Готовность мед полиса: Проверка готовности полиса ОМС | СОГАЗ-МЕД

Комбайнам лучше подождать, пока пчелы соберут как можно больше меда. Лучше всего дождаться последнего потока нектара, но в то же время нужно помнить о том, что для сбора урожая нужно ждать слишком долго. Если есть возможность, лучше всего удалить мед не позднее середины сентября ; Для этого существуют две причины.

Во-первых, когда приближается зимний сезон, ваши пчелы начнут потреблять мед, который они произвели в летние месяцы.Если надолго оставить супера в улье, пчелы начнут потреблять произведенный мед.

Вторая причина заключается в том, что когда погода становится слишком холодной, вы больше не сможете собирать мед и потеряете то, что было произведено в течение сезона вашими пчелами.

Хотя это деликатные временные рамки, с которыми вам нужно работать, вы должны помнить о том, чтобы переехать слишком рано. Если вы собираете мед до отметки 80%, вы рискуете, что пчелы перестанут плодоносить в течение этого сезона. Но вы хотите собрать урожай до наступления зимы, чтобы также избежать потерь.

Лучшие месяцы, вероятно, — конец июля, август и до середины сентября. Это не только приведет к полному кадру, но и гарантирует, что вы не потеряете мед из-за погодных условий в следующие месяцы.

Новый дизайн пчелиного ящика повышает готовность опылителей: USDA ARS

Архивная страница

Эта страница заархивирована и предоставляется только для справки.Страница больше не обновляется, поэтому ссылки на странице могут быть недействительными.

Новый дизайн ящика для пчел повышает готовность опылителей

Трудолюбивых синих садовых пчел можно уговорить выйти из своих уютных зимних коконов как раз вовремя, чтобы опылить самые ранние и лучшие цветы в году, благодаря недавно разработанной коробке для этих дремлющих опылителей.

Специалисты по пчеловодству из Отдела биологии, управления и систематических исследований насекомых-опылителей Службы сельскохозяйственных исследований (ARS) в Логане, штат Юта, создали ящик, чтобы помочь цветоводам и пчеловодам убедиться, что синие садовые пчелы (Osmia lignaria) или другие дикие пчелы готовы помочь Американские медоносные пчелы (Apis mellifera) опыляют фруктовые или ореховые деревья — или другие культуры — как только начинают цвести.

По словам исследователя-энтомолога ARS Терезы Л. Питтс-Сингер из Logan, синхронизировать пчел и цветение непросто. Например, миндальные деревья могут зацвести, когда еще зимующие пчелы еще не готовы их опылять.

Питтс-Зингер, техник компании Logan Глен Э. Тростл и бывшие энтомологи компании Logan Уильям П. Кемп, работающий сейчас в ARS в Северной Дакоте, и Хорди Бош, теперь в Испании, спроектировали и протестировали жилищный блок, получивший название «пчелиное разогревание и прорастание». коробка.» ARS ищет патент.

Испытания в миндальном саду Калифорнии и яблоневом саду Юты — примерно по 450 самок синих садовых пчел в каждом — показали, что примерно 50 процентов пчел, укрытых в новых ящиках, вылетели на улицу к четвертому дню испытания. Это было на два дня раньше в Калифорнии и на семь дней раньше в Юте, чем пчелы вылупились из традиционных неотапливаемых деревянных блоков.

Для эксперимента прототипы блоков из поликарбоната и пенополистирола размером 16 на 10 на 13 дюймов были помещены в деревянные укрытия в садах.Каждый прототип включал нагревательный элемент, термостат и прозрачную трубку, через которую пчелы могли использовать его в качестве выхода. Некоторое количество дневного света попадает в ящик через прозрачную трубку, чтобы пчелы могли найти выход.

Гибкие щетинки, покрывающие трубку, позволяют пчелам выходить наружу, но не возвращаться обратно. Это плюс, потому что это побуждает пчел строить новые, чистые гнезда в деревянных блоках поблизости.

ARS — главное научно-исследовательское агентство Министерства сельского хозяйства США.

свидетельств генетического компонента

Abstract

Фенотип социальной группы связан с фенотипами людей, которые образуют это общество.Мы исследовали, как агрессивность пчелиной семьи соотносится с индивидуальной реакцией трутней-самцов и рабочих-собирателей. Хотя естественным акцентом агрессии колонии была каста рабочих, стерильные самки, занятые поддержанием и защитой колонии, самцы несут те же гены. Мы измерили показатели агрессивности колоний и исследовали компоненты индивидуального агрессивного поведения у рабочих и гаплоидных сыновей рабочих из той же колонии. Мы впервые описываем, что самцы, хотя и не имеют жала, сгибают живот (сгибание живота) в позе, аналогичной укусу рабочих в ответ на удар электрическим током.Реакция отдельного рабочего на укус и скорость передвижения в ответ на шок достоверно коррелировали с оценками колонии. В случае дронов, сыновей рабочих из одной и той же колонии, сгибание живота значительно коррелировало, но скорость их движения не коррелировала с агрессивностью колонии. Кроме того, количество рабочих, реагирующих на возрастающие уровни напряжения, демонстрирует пороговую реакцию, тогда как дроны реагируют на шок в большей пропорции. Мы пришли к выводу, что существуют общие и кастовые компоненты агрессивного поведения медоносных пчел.Мы обсуждаем последствия этих результатов для социальной и поведенческой регуляции и генетики агрессивного ответа.

Ключевые слова: Шок, Агрессия, Медоносная пчела, Укус, Сгибание живота, Дрон

Введение

Интеграция агрессивной реакции индивидов на социальную защиту является одной из важных характеристик социальных организмов. Эта стратегия защиты привела к эволюции поведенческих или морфологических подкаст (например, солдат, охранников) независимо в нескольких, отдельных социальных линиях.Морфологически различные касты солдат встречаются в эусоциальных системах, таких как муравьи (Wheeler 1991), пчелы (Grüter et al. 2011), термиты (Thorne et al. 2003; Roux and Korb 2004), тли (Stern and Foster 1996), трипсы (Chapman et al. 1999) и креветок (Tóth and Duffy 2008). В семьях медоносных пчел ( Apis mellifera sp.) Задачи солдат и охранников коррелируют с возрастом и выполняются генетически разными группами рабочих (Робинсон и Пейдж 1988; Брид и др. 1990; см. «Охранники» Хант 2007).

Агрессивная реакция медоносной пчелы на уровне колонии и на индивидуальном уровне связана с распределением рабочих между задачами солдат и собирателей, возрастной структурой колонии (Arechavaleta-Velasco and Hunt 2004; Giray et al. 2000) и условиями окружающей среды, влияющими на добычу пищи и y выращивание выводков (Schneider et al. 2004; Rivera-Marchand et al. 2008). Изменения индивидуальной агрессивности зависят от порогов индивидуальной поведенческой реакции (Robinson 1997; Shorter and Rueppell 2012). Исследования, изучающие связь между реакцией колонии и индивидуальным уровнем, были сосредоточены на работающих женщинах, основных действующих лицах (Collins et al.1984; Колмес и Фергюссон-Колмес 1989; Giray et al. 2000; Breed et al. 2004; Hunt 2007; Shorter и Rueppell 2012). Хотя самцы медоносных пчел (трутней) не принимают непосредственного участия в этой реакции, прошлые исследования установили, что отцовское наследование сильно коррелирует с фенотипом агрессивной реакции дочерних колоний (Guzman-Novoa et al. 2005). В настоящей работе исследуются ответы рабочих и трутней, которые соответствуют компонентам агрессивного поведения, и как они соотносятся с фенотипом родительской колонии.

Важность изучения агрессивной реакции подтолкнула к разработке различных методов анализа и количественной оценки составляющих поведения (например, бегство и преследование потенциального нападающего, двигательная активность, укусы и т. Д.; Collins et al. 1984; Spangler and Sprenkle 1997; Гусман-Новоа и др. 1999; Гирей и др. 2000; Гусман-Новоа и др. 2003; Брид и др. 2004; Хант 2007). На уровне колонии агрессия измерялась с помощью различных методов, включая, среди прочего, моделирование атак, оценку поведения и подсчет укусов (Guzman-Novoa et al.1999; Guzman-Novoa et al. 2003, рассмотрено в Rivera-Marchand et al. 2012). Результаты, полученные с помощью этих методов, показали, что агрессия колонии является высоко наследуемой чертой в популяциях медоносных пчел с отцовской наследственностью (вклад дрона), имеющей большой эффект (Collins et al. 1984; Hunt et al. 1998; Guzman-Novoa et al. 2002, 2005). ; Cingolani et al.2013). Это было дополнительно подтверждено в долгосрочных селекционных исследованиях. По крайней мере, в одном исследовании агрессивная реакция африканизированных медоносных пчел была снижена на 50% благодаря искусственному отбору (Guzman-Novoa и Page 1999).Совсем недавно исследование на уровне колоний, проведенное Rivera-Marchand et al. (2012) показали, что агрессивная реакция была снижена в колониях африканизированных медоносных пчел в Пуэрто-Рико (придуманный gAHB, нежная африканизированная медоносная пчела, Галиндо-Кардона и др., 2013).

