. Ниже), подчеркивая важность стандартизации в исследованиях здоровья медоносных пчел.
Между двумя колониями наблюдались отчетливые картины симптомов (Таблица 01). Неясно, является ли вызванное вирусом повреждение тканей и некроз или меланизация как часть иммунного ответа ответственными за наблюдаемое потемнение. Меланизация является ключевым компонентом иммунного ответа насекомых и активна в противовирусном иммунитете [55], [56], [57].Предполагается, что меланизация будет коррелировать с устойчивостью к IAPV, в отличие от наших наблюдений за потемнением личинок. Следовательно, некроз или другие формы гибели клеток являются более вероятным объяснением потемнения тканей [58].
Количественная оценка реакции экспрессии генов на инфекцию IAPV в куколке медоносной пчелы в соответствии со стандартными протоколами была сложной, поскольку инфекция IAPV значительно влияла на все исследованные эталонные гены во всех экспериментах (предварительные эксперименты S1 и рисунок 4), что исключает их значимое включение в анализ ΔCt или ΔΔCt [ 48].Хотя относительная количественная оценка имеет значительные преимущества и используется почти повсеместно, она зависит от соответствующих ссылок [59], которые не были доступны для нашего исследования. Поэтому мы полагались на абсолютную количественную оценку после стандартизации количества РНК в каждом эксперименте. Значения Ct были преобразованы в другую меру абсолютного количественного определения (количество копий) для IAPV путем сравнения со стандартной кривой. Различия в синтезе кДНК или другие неравенства между образцами могли внести некоторую экспериментальную ошибку.Однако маловероятно, что технические ошибки являются причиной наблюдаемых существенных различий между нашими экспериментальными методами лечения, особенно с учетом согласованности между нашими тремя отдельными экспериментами. Таким образом, мы пришли к выводу, что значения Ct являются наиболее подходящими для нашего исследования, а абсолютная количественная оценка необходима при изучении транскрипционной реакции на вирусные инфекции у медоносных пчел. В целом следует проявлять осторожность при интерпретации паттернов относительной экспрессии генов в отношении вирусных инфекций у медоносных пчел и других организмов [60], [61].
Исследование множественных референсных генов подтвердило ранее сделанные выводы о том, что IAPV-инфекция значительно влияет на основные клеточные пути (предварительные эксперименты S1). Интересно, что транскрипция многих генов у пчел, которым вводили PBS, была промежуточной между отрицательным контролем и группой IAPV, демонстрируя эффект самого ранения. В целом, экспрессия всех генов зависела от времени, хотя для Актина этот эффект не был значимым в полной факторной модели.Напротив, актин был единственным геном, который демонстрировал общую разницу в экспрессии между двумя колониями. Более того, все гены были в значительной степени связаны с титрами IAPV, независимо от эффектов лечения. В целом, все проанализированные гены не соответствовали критериям надежного эталонного гена и вместо этого указывали на глубокое нарушение фундаментальных клеточных процессов IAPV. Помимо эффектов лечения, экспрессия предполагаемых эталонных генов также изменялась со временем или зависела от генотипа.Эта транскрипционная нестабильность предполагаемых эталонных генов может представлять общий недостаток куколки как исследуемой системы, поскольку продолжающийся метаморфоз предположительно затрагивает множество генов, независимо от каких-либо лечебных эффектов [62].
Биологическая интерпретация основных эффектов колонии-хозяина, времени и лечения осложняется многочисленными наблюдаемыми значительными эффектами взаимодействия. Для актина все взаимодействия между тремя факторами были значимыми, а для 28S рРНК значимых взаимодействий не наблюдалось.Остальные четыре гена показали значительное трехстороннее взаимодействие и одно или два двухсторонних взаимодействия. Взаимодействие между временем и лечением неудивительно для любой записи, потому что эффекты лечения проявляются только на более поздних стадиях эксперимента. Однако взаимодействие между колонией и лечением подтверждает вывод о том, что исходная колония значительно влияет на взаимодействие между IAPV и ее хозяином. Пчелы из более устойчивой колонии 02 показали подавление 18S рРНК при инъекции IAPV.Напротив, транскрипт был увеличен инъекцией IAPV пчелам из более восприимчивой колонии 01. Точно так же для большинства других транскриптов самая сильная активация IAPV произошла через 20 часов в колонии 01, но через 48 часов в колонии 02. Дальнейшие эксперименты необходимы для определения причинно-следственных связей между генотипом хозяина и окружающей средой, паттернами экспрессии генов и репликацией IAPV.
Наблюдаемые паттерны экспрессии генов могут быть следствием вирусных манипуляций с клетками для увеличения репликации вируса или представления компенсаторных ответов клеток на инфекцию IAPV.Обычно пикорнавирусы экспрессируют протеазу, которая расщепляет фактор инициатора каркаса eIF4G. Этот процесс ингибирует трансляцию клеточных пептидов, опосредованную 5′-кэпом, и перенаправляет аппарат клеточной трансляции на вирусные мРНК, которые зависят от трансляции, опосредованной внутренними сайтами рибосомного входа (IRES) [30], [31]. Опосредованное протеазой отключение клеточной трансляции широко распространено [63], [64], и до сих пор гомологи гена протеазы были идентифицированы у всех представителей дицистровирусов [30].Однако прямые доказательства ингибирования трансляции, которые усиливают транскрипционную активность через петли обратной связи, пока отсутствуют для всех вирусов медоносных пчел и пикорнавирусов насекомых в целом. RPS5 является ключевым компонентом распознавания IRES в семействе дицистровирусов [65], [66], [67]. Повышающая регуляция этого гена напрямую способствует репликации вируса, предполагая, что сильная и последовательная повышающая регуляция RPS5 может быть непосредственно индуцирована IAPV. Однако широко распространенный транскрипционный ответ на IAPV также предполагает, что клетка может реагировать на недостаток определенных клеточных компонентов увеличением их транскрипции.Повышение регуляции актина, MGST1 и гистона h3A в большинстве экспериментальных групп предполагает далеко идущий, хотя и изменчивый, ответ в ряде основных клеточных процессов в дополнение к нарушению пути биогенеза рибосом, обсуждаемого ниже. Необходимы дополнительные исследования, чтобы понять эти процессы и их вариабельность среди сред и генотипов.
Три компонента изучаемого пути биогенеза рибосом показали разные ответы на инъекцию IAPV. В то время как транскрипты 28S рРНК и RPS5 неизменно увеличивались после репликации IAPV (через 20 и 48 часов после инъекции), транскрипты 18S рРНК снижались в колонии 02 в оба момента времени и только увеличивались в более восприимчивой колонии 01 в первый момент времени. .Причина этих различий неясна, особенно потому, что транскрипты 18S рРНК и 28S рРНК происходят из мРНК полицистронного предшественника [68]. Однако регулируемый баланс между малыми и большими рибосомными субъединицами [69] контролируется независимыми путями созревания [70], и IAPV предположительно влияет на эти пути по-разному. Различия между колониями могут указывать на то, что более устойчивые люди могли либо сопротивляться транскрипционным манипуляциям со стороны IAPV, либо выделять больше клеточных ресурсов на немедленные иммунные функции вместо рибосомного биогенеза.В соответствии с этой интерпретацией паттерны экспрессии генов сходились между двумя колониями в более поздний момент времени.
Биогенез рибосом — очень сложный и энергетически затратный путь, который важен для всех эукариотических клеток [70]. Он сильно регулируется и интегрирован с другими клеточными функциями, такими как передача сигналов p53, а нарушение регуляции биосинтеза рибосом связано с онкогенезом [71] и апоптозом [72]. Апоптоз — это широко распространенный клеточный ответ на вирусную инфекцию [73], который может объяснить некоторые наблюдаемые различия в симптоматике IAPV.С другой стороны, вирусы также могут напрямую вмешиваться в путь биогенеза рибосом посредством либо повышающей, либо понижающей регуляции [74], [75]. В любом случае, наш результат нарушения рибосомного биогенеза подтверждает важное исследование транскриптов в кишечнике медоносной пчелы с помощью микроматрицы, которое связывает пикорнавирусы и обилие транскриптов 28S рРНК с расстройством коллапса колонии [9].
Инъекция PBS служила экспериментальным контролем для учета эффекта ранения во время инокуляции IAPV.Для всех генов наблюдаемые паттерны транскрипции пчел, которым вводили PBS, были промежуточными между группой, получавшей инъекцию IAPV, и группой отрицательного контроля. Это наблюдение может предполагать, что подобное нарушение основных клеточных функций происходит в ответ на ранение и клеточную травму, что приводит к глубоким изменениям на уровне транскриптома [76]. Однако наши данные показывают также увеличение титров DWV у куколок, которым вводили PBS, с течением времени и по сравнению с обеими другими группами лечения. Повышенные титры DWV в ответ на ранение наблюдались и раньше [77].Увеличение количества другого пикорноподобного вируса могло вызвать реакции у пчел, которым вводили PBS, которые были аналогичны инъекции IAPV, подтверждая аналогичный характер экспрессии генов, наблюдаемый между группой PBS и пчелами, инъецированными IAPV, по сравнению с группами отрицательного контроля. В отличие от пчел, которым вводили PBS, пчелы, которым вводили IAPV, не показывали увеличения титров DWV, что позволяет предположить, что IAPV или клеточные ответы на IAPV мешают репликации DWV [78].
Таким образом, это исследование представляет важную модельную систему для продвижения механистических исследований взаимодействия вируса с хозяином у насекомых.Особенно важно изучить вирусы медоносных пчел и их роль в ухудшении здоровья медоносных пчел. Результаты демонстрируют значительную изменчивость и указывают источники этой изменчивости. Транскрипционный анализ показывает глубокие коррелированные нарушения основных клеточных функций и ставит под сомнение использование типичных эталонных генов в этой системе. Исследованные реакции на прививку IAPV медоносным пчелам кажутся типичными для пикорнавирусных инфекций и представляют собой первый шаг к пониманию базовой биологии этого важного вируса медоносных пчел.Необходимы более подробные исследования, чтобы управлять вирусом и хозяином и оценивать реакцию хозяина на IAPV на системном уровне.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить членов Исследовательской лаборатории пчел Министерства сельского хозяйства США в Белтсвилле: доктора Мигеля Корона за разработку праймера Histone h3A, а также г-на Энди Улсамера и г-жу Мишель Гамильтон за их техническую поддержку. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить всех членов группы UNCG по социальным насекомым за их предложения и поддержку.
Вклад авторов
Задумал и спроектировал эксперименты: HFB.Проведены эксперименты: HFB MSF CM. Проанализированы данные: HFB OR JE. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: HFB OR DT DL YC JE JP MS. Написал статью: HFB OR.
Ссылки
1. vanEngelsdorp D, Hayes Jr J, Underwood RM, Pettis J (2008) Обзор потерь колоний медоносных пчел в США, осень 2007 — весна 2008. PLoS ONE 3: e4071.
2. Эллис Дж. Д., Эванс Дж. Д., Петтис Дж. С. (2010) Потери колоний, управляемое сокращение популяции колоний и расстройство распада колоний в Соединенных Штатах.Журнал исследований пчеловодства 49: 134–136.
3. Эванс Дж. Д., Шварц Р. С. (2011) Пчелы поставлены на колени: микробы, влияющие на здоровье медоносных пчел. Trends Microbiol 19: 614–620.
4. Корнман Р.С., Тарпи Д.Р., Чен Й., Джеффрис Л., Лопес Д. и др. (2012) Патогенные сети в разрушающихся семьях медоносных пчел. PLoS One 7: e43562.
5. Нойманн П., Каррек Н.Л. (2010) Потери пчелиных семей. Журнал исследований пчеловодства 49: 1–6.