Исследования, изучающие индивидуальную реакцию работника, показали, что несколько переменных определяют вероятность, степень и время агрессивной реакции. Наиболее сильно поддерживаются генетические детерминанты (Колмес и Фергюссон-Колмес, 1989). Колмес и Фергюссон-Колмес (1989) обнаружили различия в готовности к укусу у отдельных рабочих из разных подвидов медоносных пчел (см. Также Baldemarra et al.1987). Возраст и сезон также были факторами, влияющими на пороги стимулов (Baldemarra et al. 1987; Kolmes and Fergusson-Kolmes 1989). Поведенческие наблюдения из этих исследований были дополнительно подтверждены нейрофизиологическими измерениями реакции на укус в изолированных абдоминальных цепях (Burrell and Smith 1994; Ogawa et al. 1995, 2011).

Результаты количественной оценки индивидуальных мер реагирования (в основном степени и частоты укуса), использованных в этих прошлых исследованиях, сильно различались.Поэтому выводы были ограничены различиями между широкими категориями (например, подвиды, возраст, время года) (Baldemarra et al. 1987; Kolmes and Fergusson-Kolmes 1989; Kolmes and Njehu 1990; Tel-Zur and Lensky 1995; Lenoir et al. 2006 г.). Несмотря на это, множество вариантов этих анализов на индивидуальном уровне внесли значительный вклад. Использование одного компонента поведения в агрессивном ответе, депонированное жало или нет в тесте флага, позволило провести геномное картирование локусов, ассоциированных с укусами (Hunt et al.1998). Дальнейшее изучение этих геномных регионов показало их участие в другом защитном поведении (то есть в защите) (Arechavaleta-Velasco and Hunt 2004). Точно так же категоризация и меры расширения укуса помогли описать, как это поведение представляет собой двигательный паттерн с рефлекторным и модуляторным компонентами (Burrell and Smith 1995; Ogawa et al. 1995, 2011).

Из-за сильного влияния отцовского наследования на агрессию на уровне колонии было бы важно изучить потенциальные корреляты между индивидуальным дроном и поведением рабочего и фенотипом колонии (Guzman-Novoa et al.2005). Гаплоидный геном самцов (Beye et al. 2003) медоносных пчел поддается дальнейшим исследованиям в области геномики и генетики, если у дронов можно идентифицировать интересующие их черты. Кроме того, сравнительное исследование компонентов агрессивного поведения у мужчин и женщин может привести к новым открытиям, таким как эпигенетические эффекты агрессивного поведения (Cingolani et al. 2013). Фактически, корреляции, сначала не очевидные, между одиноким самцом медоносной пчелы и социальным, почти бесплодным работником в отношении поведения и развития, предоставили важную информацию об эволюции и механизмах обучения и памяти (Bhagavan et al.1994; Ferguson et al. 2001), возрастное поведенческое развитие (Giray and Robinson 1996) и нейроэндокринная регуляция поведения (Fahrbach et al. 1997). Обычным поведением рабочих и дронов в ответ на болезненный раздражитель является побег (см. Дингес и др., 2013 г.), и мы сначала нацелены на измерения движения в нашем тесте на поражение электрическим током (ESA). Позже мы сделали новое наблюдение, что дроны также сгибают брюшную полость в ответ на болезненный стимул аналогично реакции укусов рабочих (Интернет-ресурсы 1 — фотоиллюстрация; 2 — видео сгибания живота мужчины в ESA).

Здесь мы анализируем связь между колонией и индивидуумом, исследуя поведенческую реакцию рабочих, потомков мужского пола, произведенных рабочими, и родительских колоний. Мы спрашиваем: (1) коррелирует ли индивидуальная реакция на электрический шок у рабочих и дронов с агрессивным фенотипом колонии, и (2) сходны ли реакции мужчин и рабочих на электрический шок. Кроме того, мы представляем поведенческий анализ, который может количественно оценить реакцию на индивидуальном уровне с помощью двух измерений: уровня активности во времени у рабочих и дронов и укусного поведения у рабочих и аналогичной позы, сгибания живота, у мужчин в ответ на шок.

Материалы и методы

Коллекции

Тринадцать основных исходных колоний с нашей пасеки на Сельскохозяйственной исследовательской станции Гурабо Университета Пуэрто-Рико в Гурабо, Пуэрто-Рико, были фенотипированы на агрессию с помощью рейтингового теста. Было показано, что рейтинговые тесты являются надежными и воспроизводимыми (Guzman-Novoa et al. 2003) анализами агрессивного ответа колоний даже при сравнении подвидов и гибридизированных рас (Guzman-Novoa et al. 1999). Наш специальный тест представляет собой стандартизированную версию теста, представленного Giray et al.(2000), который ранее использовался в нашем конкретном гибриде (Rivera-Marchand et al. 2012; см.). Поведенческие фенотипы оценивались дважды с трехдневным интервалом между каждой схваткой. Этот интервал гарантировал, что любые поведенческие эффекты или эффекты уровня транскрипции, вызванные предъявлением тревожных феромонов в первой схватке, не повлияют на результаты, полученные во второй схватке (см. Alaux and Robinson 2007; Urlacher et al. 2010).

Таблица 1

Описание рейтингов, используемых для фенотипирования агрессии колоний

В каждом подсчете очков мы использовали минимальное количество дыма при открытии колонии (три затяжки), чтобы стандартизировать его успокаивающий эффект.После открытия колонии извлекали один кадр, из которого оценивали агрессивный ответ колонии (см.). Были выбраны следующие категории: бегать, ужалить, зависать и летать. Как указано в разделе, каждое поведение оценивалось по четырехбалльной шкале интенсивности, где один балл означал наименьшую возможную реакцию, а четыре — наивысшую. Категории укусов и мух представляют собой готовые меры агрессии, поскольку они являются основными категориями, участвующими в агрессивной реакции. Конкретное количество укусов после первого мы не отслеживали.Это потому, что одно укус может вызвать дальнейшие реакции из-за выброса феромона тревоги. Категории бега и зависания были установлены предыдущими исследованиями как индикативное поведение степени гибридизации африканизированных медоносных пчел, которое коррелирует с агрессией колонии (Guzman-Novoa et al. 1999, 2003; Schneider et al. 2004).

Из каждой из центральных исходных колоний, фенотипированных, как описано, было отобрано 20 собирателей и протестировано с помощью анализа индивидуальной реакции, описанного ниже (всего n = 260).После этого часть каждой колонии (~ 5000 рабочих женщин, от двух до четырех рамок) была изолирована в небольших экспериментальных единицах (нуклеус супер), чтобы стимулировать мужское производство рабочими. В течение 2 месяцев эти колонии проверяли еженедельно, и все чашки или клетки маток удаляли или уничтожали, чтобы предотвратить выращивание маток. Во время проверок мы также внимательно следили за тем, чтобы определить, наблюдались ли какие-либо события «ложной королевы». Это происходит, когда яичники отдельных рабочих развиваются до такой степени, что производят достаточный уровень феромона нижней челюсти королевы (QMP), чтобы их сестры относились к ним как к «маткам» (см. Cargel and Rinderer 2006).Эти события были нежелательными, так как наша цель состояла в том, чтобы выбрать рабочий генотип из каждой колонии, а «ложная королева» связывает большую часть репродуктивной продукции со своим конкретным генотипом. Эти колонии ядра без матки были созданы просто для того, чтобы получить сыновей рабочих, чтобы контрастировать с исходной колонией, которая была фенотипирована на предмет агрессивности. Фенотип этих колоний с ядром без матки не имел отношения к исследованию; кроме того, из-за обширных манипуляций, необходимых для создания рабочих трутней, фенотипы рабочих не будут отражать исходные колонии.

В конце двухмесячного периода полученные самцы были собраны для индивидуального тестирования. Наш целевой дрон на размер тестовой колонии был 20 (аналогично рабочему). По логистическим причинам средний размер выборки на каждую колонию составлял 14 человек; люди были исключены, если они не взаимодействовали с анализом (см. ниже) или были оценены как не являющиеся репродуктивно зрелыми (Dinges et al. 2013). Это значительная часть дронов определенной стадии развития (летающие дроны> 10-дневного возраста), производимых колониями дронов (см. Giray and Robinson 1996).