6.vanEngelsdorp D, Meixner MD (2010) Исторический обзор управляемых популяций медоносных пчел в Европе и США и факторов, которые могут на них повлиять. Журнал патологии беспозвоночных 103: S80 – S95.
7. ван Энгельсдорп Д., Эванс Дж. Д., Сэгерман С., Маллин С., Хаубрюге Е. и др. (2009) Расстройство коллапса колонии: описательное исследование. PLoS ONE 4: e6481.
8. Кокс-Фостер Д.Л., Конлан С., Холмс Е.С., Паласиос Г., Эванс Д.Д. и др. (2007) Метагеномное исследование микробов при коллапсе колонии медоносных пчел.Наука 318: 283–287.
9. Johnson RM, Evans JD, Robinson GE, Berenbaum MR (2009) Изменения в изобилии транскриптов, связанные с расстройством коллапса колонии у медоносных пчел (Apis mellifera). Proc Natl Acad Sci U S A 106: 14790–14795.
10. Genersch E, von der Ohe W., Kaatz H, Schroeder A, Otten C, et al. (2010) Немецкий проект мониторинга пчел: долгосрочное исследование для понимания периодически высоких потерь семей медоносных пчел зимой. Apidologie 41: 332–352.
11.Нацци Ф., Браун С.П., Анносиа Д., Дель Пикколо Ф., Ди Приско Дж. И др. (2012) Синергетические взаимодействия паразитов и патогенов, опосредованные иммунитетом хозяина, могут привести к коллапсу колоний медоносных пчел. PLoS Pathog 8: e1002735.
12. Martin SJ, Highfield AC, Brettell L, Villalobos EM, Budge GE и др. (2012) Глобальный вирусный ландшафт медоносных пчел изменен паразитическим клещом. Наука 336: 1304–1306.
13. Андерсон Д.Л., Труман JWH (2000) Varroa jacobsoni (Acari: Varroidae) — это несколько видов.Экспериментальная и прикладная акарология 24: 165–189.
14. Розенкранц П., Аумайер П., Зигельманн Б. (2010) Биология и борьба с Varroa destructor . J Invertebr Pathol 103 Дополнение 1S96–119.
15. Бокинг О., Генерш Э. (2008) Варрооз — продолжающийся кризис в пчеловодстве. Журнал Fur Verbraucherschutz Und Lebensmittelsicherheit-Journal of Consumer Protection and Food Safety 3: 221–228.
16. Genersch E, Aubert M (2010) Новые и вновь появляющиеся вирусы медоносной пчелы ( Apis mellifera L.). Ветеринарные исследования 41.
17. de MirandaJR, Genersch E (2010) Вирус деформированного крыла. Журнал патологии беспозвоночных 103: S48 – S61.
18. Genersch E (2010) Патология медоносных пчел: современные угрозы медоносным пчелам и пчеловодству. Прикладная микробиология и биотехнология 87: 87–97.
19. Hails RS, Ball BV, Genersch E (2008) Стратегии заражения вирусами насекомых. В: Обер М., Болл Б., Фрис I., Мориц Р.Ф., Милани Н. и др., Редакторы. Вирусология и медоносная пчела: Европейская комиссия.255–276.
20. Allen MF, Ball BV, White RF, Antoniw JF (1986) Обнаружение вируса острого паралича в Varroa jacobsoni с помощью простого непрямого ELISA. Журнал исследований пчеловодства 25: 100–105.
21. Бейли Л., Болл Б.В., Перри Дж. Н. (1981) Распространенность вирусов медоносных пчел в Великобритании. Анналы прикладной биологии 97: 109–118.
22. Ball B (1996) Вирусы медоносных пчел: повод для беспокойства? Пчелиный мир 77: 117–119.
23. Бейли Л., Гиббс А. Дж. (1964) Острая инфекция пчел вирусом паралича. Журнал патологии насекомых 6: 395– &.
24. Бейли Л., Болл Б.В. (1991) Патология медоносных пчел. Лондон, Великобритания: Academic Press.
25. Маори Э., Лави С., Мозес-Кох Р., Гантман И., Перец И. и др. (2007) Выделение и характеристика израильского вируса острого паралича, дицистровируса, поражающего медоносных пчел в Израиле: доказательства разнообразия за счет внутри- и межвидовой рекомбинации.J Gen Virol 88: 3428–3438.
26. Бейли Л. (1967) Вирус острого пчелиного паралича у взрослых медоносных пчел, которым вводили вирус Sacbrood. Вирусология 33: 368– &.
27. Azzami K, Ritter W, Tautz J, Beier H (2012) Заражение медоносных пчел вирусом острого паралича пчел не вызывает гуморальных или клеточных иммунных реакций. Arch Virol 157: 689–702.
28. Чен Ю.П., Сиде Р. (2007) Вирусы медоносных пчел. Достижения в вирусных исследованиях, Том 70 70: 33–80.
29. Runckel C, Flenniken ML, Engel JC, Ruby JG, Ganem D, et al .. (2011) Временной анализ микробиома медоносной пчелы показывает четыре новых вируса и сезонную распространенность известных вирусов, Nosema и Crithidia . PLoS One 6.
30. Боннинг BC, Миллер В.А. (2010) Дицистровирусы. Ежегодный обзор энтомологии 55: 129–150.
31. Rueckert RR, Fields BN, Knipe DM, Howley PM (1996) Picornaviridae: вирусы и их репликация.В: Филдс Б.Н., Книп Д.М., Хоули П.М., редакторы. Области вирусологии. 3-е изд. Филадельфия: Lippincott-Raven Publishers. 609–654.
32. Racaniello V (2001) Picornaviridae: вирусы и их репликация. В: Книп Д.М., Хоули П.М., редакторы. Области вирусологии. 4-е изд. Филадельфия: Липпинкотт Уильямс и Уилкинс. 685–722.
33. Маори Э., Палди Н., Шафир С., Калев Х., Цур Э и др. (2009) IAPV, вирус, поражающий пчел, связанный с расстройством коллапса колонии, может подавляться приемом дцРНК.Молекулярная биология насекомых 18: 55–60.