Assay

Наше устройство аналогично тому, что описано в Agarwal et al. (2011). Конкретные компоненты представляли собой стальную сетку, вставленную таким образом, чтобы создать разомкнутую цепь, плакатный картон, вырезанный для обеспечения отдельных полос, и прозрачные листы из оргстекла ™, которые закрывали пространство, позволяя наблюдать (см. Описание в Agarwal et al. 2011). ). Тестируемые пчелы находились на отдельных полосах, разделенных перегородками толщиной 0,5 см, которые не позволяли им видеть друг друга. Было десять полос, по которым можно было тестировать десять пчел одновременно.Вместе компоненты образовали кассету со слоем плексигласа ™, на которой располагалась стальная сетка с полосами для плакатов наверху и окруженная другим листом плексигласа ™ в качестве прозрачного потолка. Этот последний лист всегда был покрыт вазелином, чтобы пчелы не могли избежать удара током при ходьбе по потолку. Полученную кассету помещали на ЖК-монитор (DELL, модель №: E156FPc). Для контраста во время видеозаписи на мониторе был предусмотрен желтый фон.

Схематическое изображение аппарата, использованного в эксперименте. Серые провода пересекаются, образуя сетку с разомкнутой цепью, которую пчелы закрывают при ходьбе. Ток был установлен на протяжении всего эксперимента на уровне 50 мА, в то время как напряжение представлялось в соответствии с описанием.

Негативным стимулом, используемым в наших презентациях, было поражение электрическим током. Электрический шок в качестве негативного стимула широко использовался как в исследованиях агрессии, так и в обучении (Нуньес и др., 1983; Абрамсон, 1989; Ленуар и др., 2006; Агарвал и др., 2011). Этот стимул идеально подходит для анализа реакции, поскольку медоносные пчелы вряд ли столкнутся с ним в природе, что делает его непредвзятым.Наличие непредвзятого нового негативного стимула имеет особое значение в тестах на агрессивное поведение, поскольку они учитывают возможные мешающие факторы, такие как обонятельные, тактильные или визуальные сигналы, которые могут предопределить реакцию.

Для каждого испытания вся стальная сеть электрифицировалась для создания разомкнутой цепи. Таким образом, медоносные пчелы получали стимул, когда замыкали эту цепь, двигаясь и касаясь электродов сетки. Подача удара регулировалась кнопочным механизмом.Это позволяло экспериментальным условиям оставаться постоянными, и единственной изменяющейся переменной был шок во время презентаций.

Схема эксперимента

Подобно Колмесу и Фергюссон-Колмес (1989), мы провели индивидуальные презентации увеличивающейся шкалы напряжения. В отличие от предыдущего исследования, мы проводили наши презентации поэтапно, а не непрерывно. Таким образом, каждая работница испытала 10-секундные представления шока с последующими 20-секундными интервалами отдыха. Шок предъявляли женщинам с шагом 2 В по шкале от 0 до 26 В.Были протестированы две группы мужчин; в одном мы использовали 20-секундные представления напряжения с последующими 40-секундными интервалами отдыха. В этом первом исследовании дронов шок для мужчин был представлен с шагом 4 В по шкале от 0 до 28 В. Это было связано с более медленной реакцией дронов.

Во втором исследовании дронов мы использовали ту же схему представления, что и для рабочих, то есть шкалу напряжения от 0 до 26 В с шагом 2 В и 10-секундную демонстрацию разряда с 20-секундными интервалами. Эти дроны были собраны в колониях правых маток в течение июня – августа 2013 г. путем блокирования входа в колонию с помощью искателя маток в послеобеденное время с 14 до 17 часов.Время сбора было установлено на основе предыдущей работы Galindo-Cardona et al. (2012). Ответ этой группы сравнивался с исходным дроном и ответом рабочего.

Представляющими интерес переменными были скорость движения, напряжение при максимальном движении и реакция на укус (женщины) или сгибание живота (дроны) во время презентации шока (см. Онлайн-ресурсы 1 (фотография, показывающая дрон и рабочий во время сгибания живота) и 2 (видео с сгибание живота трутня при пробе)). Для каждой особи измерялось напряжение, при котором происходило укус (фуражиры) / сгибание (трутни).Мы классифицируем эту переменную как меру напряжения реакции человека. Мы аналогичным образом измерили уровень напряжения, при котором была достигнута максимальная скорость движения как рабочих, так и дронов. Эта переменная представляет собой меру чувствительности к отрицательному стимулу и будет называться чувствительностью к напряжению. Вместе эти переменные обеспечивали оценку индивидуальных уровней степени ответа и чувствительности, соответственно.

Скорость движения определялась количественно как наивысшая скорость движения, достигнутая в каждом отдельном испытании, за вычетом базовой линии (скорость движения при 0 В), это называется максимальной скоростью движения с поправкой на базовый уровень.Таким образом, скорректированная на исходном уровне скорость 0 была достигнута людьми, которые соответствовали начальной скорости передвижения. Ни один человек не показал отрицательной максимальной скорости передвижения. Описанные переменные были исследованы у мужчин и женщин, чтобы произвести сравнения с оценкой агрессии основной колонии-источника.

Анализ

Сравнения напряжения при ответе (покалывание или сгибание живота) для женщин-рабочих и дронов были проанализированы с использованием двухвыборочного теста распределений Колмогорова-Смирнова.Мы получили оценку агрессивности отдельной колонии путем регрессии оценок, полученных в первый день рейтингового теста колоний, по сравнению с оценками, полученными во второй день (). Мы использовали анализ непараметрической ранговой корреляции Тау Кендалла для всех сравнений между этими подобранными оценками агрессивности и индивидуальными ответами. Все статистические анализы были выполнены с использованием статистической программы R (R Development Core Team 2008).

Распределение фенотипов родительских колоний. Корреляция показателей агрессивности колоний в нашей выборке из 13 колоний. Строка представляет подобранные значения, полученные из регрессионной модели и используемые в корреляционных тестах. Размер круга пропорционален количеству колоний, набранных в том же диапазоне. Большинство колоний набрали одинаковую оценку с 1 по 2 день рейтингового теста

Результаты

Показатели агрессивности родительских колоний

Показатели агрессивности колоний на первый и второй день отбора образцов значимо коррелировали (простая линейная регрессия, F (1 , 11) = 14.39, p = 0,003). Диапазон усредненных баллов по выборочным колониям был от самого низкого балла 5,3 до максимума популяции 12,2 из возможного максимума 16. Распределение результирующих баллов было смещено вправо со средним значением 6 и диапазоном 6,9; это сопоставимо со средним значением и диапазоном, полученным для ранее сообщенных gAHB (см. Rivera-Marchand et al. 2012).

Реакция на укус рабочего в сравнении с реакцией на сгибание брюшка дрона

Распределение ответов самок-добытчиков-самцов и первое исследование (отцовских) самцов трутня-самцов на ответ различались (двусторонний тест Колмогорова-Смирнова, D = 0.32, p ⟪0,001). Значительные различия также сохранялись, когда рабочих сравнивали с дронами, произведенными маткой из нашего второго исследования (двусторонний тест Колмогорова-Смирнова, D = 0,32, p ⟪0,001). Напротив, распределение напряжения по ответу существенно не различается между дронами из двух исследований (двусторонний тест Колмогорова-Смирнова, D = 0,21, p = 0,09;). Форма кумулятивного распределения напряжения для реакции у рабочих была иной, чем у групп дронов.Кумулятивное исследование способности женщин-рабочих реагировать на сигнал имеет сигмовидную форму, в то время как на кривых кумулятивного отклика обеих групп дронов этого нет. Большее количество дронов, чем рабочих, с большей готовностью реагировало на более низкие уровни напряжения (). В отличие от них рабочие, собирающие пищу, достигли максимального отклика для группы задолго до любой из групп дронов ().

Суммарный ответ на шок двух каст медоносных пчел. Кривые показывают совокупную групповую реакцию укуса самки-кормодобывающей работницы ( a ) и сгибания брюшка самца трутня ( b , c ) на вредный раздражитель (шок).Гистограммы представляют частотное распределение отклика на напряжение в каждой из групп a , b и c . Гистограмма ответа рабочего ( a ) значительно отличается от Drone I ( b ) и Drone II ( c ). Группа Drone I ( b ) представляет гаплоидных племянников группы Worker ( a ). Группа Drone II ( c ) — это дополнительная группа мужчин, которые позже были оценены с использованием того же протокола презентации, что и рабочие ( a ) (см. Описание в разделе «Материалы и методы»)

Реакция рабочего и дрона vs.чувствительность

Индивидуальная чувствительность к напряжению (напряжение при максимальном движении) положительно коррелирует с напряжением реакции у рабочих (Тау Кендалла, n = 255, τ = 0.20, z = 4.00, p ⟪0.001). Этого не было в дронах, где чувствительность к напряжению существенно не коррелировала с напряжением для реакции (Тау Кендалла, n = 124, τ = 0,04, z = 0,57, p = 0,57).

Рабочий и дрон реагируют vs.фенотип колонии

Оценка агрессии колонии отрицательно коррелировала с потенциалом реакции женщин-рабочих (Тау Кендалла, n = 255, τ = -0,22, z = -4,28, p ⟪0,001;). Аналогичная корреляция наблюдалась с мужской напряжением в ответ (сгибание живота) (Тау Кендалла, n = 124, τ = -0,26 z = -3,17, p = 0,002;).

Отношения между индивидуальной и родительской колонией агрессивной реакцией.Непараметрическая корреляция индивидуального ответа и фенотипа колонии как у собирателей ( a ), так и у трутней ( b ). Напряжение рабочего к реакции снижалось при агрессии колонии (Тау Кендалла, n = 255, t = -0,22, p ⟪0,001). Напряжение дрона для ответа также отрицательно коррелировало с фенотипом колонии (Тау Кендалла, n = 124, t = -0,26, p = 0,002)

Движение рабочего и дрона в сравнении с фенотипом колонии

Индивидуальная чувствительность к напряжению не имела коррелируют с агрессивностью колонии у рабочих (Тау Кендалла, n = 255, τ = 0.04, z = 0,82, p = 0,42). Напротив, чувствительность дронов к напряжению положительно коррелировала с показателем родительской колонии (Тау Кендалла, n = 124, τ = 0,20, z = 2,60, p = 0,01). Скорость передвижения положительно коррелировала с фенотипом колонии у рабочих (Тау Кендалла, n = 255, τ = 0,13, z = 2,74, p = 0,006;), но не у дронов (Тау Кендалла, τ = −0,07, n = 124, z = −0.94, p = 0,35; ).

Связь между фенотипом колонии и индивидуальной скоростью передвижения. Непараметрическая корреляция максимальной скорости передвижения индивидуумов с поправкой на исходный уровень и фенотипа колонии для собирателей ( a ) и трутней ( b ). Размер круга соответствует количеству индивидуальных отзывов. Скорость передвижения и фенотип колонии положительно коррелировали у рабочих (Тау Кендалла, n = 255, t = 0,13, p = 0,006).Никакой существенной корреляции между скоростью передвижения трутней и фенотипом родительской колонии не наблюдалось.

Обсуждение

Главный вывод этого исследования заключается в том, что индивидуальная реакция на электрический шок у работающих женщин и трутней-мужчин коррелирует с агрессивным поведением колонии. Однако совокупное распределение ответов различается между кастами (), что позволяет предположить, что лежащие в основе механизмы различны. Действительно, связи между показателями реакции (напряжение для ответа) и чувствительностью (напряжение при максимальном движении) были разными в разных кастах; у рабочих оба показателя положительно коррелировали, в то время как у дронов такой связи не было.

Агрессивность колонии — это многокомпонентный ответ (Hunt 2007), и переменные нашего индивидуального анализа агрессивности могут приблизительно соответствовать некоторым из них. Соответствие корреляции между напряжением и ответом и фенотипом колонии подразумевает сильный наследственный компонент поведения, что согласуется с предыдущими исследованиями, демонстрирующими отцовские эффекты (Guzman-Novoa et al. 2002, 2005). Напротив, другие составляющие переменные, такие как скорректированная максимальная скорость передвижения, различались по своему отношению к фенотипу колонии, что может отражать кастовые различия.В будущем генетические исследования индивидуальной агрессивной реакции и фенотипа колонии могут выявить гены агрессивности, которые регулируются одинаково и по-разному в разных кастах.

Реакция рабочего на укус

Одним из важных различий между кастами была совокупная реакция на увеличение ударного напряжения. Оглядываясь назад, можно было ожидать пороговой зависимости ответа рабочей группы. Для пчеловодов цена, связанная с ужалением (позвоночные), заключается в резком сокращении продолжительности жизни (Winston, 1987).Более того, высвобождение связанных с тревогой феромонов, которое происходит при укусе, вызывает потенциально дорогостоящую (с точки зрения рабочей силы) агрессивную реакцию всей колонии. Таким образом, синергия между неминуемой индивидуальной смертью и потенциальной потерей рабочей силы медоносных пчел создает явный стимул для задержки реакции. Однако наблюдаемая реакция могла иметь альтернативные объяснения, такие как стоимость яда у одиноких предков.

У организмов, которые используют яд как форму защиты, задержки в развертывании хорошо документированы и метаболически оправданы (Morgenstern and King 2013).Высокая энергетическая стоимость производства яда (общий обзор см. В Morgenstern and King 2013) может потребовать выбора при использовании, и если это так, можно ожидать, что пороговая картина будет широко распространена среди Aculeata. Это не будет большим эволюционным скачком для предковой пороговой реакции, чтобы затем испытать более острый отбор у социальных перепончатокрылых, чтобы повысить эффективность пополнения и синхронизацию, возможно, чему способствуют сигнальные механизмы (например, феромоны тревоги). Следовательно, можно было бы ожидать, что у социальных перепончатокрылых задержка в ответе может быть опосредована для обеспечения наилучших интересов колонии (обсуждается в Haight and Tschinkel 2003 и ссылках в ней), в то время как одиночные самки перепончатокрылых будут делать это в лучших экономических интересах колонии. индивидуум (Моргенштерн и Кинг, 2013).

Таким образом, сравнительное исследование социальных моделей и моделей одиночества может дать более полное представление о поведении. Прогнозы могут быть проверены для социальных перепончатокрылых, исследуя, как механизмы сигналов тревоги, такие как феромон тревоги у медоносных пчел, могут влиять на компоненты реакции. В этом случае сигнал будет работать на снижение точки порога для группы социальных перепончатокрылых для быстрого ответа.

Напротив, наши результаты зависимости напряжения от ответа мужской группы показывают кумулятивную кривую, которая увеличивается пропорционально уровню разряда до насыщения.Этот вывод согласуется с предполагаемой стоимостью укуса, потому что у дронов практически нет затрат на реагирование; действительно, может быть полезно не откладывать ответ, если есть защита, основанная на мимикрии (обсуждается ниже). Больше индивидуальных дронов ответили при более низком напряжении, чем женщины, и меньше новых особей ответили при более высоком напряжении (). Дальнейшие сравнительные исследования, изучающие социальные и одиночные модели или то, как сигнализация может повлиять на реакцию, могут проверить стоимость укуса по сравнению со стоимостью гипотез мимикрии.

Наши результаты на рабочих дополнительно указывают на индивидуальные и внутривидовые вариации реакции на укус. Предыдущие исследования различий пороговых значений индивидуальной реакции на аверсивные стимулы с использованием парадигмы реакции удлинения укуса (SER) (Vergoz et al. 2007) дают представление об организации труда в семьях медоносных пчел (см. Roussel et al. 2009; Tedjakumala and Giurfa 2013) . Недавно в исследовании коллег, изучающих тот же порог, аналогичная картина наблюдалась у рабочих отдельных подвидов пчел, обычно встречающихся в Турции ( Apis mellifera anatoliaca ; результаты неопубликованных Абрамсон, Гирей и его коллег).Однако указанные здесь пороговые значения ниже, чем у британских ( Apis mellifera mellifera ) и итальянских ( Apis mellifera lingustica ) подвидов (Kolmes and Fergusson-Kolmes 1989). Принимая во внимание эти прошлые исследования и то, что наша местная медоносная пчела, хотя и нежная, но является африканизированным гибридом, эти результаты показывают, что экологические факторы более высокого уровня могут определять различия в порогах реакции.

Сгибание живота дрона

Нашим измерением реакции дрона было напряжение при сгибании живота (описательные материалы см. В Интернет-ресурсах 1 (фото-иллюстрация сгибания живота) и 2 (видео, на котором дрон-пчела реагирует на поражение электрическим током)).Сгибание живота у самцов перепончатокрылых описывается как поведенческий механизм «блефа», с помощью которого они потенциально усиливают свою сексуальную автомимикрию (Starr 1981; Evans and West-Eberhard 1971). В отчетах наблюдений описаны виды, у которых выворот эдеагуса (репродуктивного органа самцов насекомых) является обычным явлением, а некоторые виды даже используют модифицированные структуры брюшной полости, используемые в территориальных схватках, и все это для улучшения демонстрации (Evans and West-Eberhard 1971). Исследования, в которых анализировалось это или другое защитное поведение у самцов перепончатокрылых, немногочисленны.

У ос самцы демонстрируют поведение и морфологию призывников, имитирующую яйцеклад / жало, но эта поведенческая и физиологическая реакция глубоко не изучена (Evans and West-Eberhard 1971). Однако два исследования показывают, что сложные взаимодействия могут модулировать как отображение, так и поведение. У шмелей был описан компромисс между автомимикрией по половому цвету, чтобы напоминать жалящую самку, и тепловыми требованиями к более темному цвету в холодных и более светлых тонах в теплых местах, что свидетельствует о взаимодействии селективного давления (Stiles, 1979).В другом репрезентативном исследовании были количественно определены различия в поведении самцов осы из рода Polistes (Starr, 1981). Автор описывает, что у этих примитивно эусоциальных ос вклад самцов в защиту гнезда зависит от степени диморфизма полового окраса. Далее автор пришел к выводу, что чем более одинаково окрашены полы, тем больше частота участия самцов в поведенческих проявлениях, угрожающих гнезду (Starr 1981).