34. Скотти П.Д. (1975) Вирус паралича сверчка реплицируется в культивируемых клетках дрозофилы. Интервирология 6: 333–342.
35. Мур Н.Ф., Кернс А., Пуллин JSK (1980) Характеристика полипептидов, индуцированных вирусом паралича сверчков, в клетках Drosophila . Журнал вирусологии 33: 1–9.
36. Chevin A, Schurr F, Blanchard P, Thiery R, Ribiere M (2012) Экспериментальное заражение медоносной пчелы ( Apis mellifera L.) с вирусом хронического паралича пчел (CBPV): инфекционность голых РНК CBPV. Исследование вирусов 167: 173–178.
37. Boncristiani HF, Di Prisco G, Pettis JS, Hamilton M, Chen YP (2009) Молекулярные подходы к анализу репликации вируса деформированного крыла и патогенеза у медоносной пчелы Apis mellifera. Журнал вирусологии 6.
38. Ди Приско Дж., Пеннаккио Ф., Каприо Е., Бонкристиани Х. Ф., Эванс Дж. Д. и др. (2011) Varroa destructor — эффективный переносчик израильского вируса острого паралича медоносной пчелы Apis mellifera .Журнал общей вирусологии 92: 151–155.
39. Evans JD (2006) Beepath: упорядоченный набор количественной ПЦР для изучения иммунитета и болезней медоносных пчел. J Invertebr Pathol 93: 135–139.
40. Эванс Дж. Д., Аронштейн К., Чен Ю. П., Хетру С., Имлер Дж. Л. и др. (2006) Иммунные пути и защитные механизмы у медоносных пчел Apis mellifera . Молекулярная биология насекомых 15: 645–656.
41. Бонкристиани Х., Андервуд Р., Шварц Р., Эванс Дж. Д., Петтис Дж. И др.(2012) Прямое влияние акарицидов на патогенную нагрузку и уровни экспрессии генов у медоносных пчел Apis mellifera . J. Физиология насекомых 58: 613–620.
42. Jeong YJ, Choi HW, Shin HS, Cui XS, Kim NH и др. (2005) Оптимизация методов ОТ-ПЦР в реальном времени для анализа экспрессии генов в яйцах мышей и преимплантационных эмбрионах. Молекулярное воспроизводство и развитие 71: 284–289.
43. Уолш П.С., Мецгер Д.А., Хигучи Р. (1991) Chelex-100 как среда для простой экстракции ДНК для типирования на основе ПЦР из судебно-медицинских материалов.Биотехники 10: 506–513.
44. Tarpy DR, Caren JR, Delaney DA, Sammataro D, Finley J и др. (2010) Частота спариваний африканизированных медоносных пчел на юго-западе США. Журнал исследований пчеловодства 49: 302–310.
45. Делани Д.А., Келлер Дж. Дж., Карен Дж. Р., Тарпи Д. Р. (2011) Физическое качество, осеменение и репродуктивность маток медоносных пчел ( Apis mellifera L.). Апидология 42: 1–13.
46. Ван Дж. (2004) Реконструкция родства по генетическим данным с опечатками.Генетика 166: 1963–1979.
47. Ливак К.Дж., Шмитген Т.Д. (2001) Анализ данных относительной экспрессии генов с использованием количественной ПЦР в реальном времени и метода 2 (T) (- Delta Delta C). Методы 25: 402–408.
48. Шмитген Т.Д., Ливак К.Дж. (2008) Анализ данных ПЦР в реальном времени с помощью сравнительного метода C-T. Протоколы природы 3: 1101–1108.
49. Чен Ю.П., Чжао Ю., Хаммонд Дж., Хсу Х.Т., Эванс Дж. И др. (2004) Множественные вирусные инфекции у медоносных пчел и расхождение генома вирусов медоносных пчел.Журнал патологии беспозвоночных 87: 84–93.
50. Икбал Дж., Мюллер У. (2007) Вирусная инфекция вызывает определенные трудности в обучении у пчел-собирателей. Труды Королевского общества B-биологических наук 274: 1517–1521.
51. Grabensteiner E, Nowotny N (2001) Вирусные инфекции медоносной пчелы ( Apis mellifera ). Wiener Tierarztliche Monatsschrift 88: 79–87.
52. Simone M, Evans JD, Spivak M (2009) Сбор смолы и социальный иммунитет у медоносных пчел.Эволюция 63: 3016–3022.
53. Pettis JS, vanEngelsdorp D, Johnson J, Dively G (2012) Воздействие пестицидов на медоносных пчел приводит к повышению уровня кишечного патогена Nosema . Naturwissenschaften 99: 153–158.
54. Alaux C, Dantec C, Parrinello H, Le Conte Y (2011) Нутригеномика у медоносных пчел: цифровой анализ экспрессии генов питательных эффектов пыльцы на здоровых пчелах и пчелах, зараженных варроа. БМС Геномикс 12.
55. Lemaitre B, Hoffmann J (2007) Защита хозяина Drosophila melanogaster .Ежегодный обзор иммунологии 25: 697–743.
56. Ourth DD, Renis HE (1993) Противовирусная реакция меланизации гемолимфы Heliothis virescens против ДНК и РНК вирусов in vitro. Сравнительная биохимия и физиология B-биохимия и молекулярная биология 105: 719–723.
57. Shelby KS, Popham HJ (2006) Плазменная фенолоксидаза личинок табачного червя Heliothis virescens является вирулицидным. J Insect Sci 6: 1–12.
58. Клем Р.Дж. (2007) Бакуловирусы и апоптоз: разнообразие генов и ответов.Текущие цели в отношении лекарств 8: 1069–1074.
59. Бастин С.А., Бенес В., Гарсон Дж. А., Хеллеманс Дж., Хаггетт Дж. И др. (2009) Рекомендации MIQE: минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени. Clin Chem 55: 611–622.