У медоносных пчел исследования дронов показали, что они могут воспринимать сигналы социального бедствия (Vetter and Visscher 1997), но исследования возможной поведенческой реакции на эти сигналы отсутствовали.С другой стороны, описанное поведение может быть вызванным болью рефлексом на отрицательный стимул (шок). Однако кривые совокупного ответа и корреляции компонентов агрессивного ответа с фенотипом колонии различаются для разных дронов и рабочих. Можно предположить, что гипотезы мимикрии или болевого рефлекса применимы к нашим наблюдениям, но это требует дальнейшего изучения.

Независимо от эволюционного объяснения наблюдаемые различия между реакцией рабочего и дрона предполагают механистические различия в нейронном контроле поведения.Действительно, недавние результаты исследования, в котором анализируется обучаемость и реакция на укус рабочих при воздействии различных концентраций этанола, предполагают, что механизм контроля модулирует поведение рабочего при укусе (Abramson, Giray и др. Неопубликованные результаты; см. Также Burrell and Smith 1995).

Скорость движения и реакция между кастами

Для рабочих положительная корреляция между чувствительностью к напряжению и напряжением к ответу указывает на то, что обнаружение стимула является предиктором реакции.Для дронов картина отличается. Чувствительность дронов к напряжению не позволяла предсказать их ответное напряжение. Этот результат предполагает диссоциацию между чувствительностью к напряжению и ответным напряжением в мужской касте. При рассмотрении с результатами кумулятивного анализа ответов групп (и выше) наши результаты дополнительно подтверждают механистические различия в этих компонентах поведения в разных кастах. Таким образом, мы делаем вывод, что, несмотря на реакцию на аверсивный стимул, рабочие, похоже, откладывают реакцию до определенного порога, вероятно, посредством модулирующей регуляции (Núñez et al.1983; Баррелл и Смит 1995; обсуждается в Fu et al. 2013), тогда как реакция самцов происходит синхронно с предъявлением повышенного напряжения.

Агрессивность колонии и поведение рабочего

Наблюдаемая отрицательная корреляция между напряжением рабочего к ответной реакции и фенотипом колонии устанавливает, что более агрессивные колонии обычно состоят из особей с более низким уровнем толерантности к усугубляющим стимулам (). Агрессивная реакция колонии на атаку или манипуляции — это согласованные, опосредованные феромонами усилия ее компонентов.Вместе с предыдущими исследованиями наши результаты показывают, что отбор на уровне колоний при агрессивном ответе изменяет индивидуальные пороги ответа (Guzman-Novoa et al. 1999).

У рабочих скорость передвижения положительно коррелировала с агрессивностью колонии. Следовательно, в более агрессивных колониях были особи, которые достигли более высокой скорости передвижения. Результаты измерений активности совпадают с ранее сообщенными наблюдениями. Скорость бега пчел и их рассредоточения по сотам является широко используемой переменной в используемом здесь рейтинговом тесте и других рейтинговых тестах как компонент группового поведения при оценке агрессии колонии (Guzman-Novoa et al.1999, 2003; Schneider et al. 2004 г.). Переменная была положительно коррелирована с другими групповыми показателями агрессии колонии. Следовательно, интересно, что активность индивидуального уровня также совпадает с фенотипом колонии у рабочих.

Удивительно, но чувствительность к напряжению не коррелировала с фенотипом колонии. Однако при исследовании вместе с положительной корреляцией между напряжением реакции и чувствительностью к напряжению видно, что индивидуальная реакция имеет стадии, так что отдельные рабочие сначала реагируют на стимулы, увеличивая скорость их движения, и они достигают максимальной скорости (чувствительность к напряжению ) только до ответа на укус.

Агрессивность колонии и поведение дрона

Для дронов наше первоначальное ожидание заключалось в том, что индивидуальное поведение будет коррелировать с фенотипом колонии из-за убедительных генетических доказательств того, что вклад отца является важным детерминантом защитного поведения семей и рабочих медоносных пчел (Arechavaleta-Velasco and Hunt 2004; Guzman-Novoa et al.2005). Таким образом, мы выдвинули гипотезу о том, что дроны-производители, которые производят образцы генетической структуры репрезентативной популяции рабочих, также будут иметь аналогичные поведенческие корреляты.Наши результаты не полностью подтверждают эту гипотезу. Только один из исследуемых компонентов поведения, напряжение при ответе (сгибание живота), отражает поведение рабочих из исходной колонии.

Наш анализ показывает, что реакция дрона (сгибание живота) отрицательно коррелировала с агрессией колонии (). Таким образом, более агрессивные колонии дают дронов с большей готовностью реагировать (с меньшей толерантностью). Этот результат подтвердил нашу первоначальную гипотезу о том, что поведение дрона будет сильно коррелировать с поведением колонии и отдельных рабочих из-за аллельных эффектов.Подразумевается, что агрессивное поведение колонии отражается главным образом в напряжении дронов на реакцию, что может указывать на сильную генетическую составляющую поведения.

В отличие от рабочих, скорость передвижения трутней не коррелировала с фенотипом колонии (). Следовательно, скорость движения трутней, в отличие от сгибания живота, не может быть генетически связана с защитным поведением колонии. Фактически, повышение напряжения привело к снижению активности, и это снижение положительно коррелировало с агрессивным поведением колонии.Положительная связь между пониженной активностью и повышенной агрессивностью колонии предполагает, что более агрессивные колонии производят отдельных дронов, которые достигают максимальной скорости движения при более высоких напряжениях (т.е. менее чувствительны). Нет четкой связи между скоростью движения дрона и агрессивной реакцией колонии, а скорость движения при болевом раздражении, возможно, потребуется исследовать только для отдельного самца.

Таким образом, мы заключаем, что корреляция защиты на уровне колонии с компонентом индивидуального поведения зависит от касты.Дроны служат средством для быстрого распространения агрессивных черт в популяции, и они демонстрируют коррелированную реакцию — сгибание живота. Функциональное и эволюционное значение сгибания живота дрона в настоящее время неизвестно. Тем не менее, механистические различия (то есть различия в экспрессии генов) в агрессивной реакции рабочих, дронов и их потомков будут информативными для социогеномных коррелятов агрессии (Robinson et al.2005; Whitfield et al.2002; Hunt et al.2007; Cingolani et al. 2013).

Информация для авторов

Ариан Авалос, факультет биологии, Университет Пуэрто-Рико, Рио-Пьедрас, П.О. Box 23360, Сан-Хуан 00931, Пуэрто-Рико.

Йоселин Родригес-Крус, факультет биологии, Университет Пуэрто-Рико, Рио-Пьедрас, P.O. Box 23360, Сан-Хуан 00931, Пуэрто-Рико.

Тугрул Гирей, факультет биологии, Университет Пуэрто-Рико, Рио-Пьедрас, П.О. Box 23360, Сан-Хуан 00931, Пуэрто-Рико.

Поиск биохимических маркеров долголетия

Насекомые.2019 Aug; 10 (8): 244.

Мартин Кунч

¹ Институт экспериментальной биологии, факультет естественных наук, Университет Масарика, Котлярска 2, 611 37 Брно, Чешская Республика

Павел Добеш

¹ Институт экспериментальной биологии, факультет естественных наук, Масарик University, Kotlarska 2, 611 37 Brno, Czech Republic

Jana Hurychová

¹ Институт экспериментальной биологии, факультет естественных наук, Университет Масарика, Котлярска 2, 611 37 Брно, Чешская Республика

Libor Vojtek

¹ Институт экспериментальной биологии, факультет естественных наук, Университет Масарика, Котлярска 2, 611 37 Брно, Чешская Республика

Сильвана Беани Пойани

¹ Институт экспериментальной биологии, факультет естественных наук, Masaryk U niversity, Kotlarska 2, 611 37 Brno, Czech Republic

² Департамент биологии, Институт биологических наук, Центр изучения социальных насекомых (CEIS), Государственный университет Сан-Паулу — UNESP, Avenida 24A, 1515 Bela Vista, Rio Claro 13506-900, Бразилия

Иржи Данихлик

³ Кафедра биохимии, Факультет естественных наук, Университет Палацкого Оломоуц, Слехтителу 27, 783 71 Оломоуц, Чешская Республика

Ярослав Гавлик

^{4 Кафедра качества пищевых продуктов , Факультет агробиологии, продовольствия и природных ресурсов Чешского университета естественных наук, Камицка 129, 252 63 Прага, Чехия}

Далибор Титера

⁵ Институт пчеловодства, Либчице-над-Влтавой 252 66, Чешская Республика

Павел Гиршл

¹ Институт экспериментальной биологии, факультет естественных наук, Университет Масарика, Котлярска 2, 611 37 Брно, Чешская Республика

¹ Институт Экспериментальная биология, факультет естественных наук, Университет Масарика, Котлярска 2, 611 37 Брно, Чешская Республика

² Отделение биологии, Институт биологических наук, Центр изучения социальных насекомых (CEIS), Государственный университет Сан-Паулу — UNESP, Avenida 24A, 1515 Bela Vista, Rio Claro 13506-900, Бразилия

³ Кафедра биохимии, факультет естественных наук, Университет Палацкого Оломоуц, Слехтителу 27, 783 71 Оломоуц, Чешская Республика

⁴ Департамент качества и безопасности пищевых продуктов , Факультет агробиологии, продовольствия и природных ресурсов Чешского университета естественных наук, Камицка 129, 252 63 Прага, Чешская Республика

⁵ Институт пчеловодства, Либчице-над-Влтавой 252 66, Чешская Республика

Поступила 27 июня 2019 г .; Принята в печать 2 августа 2019 г.

Abstract

В течение многих лет было известно, что в умеренном климате европейская медоносная пчела Apis mellifera существует в виде двух разных популяций в течение года: короткоживущих летних пчел и долгоживущих зимних пчел.Однако знания об основных биохимических маркерах зимних и летних популяций пока ограничены. Тем не менее, различие между этими двумя видами пчел становится все более важным, поскольку оно может помочь пчеловодам оценить долю долгоживущих пчел в ульях и, следовательно, частично предсказать успех перезимовки. Для выявления маркеров зимних поколений мы использовали непрерывный долгосрочный мониторинг одной семьи медоносных пчел в течение почти двух лет, который включал измерения физиологических и иммунологических параметров.Результаты показали, что общая концентрация белков, уровень вителлогенина и антибактериальная активность гемолимфы — это три лучших из всех отслеживаемых параметров, которые связаны с долголетием медоносной пчелы и поэтому могут использоваться в качестве ее маркеров.

Ключевые слова: медоносная пчела, иммунитет, физиология, сезонные изменения, долголетие

1. Введение

Медоносные пчелы ( Apis mellifera L.) играют важную роль в жизненном цикле растений как единое целое. важнейших опылителей.Более 75% из 115 ведущих видов сельскохозяйственных культур во всем мире зависят от опыления животными или, по крайней мере, получают от него пользу [1,2]. Пчелы ( Apoidea ) ответственны за опыление примерно 70% всех видов сельскохозяйственных культур во всем мире [3]. В основном по этой причине борьба медоносных пчел с патогенами ( Paenibacillus larvae , Ascosphaera apis , вирусы и т. Д.), Паразитами и вредителями ( Varroa destructor , Nosema sp., Aethina tumida и др.) И другие факторы, влияющие на выживаемость колонии [4].

Есть еще необъяснимые случаи расстройства коллапса колонии (CCD) [5,6]. Утрата пчелиных семей считается многофакторной проблемой, сочетающей влияние биотических и абиотических стрессоров, например, питания [7], пестицидов [8] и изменения климата [9]. Следовательно, знание физиологического и иммунологического статуса семей медоносных пчел имеет решающее значение для помощи пчеловодам в противодействии потенциальным проблемам и защите медоносных пчел.

Большинство CCD происходит зимой, которая является наиболее опасным периодом для семей медоносных пчел [10,11]. Поэтому крайне важно изучить изменения в организме медоносных пчел в зимний период. В течение года в умеренном климате появляются две характерные популяции медоносных пчел. В то время как так называемое летнее поколение недолговечно и составляет от 15 до 48 дней, зимнее поколение может прожить до 8 месяцев [12]. Короткоживущие медоносные пчелы должны собирать летом достаточное количество нектара, пади и пыльцы, чтобы иметь достаточно запасов, чтобы пережить неблагоприятные времена, когда урожай недоступен, т.е.э., зима. Долгоживущие медоносные пчелы регулируют температуру колонии в течение зимнего сезона и предназначены для начала выращивания расплода в конце, когда это поколение заменяется новым летним поколением [13,14]. Зимнее население также подвергается более высокому экологическому давлению вредителей и болезней [15,16,17,18].

Между этими двумя популяциями медоносных пчел существуют не только поведенческие [19] различия, но и физиологические различия. Например, титр ювенильного гормона (ЮГ) повышен [20,21], а гипофарингеальные железы гипертрофированы у летних пчел [22,23].Напротив, количество запаса и антиоксидантный белок вителлогенин (Vg) увеличивается в долгоживущем поколении [20,24,25]. Жировое тело, которое используется как запас питательных веществ и источник энергии, также увеличивается у озимых пчел [26]. Более того, иммунный ответ медоносных пчел варьируется в течение года, поскольку зависит от различных механизмов. Короткоживущие поколения сочетают гуморальные и клеточные иммунные реакции, тогда как долгоживущие популяции зависят в основном от гуморального иммунитета, поскольку функции гемоцитов в зимний период ограничены [27,28,29,30].И последнее, но не менее важное: медоносные пчелы — социальные насекомые; социальный иммунитет [31,32,33] и социальная каста [34] также играют важную роль в защите колонии.

Успешная перезимовка семей медоносных пчел зависит от размера и качества поколения озимых пчел [23,35]. Надлежащая практика пчеловодства, которая сосредоточена в основном на комплексной борьбе с вредителями с особым вниманием к клещам [36], может помочь защитить долгоживущих медоносных пчел. Однако полная биохимическая характеристика зимнего и летнего поколений пока отсутствует.Здесь мы представляем исчерпывающие результаты основных биохимических анализов, которые могут помочь пчеловодам оценить физиологический статус своих семей в течение всего года и, таким образом, помочь оценить присутствие долгоживущих пчел в семье. В этом исследовании мы наблюдали за выбранной колонией медоносных пчел в течение примерно двух лет и отслеживали изменения физиологии и иммунитета медоносных пчел в улье. Мы определили несколько физиологических и иммунных параметров, которые существенно различаются между летними и зимними популяциями медоносных пчел, и предлагаем эти параметры в качестве маркеров долголетия.

2. Материалы и методы

2.1. Экспериментальные пчелы

Медоносные пчелы, Apis mellifera L., использованные в эксперименте, были получены из колонии, содержащейся на пасеке Кивалка недалеко от Брно, Чешская Республика (местоположение GPS: 49.1886747N, 16.4513211E). Улей, выбранный для экспериментов, был выбран профессиональным пчеловодом с более чем 30-летним опытом пчеловодства. Подопытная колония была выбрана исходя из условий ее здоровья и развития. В колонии были отрицательные симптомы нозематоза и варроаза без каких-либо клинических симптомов других заболеваний.Королева была завезена в колонию в 2015 году и оставалась такой же на протяжении всего эксперимента (март 2017 г. — сентябрь 2018 г.) до замены королевы в октябре 2018 г. В колонии производилось стабильное выращивание расплода в течение 2015 и 2016 гг. Экспериментальная колония получила стандарт забота на протяжении всего эксперимента. Его лечили от варроаза флуметрином и каждую осень кормили примерно 15 кг раствора сахарозы (сахароза / вода 3: 2); никаких других добавок в улей не добавляли. Все образцы для анализа были собраны из экспериментальной колонии, чтобы наблюдать за долгосрочными характеристиками развития улья и минимизировать генетическую изменчивость.В начале каждого месяца из колонии случайным образом отбирали около 150 пчел. В частности, пчел стряхивали с соты на пластиковой пластине, с которой их переносили в пластиковые флаконы, закрытые перфорированными крышками для обеспечения вентиляции. Чтобы избежать отбора проб только что вылупившихся взрослых особей, медоносные пчелы собирали из сот, которая не являлась частью выводковой камеры, но располагалась рядом с ней. Данные, собранные в экспериментальной колонии (колония 1), были однократно сравнены в июне 2018 года с двумя другими выбранными колониями (колония 2 и 3), расположенными на той же пасеке.Все колонии получали одинаковое лечение, развивались независимо и возглавлялись неродственными матками. Во время эксперимента постоянно регистрировали температуру и влажность на пасеке. В результатах отображаются средние значения за 3 дня до сбора.

2.2. Коллекция гемолимфы

Пчелы были быстро доставлены в лабораторию в пластиковых флаконах с перфорированной крышкой для обеспечения потока воздуха, и образцы гемолимфы были собраны сразу после прибытия путем отрезания брюшной полости и легкого надавливания на грудную клетку.Образцы гемолимфы всегда брали в течение двух часов после сбора пчел в пластиковые флаконы. Два микролитра гемолимфы были взяты из каждой отдельной медоносной пчелы, и, если не указано иное, гемолимфа из десяти пчел была объединена для приготовления смешанного образца. Свежие образцы гемолимфы использовали для определения концентрации гемоцитов, общей концентрации белка и активности фенолоксидазы. Образцы гемолимфы, используемые для определения других физиологических и иммунологических параметров, разбавляли раствором фенилтиомочевины для предотвращения меланизации и коагуляции.В частности, 20 мкл собранной гемолимфы смешивали с 5 мкл фенилтиомочевины (PTU, 1 мг / мл) в фосфатном буфере (PBS, pH 7,0) и хранили при -80 ° C для дальнейшего использования.