60. Radonic A, Thulke S, Bae HG, Muller MA, Siegert W. и др. (2005) Выбор эталонного гена для количественного ПЦР-анализа в реальном времени в инфицированных вирусом клетках: вирус короны SARS, вирус желтой лихорадки, вирус герпеса человека-6, вирус оспы верблюда и инфекции цитомегаловируса.Журнал вирусологии 2: 7.
61. Lilly ST, Drummond RSM, Pearson MN, MacDiarmid RM (2011) Идентификация и проверка эталонных генов для нормализации транскриптов из зараженного вирусом Arabidopsis thaliana. Молекулярные взаимодействия растений и микробов 24: 294–304.
62. Graveley B (2010) Онтогенетический транскриптом Drosophila melanogaster . Геномная биология 11.
63. Das S, Dasgupta A (1993) Идентификация сайта расщепления и детерминант, необходимых для 3c-катализированного полиовирусом расщепления человеческого Tata-связывающего фактора транскрипции Tbp.Журнал вирусологии 67: 3326–3331.
64. Clark ME, Hammerle T, Wimmer E, Dasgupta A (1991) Полиовирусная протеиназа-3c превращает активную форму фактора транскрипции Iiic в неактивную форму — механизм ингибирования транскрипции полимеразы-III клетки-хозяина полиовирусом. Embo Journal 10: 2941–2947.
65. Pfingsten JS, Costantino DA, Kieft JS (2006) Структурная основа рекрутирования и манипуляции рибосомами вирусной РНК IRES. Наука 314: 1450–1454.
66. Nishiyama T, Yamamoto H, Uchiumi T, Nakashima N (2007) Эукариотический рибосомный белок RPS25 взаимодействует с консервативной областью петли в межгенном внутреннем сайте входа в рибосомы дицистровирусов. Исследование нуклеиновых кислот 35: 1514–1521.
67. Спан CMT, Ян Э., Малдер А., Грассуччи Р.А., Сарнов П. и др. (2004) Крио-ЭМ визуализация вирусного внутреннего сайта входа в рибосому, связанного с рибосомами человека: IRES функционирует как фактор трансляции на основе РНК. Cell 118: 465–475.
68. Gillespie JJ, Johnston JS, Cannone JJ, Gutell RR (2006) Характеристики ядерных (18S, 5.8S, 28S и 5S) и митохондриальных (12S и 16S) генов рРНК Apis mellifera (Insecta: Hymenoptera): структура, организация, и ретротранспортабельные элементы. Молекулярная биология насекомых 15: 657–686.
69. Bachand F, Lackner DH, Bahler J, Silver PA (2006) Ауторегуляция биосинтеза рибосом с помощью трансляционной реакции у делящихся дрожжей. Молекулярная и клеточная биология 26: 1731–1742.
70. Granneman S, Baserga SJ (2004) Биогенез рибосом: выступов и процессинга РНК. Экспериментальные исследования клеток 296: 43–50.
71. Montanaro L, Trere D, Derenzini M (2012) Изменения в биогенезе рибосом могут вызывать рак, подавляя потенциал супрессора клеточной опухоли. Biochimica Et Biophysica Acta — Обзоры рака 1825: 101–110.
72. Morgado-Palacin L, Llanos S, Serrano M (2012) Рибосомный стресс индуцирует L11- и p53-зависимый апоптоз в плюрипотентных стволовых клетках мышей.Клеточный цикл 11: 503–510.
73. Hardwick JM (2001) Апоптоз в вирусном патогенезе. Cell Death Differ 8: 109–110.
74. Чо В.К., Ю.Дж., Ли К.М., Сон М., Мин К. и др .. (2012) Профилирование экспрессии по всему геному показывает репрограммирование транскрипции в Fusarium graminearum инфекцией вируса 1-DK21 Fusarium graminearum. БМС Геномикс 13.
75. Groppo R, Palmenberg AC (2007) Белок кардиовируса 2A ассоциируется с 40S, но не 80S субъединицами рибосомы во время инфекции.Журнал вирусологии 81: 13067–13074.
76. Шоу Т., Мартин П. (2009) Эпигенетическое перепрограммирование во время заживления ран: потеря поликомб-опосредованного сайленсинга может способствовать усилению регуляции генов репарации. Embo Reports 10: 881–886.
77. Кустер Р. (2012) Уровни экспрессии иммунных генов у развивающихся рабочих Apis mellifera в ответ на время репродукции и уровень заражения паразитическим клещом Varroa destructor . Гринсборо: Университет Северной Каролины.71 с.
78. Охоснегрос С., Беренвинкель Н., Антал Т., Новак М.А., Эскармис С. и др. (2010) Динамика конкуренции-колонизации в РНК-вирусе. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки 107: 2108–2112.
ULTIMATE Uncapping System BEE SMART DESIGNS Извлечение меда БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА! Товары для животноводства Пчеловодство westernfertility.com
ULTIMATE Uncapping System BEE SMART DESIGNS Извлечение меда БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА!
(Не отбеливать) Уникальный и крутой дизайн с трехмерным рисунком-100% без выцветания.Чтобы выслушать ваши опасения и создать комфортное, Примечание: Пожалуйста, измерьте длину стопы вашего ребенка перед заказом, Купите переднюю стойку Monroe 72368 в сборе: стойки — ✓ Возможна БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при подходящих покупках, прожектор 2007 mack pinnacle средней высоты для спального места на крыше — 6 дюймов — галоген мощностью 100 Вт — сторона пассажира с установочным комплектом: оператор управляет вращением и подъемом прожектора за пределами транспортного средства, поворачивая ручку внутри транспортного средства, дата впервые указана: 29 октября.эта смесь мериноса и нейлона может похвастаться легкой амортизацией под стопой. Купите футбольные бутсы Nike Kids Tiempo Ligera IV FG и другие футбольные бутсы в. Если этот предмет находится у вас более 7 дней, купите однотонную юбку без рукавов с цветами на плечах Waymine для новорожденных. Платья для вечеринок и другая одежда для игр в горячем примечании: пожалуйста, прочтите таблицу размеров в описании продукта перед заказом. Большой США = Китай 2X-Большой: Длина: 27. Купить женский шерстяной цилиндр Dantiya с широкими полями, зимняя винтажная панама, шляпа Fedora, шерстяная кепка: покупайте модные бренды Fedoras в ✓ БЕСПЛАТНОЙ ДОСТАВКЕ, возможен возврат при определенных покупках, ULTIMATE Uncapping System BEE SMART DESIGNS Добыча меда БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА! .Он отличается сексуальным глубоким v-образным вырезом и общим элегантным зеленым принтом в виде листьев пальмы. Сделайте смелое модное заявление с этими удивительными каблуками от. Коллекция состоит из широкой цветовой гаммы, прочной и вдвое меньшей массы стальной ленты. Эта переходная муфта класса 0 соответствует стандартам ANSI B1. Включает 1-дюймовую серебряную светоотражающую ленту с параллельным узором и 1 внутренний карман, позволяющий безопасно хранить мелкие предметы, такие как телефоны. Наш широкий выбор имеет право на бесплатную доставку и бесплатный возврат, LEGO Simpsons 71006 The Simpsons House: игрушки и игры,: изготовленные на заказ дверные наклейки Виниловые наклейки разных размеров, пасхальное воскресенье, служба, время сообщений, праздники и события, пасхальное воскресное служение, наклейки для багажа и бампера для автомобилей, синие, 54X36 дюймов, набор из 2: офисные товары, толстовка Dragon Energy в магазине мужской одежды, стиль: элегантный синий браслет из стерлингового серебра с простым браслетом. но очаровательный дизайн: ▏: ▏: ▏: ▏ Путешествие налегке ╳ Люинчи: ▏: ▏: ▏: ▏.Красивая Богиня вырезана вручную из цельного куска разноцветного амазонита. ULTIMATE Uncapping System BEE SMART DESIGNS Извлечение меда БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА! . Стебли обернуты черной атласной лентой, украшенной брошью из искусственных страз. Это очень привлекательный предмет, который станет прекрасным подарком. Смелая черно-белая полосатая лента с блестящими сердцами обвивает этот венок в форме сердца. Он украшен множеством замысловатых рельефных завитков, а также толстой позолоченной каймой. Свадебная гостевая книга в деревенском стиле — идеальная идея для свадебных церемоний. ФОРМА: — ЯСНОСТЬ круглой формы: — Прозрачная обработка: — Натуральный ЛИСТИНГОВЫЙ КОД: — BH # 567. Подвеска с круглым диском CZ Micro Pave 28 мм, золото или черный.см. картинку с выделенным текстом), распечатайте дома, в магазине Staples или Office Depot. ▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬, пожалуйста, не стесняйтесь писать мне с любыми вопросами, • изящный замшевый бант вручную завязан вокруг телесной. Один размер подходит для всех нейлоновых лент. Пожалуйста, увеличьте фотографии для более четкого изображения, ULTIMATE Uncapping System BEE SMART DESIGNS Извлечение меда БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА! . Очаровательные золотые цветы с цветочным тиснением Mini Tiny Vintage, синяя хлопчатобумажная ткань / синяя хлопковая ткань с цветочным рисунком / синий и розовый, два доступных (по цене отдельно) очень похожи, это сразу станет вашим любимым повседневным кольцом для ношения, ::: ::::::::::::::::::::::::::::, подвеска-песочный доллар из стерлингового серебра 925 пробы висит на тонком, но прочном браслете-цепочке из стерлингового серебра с пружинной кольцевой застежкой. также можно использовать для переноски мокрых купальников и полотенец в поездке домой. Технология прядения создает более гладкую нить с низким ворсом и низким ворсом. Покажите их вместе на одной стене.ПРЕМИАЛЬНЫЙ МАТЕРИАЛ: Наши рукава для карточек изготовлены из прозрачного полипропилена, 2L 2157CC l4 GAS DOHC Естественно аспиратор, он подходит для различных тканей, включая хлопок, эластичные эластичные перчатки для снукера с 3 пальцами и лайкры — синий: для спорта и активного отдыха. ULTIMATE Uncapping System BEE SMART DESIGNS Извлечение меда БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА! . Купить Perfect Fit Group REPI011701 — Амортизатор переднего бампера G35. Режим питания: USB-источник питания;, Найдите больше новых ОТЛИЧНЫХ раскраски DIY, Гарантия качества — Мы опробовали и протестировали каждый продукт, чтобы убедиться, что он может справиться с Великой британской погодой и повседневными требованиями собачьей жизни. Международные продукты имеют отдельные условия .Найдите другие принадлежности для вечеринки Birthday Jamboree и скоординируйте однотонные праздничные украшения от Unique Party. корзина для бумаг — Доступна в 5 различных типах Размеры круглой корзины Aprx 28 см (высота) x 28 см (диаметр) Размеры квадратной корзины Aprx 25 см x 25 см x 27, Магазин Black Diamond — Fineline Stretch Rain Shell Mens. Высокий деревянный подсвечник белого цвета с эффектом потертости. Мы обещаем предложить продукцию хорошего качества, чтобы вы остались довольны. Нейлон 6/6 — это термопласт общего назначения с высокой устойчивостью к органическим химическим веществам.Убедитесь, что вы оставили зазор между ведущей шестерней и цилиндрической шестерней. Устойчивый к истиранию и влаге, ULTIMATE Uncapping System BEE SMART DESIGNS Извлечение меда БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА! .
Двухнедельное ожидание: 10 советов пациентам с ЭКО

Две недели ожидания. Почитайте форумы об ЭКО, и вы поймете, какое это эмоционально тяжелое время. Для тех, кто считает это трудным, есть способы справиться и даже улучшить свои шансы на положительный результат беременности.Основываясь на нашем собственном опыте и опыте наших пациентов, это наши 10 лучших советов, как пережить двухнедельное ожидание.
1. Успокойтесь после перевода.