2.3. Физиологические параметры

Была измерена концентрация общего белка в гемолимфе. У пяти пчел брали кровь на образец без использования раствора PTU, и каждый месяц эксперимента готовили пять образцов. Образцы собирали на льду, чтобы предотвратить меланизацию. Концентрацию общего белка измеряли по методу Брэдфорда с использованием коммерческого набора (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США).Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра Multiscan GO (Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA) при 700 нм. Точное количество общего белка рассчитывали по стандартной калибровочной кривой, построенной для бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).

Общую концентрацию липидов определяли сульфо-фосфо-ванилиновым методом согласно Zollner et al. [37] с модификациями Kodrík et al. [38]. Один микролитр образца гемолимфы, разбавленного в 1,25 раза, смешивали с 200 мкл серной кислоты (Penta, Прага, Чешская Республика) и инкубировали при 100 ° C в течение 10 мин.После быстрого охлаждения на водяной бане добавляли 2 мл 13 мМ ванилина (Carl Roth Gmbh & Co. KG, Карлсруэ, Германия) в 66,8% фосфорной кислоте (Penta, Прага, Чехия) и полученный раствор инкубировали в течение 30 мин. при комнатной температуре. Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре Sunrise (Tecan, Männedorf, Швейцария) при 546 нм. Концентрацию общего липида рассчитывали по стандартной калибровочной кривой, полученной из серийных разведений олеиновой кислоты (Penta, Прага, Чешская Республика).

Общую концентрацию углеводов измеряли антроновым методом [39]. 50 мкл разбавленного образца смешивали со 150 мкл 10,3 мМ антрона (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в 98% -ной серной кислоте (Penta, Прага, Чешская Республика), после чего раствор осторожно перемешивали и инкубировали. при 4 ° C в течение 10 мин. Затем смесь инкубировали при 100 ° C в течение 20 мин, а затем снова при комнатной температуре в течение 20 мин. Оптическую плотность измеряли с помощью спектрофотометра Sense (Hidex, Турку, Финляндия) при 620 нм при перемешивании перед считыванием.Общую концентрацию углеводов рассчитывали согласно калибровочной кривой, построенной для дифференциально разбавленной глюкозы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).

Уровни вителлогенина (~ 180 кДа) определяли электрофорезом с додецилсульфатом натрия (SDS) в соответствии с Gätschenberger et al. [40] с модификациями на аппарате Miniprotein II (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США). Пять микролитров замороженных образцов гемолимфы разводили 50 × в 0,125 М трис-буфере, pH 6,8, и 10 мкл разбавленного образца смешивали с 10 мкл буфера для образцов, 7 мкл меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) и 73 мкл 0,125 М трис-буфера pH 6,8, инкубировали в течение пяти минут при 90 ° C и наносили на 7,5% акриламидный разделяющий гель. После разделения с помощью SDS-электрофореза гели переносили в раствор для окрашивания 1,2 мМ кумасси синим (R250, Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США); 4: 5: 1 вода / метанол / уксусная кислота (Penta, Прага, Чехия). Затем гели обесцвечивали в растворе 2 мМ уксусной кислоты в 33,3% метаноле до тех пор, пока полосы белка не стали отчетливо видны. Гели сканировали, и плотность полос вителлогенина измеряли в ImageJ v.1.52a (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд, США). Концентрацию общего вителлогенина рассчитывали в соответствии с калибровочной кривой, построенной из серийных разведений бычьего сывороточного альбумина (66,5 кДа, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), который присутствовал на каждом акриламидном геле.

2.4. Клеточный иммунитет

Для определения концентрации циркулирующих гемоцитов 10 мкл гемолимфы пяти пчел смешивали с 2,5 мкл PTU в PBS (1 мг / мл). Гемоциты подсчитывали с помощью гемоцитометра под световым микроскопом CX 31 (Olympus, Токио, Япония) с фазовым контрастом.Каждый месяц эксперимента готовили четыре образца. Количество гемоцитов выражали как количество гемоцитов на микролитр гемолимфы и оценивали в эксперименте.

2,5. Гуморальный иммунитет

Антибактериальную активность гемолимфы медоносной пчелы определяли методом радиальной диффузии на чашках с агаром, инокулированных Micrococcus luteus (CCM 169). Бактерии культивировали в течение ночи в жидкой среде LB (MOBIO, Carslbad, CA, USA) на роторном шейкере (100 об / мин, комнатная температура).После культивирования суспензию разбавляли до OD ₆₀₀ 1,5, смешивали с расплавленным агаром LB (4% агар в LB, MOBIO, Карлсбад, Калифорния, США) в соотношении 1: 500 (об. / Об.) При температуре ниже 50. ° C, а затем разлили по чашкам Петри. Чашки с агаром с добавлением M. luteus оставляли для затвердевания перед проколом лунок диаметром 2 мм. Гемолимфу медоносной пчелы и серийное разведение чистого лизоцима (EC 3.2.1.17; Sigma-Alrich, Сент-Луис, Миссури, США) загружали в лунки до объема 5 мкл.После инкубации при 30 ° C в течение 24 ч зоны ингибирования вокруг лунок оценивали, и антибактериальную активность гемолимфы выражали в эквиваленте стандарта лизоцима.

Активность фенолоксидазы (ПО) измерялась в свежесобранной гемолимфе без обработки фенилтиомочевиной, как было опубликовано ранее [41,42]. Гемолимфу от пяти медоносных пчел на образец (общий объем 10 мкл) собирали в ледяной PBS (190 мкл; pH 7,0) и осторожно перемешивали пипеткой. Сорок микролитров разбавленной гемолимфы переносили в лунку микропланшета и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре.После инкубации добавляли 160 мкл субстрата PO 3,4-дигидрокси-DL-фенилаланина (3 мг / мл в PBS; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), чтобы начать реакцию. Увеличение поглощения при 492 нм измеряли каждые две минуты в течение 30 минут с использованием планшет-ридера Sunrise (Tecan, Männedorf, Швейцария). Активность ПО определяли как скорость меланизации через 30 мин реакции и выражали как интеграл от кривой реакции.

2.6. Представление данных и статистический анализ

Результаты были нанесены на график с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad Software, версия 7.0, Сан-Диего, Калифорния, США). Статистические различия оценивались с помощью однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным тестом Данна, сравнивающего две короткоживущие популяции, май 2017 г. – август 2017 г., т.е. лето 2017 г., и май 2018 г. – август 2018 г., т.е. лето 2018 г., и одно долгоживущее поколение. , Октябрь 2017 г. — март 2018 г., т.е. зима 2017/2018 гг. Для сравнения различий только между летним и зимним поколениями переходные месяцы (март, апрель, сентябрь), когда в ульях присутствовала смесь медоносных пчел, не включались в анализ.Сборник статистических данных и p-значений критерия Данна, рассчитанных с помощью GraphPad, представлен в дополнительных материалах (таблицы S1 и S2). Тест многомерной корреляции Спирмена был проведен для проверки взаимосвязи между измеряемыми переменными (физиологическими и иммунологическими параметрами). Коэффициент корреляции Спирмена r изменяется от -1 до +1. Значение r , близкое к -1, указывает на отрицательную корреляцию, а значение r , близкое к +1, указывает на положительную корреляцию.Когда значение коэффициента корреляции приближается к 0, связь между двумя переменными считается более слабой.

Анализ главных компонентов (PCA) был проведен для оценки корреляции между физиологическими параметрами (концентрациями общего белка, липидов, углеводов и вителлогенина, антибактериальной активностью, фенолоксидазной активностью и концентрацией гемоцитов) и сезонами сбора рабочих (лето 2017 г., г. зима 2017/2018 и лето 2018). Статистический тест был проведен на данных с использованием бесплатного PAST 3.05 программное обеспечение (Университет Осло, Осло, Норвегия). Поскольку переменные находятся в разных единицах измерения, мы использовали корреляционную матрицу для стандартизации каждой из переменных и выполнения PCA. На графике лето 2017 года представлено сплошными черными точками, зима 2017/2018 — синими квадратами, а лето 2018 — красными крестами.

3. Результаты

3.1. Физиологические параметры

Концентрация общих белков в гемолимфе варьировала около 30 мг / мл в течение обоих тестируемых летних периодов, и мы не наблюдали никаких различий между двумя соответствующими короткоживущими популяциями медоносных пчел, исследованных в эксперименте (а).Однако уровень белка значительно увеличился в зимний период и оставался на уровне более 50 мг / мл с октября по март.