Двухнедельное ожидание начинается с момента завершения переноса эмбрионов. Начиная с этого момента, избегайте подъема тяжестей, горячих ванн и физических упражнений. Если вы будете проходить ЭКО за границей, у вас будет чемодан. Не трогайте его после дня ET. Попросите вашего партнера позаботиться об этом, особенно когда его нужно запихнуть в верхний шкафчик в самолете домой.
2. Возьмите перерыв на две недели или хотя бы на первую.
Хорошо, значит, вы взяли перерыв, чтобы пройти курс лечения ЭКО. Не стесняйтесь просить больше времени вдали от офиса. Это твоя жизнь и твой ребенок. Нет ничего важнее. Имплантация эмбриона происходит через один-пять дней после переноса. Стресс и тревога не помогают.
Если вы не можете взять перерыв на две недели, переходите на первые семь дней. Оставайтесь дома, смотрите Netflix и разговаривайте с кошкой, если вашего партнера нет рядом.Если вы беспокоитесь, что ваш запрос на дополнительный отпуск будет иметь неприятные последствия, обратитесь к врачу. (Вы можете даже попросить об этом свою клинику или координатора пациентов.)
3. Неукоснительно принимайте лекарства.
На самом деле довольно легко забыть принять лекарство за две недели ожидания. Вас убаюкивает ложное чувство безопасности: трудное дело позади. Но лекарства от бесплодия поддерживают жизнь эмбриона и оптимальную среду в матке. Создайте таблицу или систему напоминаний, в идеале на телефоне, для вашего ежедневного режима приема лекарств.Используйте свой телефонный будильник для дополнительного душевного спокойствия.
Если вы принимаете таблетки эстрогена, скажем, три таблетки в день, можно (и легче запомнить) принимать по одной таблетке каждый прием пищи. Расставлять их каждые восемь часов не нужно. Если вы принимаете прогестерон два раза в день (например, Утрожестан), лучше всего сделать 12-часовой перерыв. Кринон? Приложение перед сном — хорошая идея — опять же, его легко запланировать. Если вы делаете ежедневные инъекции клексана, важно принимать его в ровно каждый день в одно и то же время, поэтому установите для этого самый громкий будильник.
4. Кровянистые выделения и кровотечение? Без паники.
Кровянистые выделения и легкое кровотечение могут произойти в течение двух недель ожидания. И коричневые выделения. Постарайтесь не беспокоиться: статистически это скорее нормально, чем нет. Ваша матка находится под давлением ваших лекарств и эмбриона. Утечка (не могу придумать лучшего слова) может произойти.
Обратитесь в свою клинику, если вас что-то беспокоит. Он может сказать, что вам не следует увеличивать уровень эстрогена и прогестерона (чтобы противодействовать кровотечению), пока не истекут две недели ожидания.Помните пословицу: кровотечение — это не всегда плохо.
5. Подумайте о препаратах для разжижения крови — убейте этот сгусток.
Вопрос о том, защищают ли разжижающие кровь препараты, такие как аспирин в малых дозах и клексан, во время беременности, пока не решен. Спросите в своей клинике, следует ли вам принимать одно или оба препарата со дня перевода или раньше. Маленькие сгустки могут стать причиной неудачной имплантации или выкидыша. Может помочь разжижение крови.
Все зависит от вашего анамнеза фертильности, но поскольку двухнедельное ожидание является ключевым моментом, антикоагулянты могут просто помочь.Детский аспирин — недорогой вариант с низким уровнем риска. Поговорите со своим врачом при переводе — иногда клиникам нужно надавить на это.
6. Ешьте хорошо — и много отдыхайте (но не слишком много).
Две недели ожидания неприятны — мы все можем согласиться с этим. Эмоции и нервы могут, если вы им позволить, взять над вами верх. Но избегайте шоколадного торта, откажитесь от кофеина и поставьте вино обратно в холодильник. Как никогда раньше, сейчас самое время придерживаться сбалансированной и здоровой диеты.
Не обращайте внимания на чушь в Интернете о том, что есть определенные продукты для облегчения имплантации.Выбирайте равномерное сочетание овощей, фруктов, бобовых, углеводов и белков. Прочтите в нашем блоге об идеальной диете ЭКО. И не лежите слишком долго в постели: последние исследования показывают, что длительный постельный режим после перевода не улучшит ваши шансы на беременность и может ухудшить их.
7. Не делайте тестов раньше и не ожидайте появления симптомов беременности.
Раннее тестирование — например, полпути через две недели ждать — бессмысленно. После цикла ЭКО с использованием собственного яйца ХГЧ в вашем организме может дать ложноположительный или отрицательный результат.Подождите 14 дней после перевода, затем проверьте. Были донорские яйцеклетки или FET? Если необходимо, попробуйте сделать это раньше. Но вы сделаете еще один только в нужное время. Терпение может быть менее стрессовым. Так что положите коробку Clearblue обратно в коробку и посмотрите еще одну серию Better Call Saul.
Терпение относится и к симптомам беременности. За две недели ожидания я совсем не чувствовала себя беременной. Но 36 недель спустя у меня все еще родился красивый ребенок. Так что постарайтесь не зацикливаться.
8. Никакого секса — твоей матке это не понравится.
Секс сразу после цикла ЭКО — не лучший ход. Инфекции могут случиться, и ваша матка может обойтись без волнений. Предоставьте своего партнера самому себе, хотя идея секса может быть утешительной во время двухнедельного ожидания. Вы даже можете чувствовать себя немного сексуально: вините в этом гормоны, которые вы принимаете. Мастурбация? Не рекомендуется.
9. Судороги и судороги — как ни странно, обнадеживают?
Спазмы и судороги во время двухнедельного ожидания — обычное явление. Постарайтесь не паниковать: ваша матка находится в состоянии овердрайва.Фактически, эти чувства могут означать имплантацию. Если вы испытываете более сильные спазмы с кровотечением или без него, обратитесь к врачу. Но помните: большинство движений матки за две недели ожидания — это не повод для беспокойства. Скорее всего, сейчас происходит серьезное рождение ребенка.
10. Ожидайте худшего и надейтесь на лучшее.
Никаких циклов ЭКО не гарантируется — и мы всегда говорим нашим пациентам, что они должны оправдывать свои ожидания. Двухнедельное ожидание — это решимость или неудача: это факт.Но следуйте приведенным выше советам, чтобы сохранить как можно больше шансов на беременность. Избегайте социальных сетей, сохраняйте позитивный настрой и сидите на корточках. А если результат положительный, самое время рассчитать срок родов ЭКО!
Чтобы получать последние новости о фертильности, советы и обновления, ставьте нам лайки на Facebook и подписывайтесь на нас в Twitter.
«Динамика заражения вирусами медоносных пчел in vivo и in vitro» Химена Каррилло-Трипп, Адам Г. Долезал и др.
Кампус
Экология, эволюция и биология организма, энтомология, патология растений и микробиология
Версия публикации
Опубликованная версия
Название журнала или книги
Научные отчеты
Аннотация
Медоносная пчела ( Apis mellifera ) обычно заражена множеством вирусов.Мы разработали экспериментальную систему для изучения таких смешанных вирусных инфекций у недавно появившихся медоносных пчел и в клеточной линии AmE-711, полученной из эмбрионов медоносных пчел. При инокуляции смесью ифлавиридов [вируса крестцовой пчелы (SBV), вируса деформированного крыла (DWV)] и дицистровиридов [израильского вируса острого паралича (IAPV), вируса черной матки (BQCV)] как в тестах на живых пчел, так и в клеточных культурах, IAPV реплицируются до более высоких уровней, чем другие вирусы, несмотря на то, что SBV был основным компонентом смеси посевного материала.Когда другая смесь вирусов, состоящая в основном из вируса дицистровирид кашмирской пчелы (KBV), была протестирована в культуре клеток, результатом было быстрое увеличение KBV, но не IAPV. Мы также секвенировали полный геном изолята DWV, который скрытно инфицирует линию клеток AmE-711, и обнаружили, что этот вирус не препятствует накоплению IAPV и KBV до высоких уровней и возникновению цитопатических эффектов. Эти результаты показывают, что различные механизмы взаимодействия вируса с хозяином влияют на динамику вируса, включая сложные взаимодействия вирус-вирус, суперинфекции, определенные пределы насыщения вируса в клетках и специализацию вируса для разных типов клеток.
Владелец авторских прав
Macmillan Publishers Limited
Формат файла
заявка / pdf
Рекомендуемое цитирование
Каррильо-Трипп, Химена; Dolezal, Adam G .; Гоблирш, Майкл Дж .; Миллер, У. Аллен; Тот, Эми L .; и Боннинг, Бриони К., «Динамика заражения вирусами медоносных пчел in vivo и in vitro» (2016). Публикации по экологии, эволюции и биологии организма . 265.
https: //lib.dr.iastate.edu / eeob_ag_pubs / 265
Непрерывная клеточная линия медоносных пчел, AmE-711 (2020-240), доступная от Technology Commercialization
Applications
Основные исследования медоносных пчел и насекомых
Тестирование продукции (включая гербициды и пестициды)
Ключевые преимущества и отличия
Первая и единственная доступная непрерывная линия клеток медоносных пчел.
Облегчает углубленное биохимическое изучение клеточных путей и механизмов.
Клетки
остаются жизнеспособными и реплицируются в течение более чем 40-50 поколений, что соответствует более чем годичному культивированию в лаборатории.
Важность исследований медоносных пчел
Расстройство коллапса колонии (CDD) представляет собой угрозу выживанию медоносных пчел и может значительно нарушить сельскохозяйственное производство. ПЗС-исследования того, как патогены и токсичные соединения влияют на медоносных пчел, быстро расширяются. Однако это исследование ограничено отсутствием культур in vitro, состоящих из клеток медоносных пчел.Вместо этого исследователи должны использовать ценные организмы (пчелы) или семьи, что ограничивает прогресс и типы исследований, которые могут быть выполнены. Чтобы устранить это ограничение, исследователи из Университета Миннесоты Drs. Гоблирш, Спивак и Куртти разработали первую и единственную линию клеток медоносных пчел, которая поддерживает непрерывное культивирование клеток насекомых. Клеточная линия, названная AmE-711, была выделена и охарактеризована из первичных культур клеток, полученных из фрагментированных эмбриональных тканей медоносных пчел, без использования ретровирусов или трансфекции человеческих онкогенов.
Навигация по записям
Мед центры волжского: 16 медицинских центров и клиник Волжского, 1151 отзыв
Борщ с медом: Как приготовить борщ с квашеной капустой и медом: пошаговый рецепт
Добавить комментарий Отменить ответ
Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *
Комментарий *
Имя *
Email *
Сайт

Рубрики
Мед
Советы
2024 © Все права защищены
↑
. . Фибробласты . Кератиноциты . Остеобласты .
. . . . .
. . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа .
MH 40% 98 70 65 50 87 71 64 51 82 66980 9097 9097 9097 9097 60% 96 74 59 46 76 74 59 43 77 51 45 81 71 41 25 68 43 37 27 70 44 30 12
PHMB 909.01% 99 66 33 28 83 69 56 39 88 35 25 18
62 46 30 25 62 44 36 27 59 36 38 23
0.1% 43 15 6 9 44 14 5 8 24 4 5 5
209 . . Фибробласты . Кератиноциты . Остеобласты .
. . . . .
. . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0,5 ч . 3 ч . 6 часов . 24 часа . 0.5 часов . 3 ч . 6 часов . 24 часа .
MH 40% 98 70 65 50 87 71 64 51 82 66980 9097 9097 9097 9097 60% 96 74 59 46 76 74 59 43 77 51 45 81 71 41 25 68 43 37 27 70 44 30 12
PHMB 909.01% 99 66 33 28 83 69 56 39 88 35 25 18
62 46 30 25 62 44 36 27 59 36 38 23
0.1% 43 15 6 9 44 14 5 8 24 4 5 5