Сезонное изменение концентрации общего белка ( a ), липидов ( b ) и углеводов ( c ) и уровня вителлогенина ( d ) в гемолимфе медоносных пчел. Красные полосы показывают летние поколения медоносных пчел (май – август), а синяя область — зимние поколения (октябрь – март). Точки представляют среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3–5.Пунктирная линия представляет собой среднегодовое значение (октябрь 2017 г. — сентябрь 2018 г.). Звездочка указывает на значительную разницу ** p <0,01, *** p <0,001, нс = не значимо.

В течение обоих тестируемых летних периодов концентрация общего липида колебалась около среднегодового значения с пиком 4,4 ± 0,5 мг / мл в июле 2017 г. (b) и минимумом 1,3 ± 0,1 мг / мл в июне 2018 г. Короткоживущие медоносные пчелы не отличались друг от друга, но медоносные пчелы, собранные летом 2018 г., значительно отличались от особей, собранных зимой 2017/2018 гг.Уровень липидов зимой превышал 4 мг / мл.

Общая концентрация углеводов была очень стабильной в течение всех исследованных сезонов (c), а измеренные значения колебались около среднегодового значения (73,8 мг / мл), за исключением значения, измеренного в сентябре 2018 г. Не было значительных различий среди всех протестированных. времена года.

Концентрация вителлогенина зимой 2017/2018 г. была выше по сравнению с обоими летними периодами (d). У долгожителей уровень вителлогенина составлял около 20 мг / мл.В оба летних сезона значения оставались ниже среднегодового значения 10,2 мг / мл, за исключением значения 14,2 ± 1,9 мг / мл, измеренного в июле 2017 года. Короткоживущие поколения не различались между собой. Уровень вителлогенина в дронах был ниже предела обнаружения для конкретного метода (рисунок S1). Результат был подтвержден вестерн-блоттингом (рис. S2).

3.2. Иммунологические параметры

Антибактериальная активность (а) варьировала около 4 мг / мл в зимний сезон с пиком 4.7 ± 2,7 мг / мл в декабре 2017 года. У обоих протестированных короткоживущих поколений уровень антибактериальной активности был ниже среднегодового. Значения летом 2018 года достигли около 2 мг / мл и были значительно выше значений летом 2017 года, которые достигли 0,5 мг / мл. Оба короткоживущих поколения показали значительно более низкую антибактериальную активность, чем зимняя популяция.

Сезонное развитие антибактериальной активности ( a ), активности фенолоксидазы ( b ) и количества гемоцитов ( c ) в гемолимфе медоносных пчел.Красные полосы указывают на летние поколения медоносных пчел (май – август), а синие области указывают на зимнее поколение (октябрь – март). Точки представляют среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3–5. Пунктирная линия представляет собой среднегодовое значение (октябрь 2017 г. — сентябрь 2018 г.). Звездочка указывает на значительную разницу ** p <0,01, *** p <0,001, нс = не значимо.

Активность фенолоксидазы незначительно, но незначительно увеличивалась в зимний период (б). Этот измеренный параметр показал высокую степень изменчивости, и не было обнаружено статистически значимых различий между наблюдаемыми сезонами.

В отличие от активности ПО, концентрация гемоцитов была очень стабильной в течение периода наблюдения (c). Количество гемоцитов колебалось около 500 клеток / мкл, что было очень близко к среднегодовому значению (429 клеток / мкл). Летом 2017 г. и зимой 2017/2018 г. наблюдался заметный рост со значениями около 600 клеток / мкл, в то время как летом 2018 г. значение было примерно среднегодовым. Статистический анализ не выявил различий в концентрации гемоцитов в зависимости от сезона.

Экспериментальная колония (колония 1) сравнивалась с двумя другими колониями (колония 2 и 3) в июне 2018 г., чтобы учесть изменчивость измеренных параметров (рисунки S3 и S4).Никаких существенных различий между тестируемыми колониями не наблюдалось, за исключением активности ПО, которая была ниже в колонии 1, чем в обеих других тестируемых колониях (рисунок S4b).

Параллельно с физиологическими и иммунологическими показателями медоносных пчел мы отслеживали изменения температуры и влажности на участке пасеки, где собирали медоносных пчел (). Самые высокие зарегистрированные температуры составили 26,7 ° C и 26,4 ° C в августе 2017 года и августе 2018 года соответственно. Самая низкая температура составила -3,4 ° C в марте 2018 года.Относительная влажность колебалась между 50% и 90%, с самыми высокими значениями в январе и феврале 2018 года.

Изменения влажности (синие квадраты, слева по оси ) и температуры (красные точки, справа и по оси) при местонахождение пасеки, где собирали медоносных пчел. Каждая точка представляет собой среднее значение измерений за три дня до сбора и в день сбора.

Корреляции между всеми измеренными физиологическими и иммунологическими параметрами были определены с помощью теста корреляции Спирмена; значимые результаты всех трех сезонов подведены в.Концентрация общего белка положительно коррелировала с антибактериальной активностью как летом 2017 г., так и зимой 2017/2018 г. со значениями r _s 0,648 и 0,542 соответственно. Летом 2017 года концентрация белка положительно коррелировала с концентрацией вителлогенина (r _s = 0,608), но отрицательно — с активностью фенолоксидазы (r _s = -0,81). Более того, общая концентрация липидов положительно коррелировала с углеводами (r _s = 0,771) летом 2018 г. и с количеством гемоцитов зимой 2017/2018 г. (r _s = 0.471).

Таблица 1

Ранговые корреляции Спирмена для различных переменных, которые показали значимые значения p для трех сезонов: лето 2017 г., зима 2017/2018 г. и лето 2018 г.

В настоящем исследовании объяснены три основных компонента, генерируемых PCA (PC1, PC2 и PC3) 71.67% изменчивости между группами (лето 2017 г., зима 2017/2018 г. и лето 2018 г.). PCA разделил рабочих из лета 2017 г., лета 2018 г. и зимы 2017/2018 г. на две основные группы и сопоставил их с физиологическими параметрами (). Лето 2017 и лето 2018 четко сгруппированы в основном в левой части графика, а зима 2017/2018 — в правой. Все переменные находятся в правой части графика, что означает, что они действуют вместе, отделяя летних пчел от зимних.Однако каждая переменная имеет собственное значащее значение. Разделение летних и зимних групп связано с наиболее значимыми переменными в данных, их значимость определяется их факторной нагрузкой, которая колеблется от +1 до -1. Были две основные значимые переменные, белки и вителлогенин, с факторными нагрузками 0,811 и 0,775 соответственно. Липиды (факторная нагрузка 0,672) и антибактериальная активность (факторная нагрузка 0,661) также были значимыми переменными, хотя и более слабыми, чем белки и вителлогенин.Гемоциты, фенолоксидаза и углеводы оказали меньшее влияние на летние и зимние группы по сравнению с другими показателями.

Дисперсионный анализ главных компонентов (белки, липиды, углеводы, вителлогенин, антибактериальная активность, фенолоксидаза и гемоциты). Компонент 1 (PC1), изображенный как ось x , объясняет 35,86% изменчивости выборки. Компонент 2 (PC2), изображенный как ось y , объясняет 19,37% изменчивости выборки. Черные точки, красные кресты и синие квадраты представляют значения для лета 2017 г., лета 2018 г. и зимы 2017/2018 гг. Соответственно.Зеленые линии показывают степень, в которой каждая переменная способствует объяснению различий.

Диапазон значений для каждой популяции для трех выбранных маркеров долголетия на основе анализа PCA был изображен как 75% процентиль значений (). Все значения были разделены на квартили; верхний и нижний квартили в летней и зимней популяциях были отсечены соответственно. Эти значения рассматривались как смесь обеих популяций или на них могли отрицательно повлиять неуказанные факторы окружающей среды, т.е.э., патологии, поэтому были исключены из ассортимента. Общая концентрация белков в короткоживущих популяциях колебалась от 17 до 42 мг / мл, а ее уровень повышался в долгоживущих популяциях до 49–87 мг / мл. Точно так же уровень вителлогенина был ниже в летнем поколении (0–10 мг / мл) по сравнению с зимним поколением (14–26 мг / мл). Антибактериальная активность, измеренная как эквивалент концентрации лизоцима, снизилась у короткоживущих медоносных пчел на 0–2 мг / мл и увеличилась у долгоживущих пчел.Физиологические диапазоны тестируемых параметров для каждой популяции суммированы в.

Графическое изображение предлагаемых физиологических диапазонов уровней белка, вителлогенина и антимикробных препаратов для каждого сезона. Красные, синие и серые области представляют соответственно короткоживущие, долгоживущие и смешанные популяции.

Таблица 2

Обобщение предлагаемого физиологического диапазона для каждого выбранного маркера долголетия на основе анализа PCA.

4. Обсуждение

Хотя давно известно, что две разные популяции медоносных пчел существуют в одной и той же колонии, такие знания основаны на наблюдениях за продолжительностью жизни [12], знаниях, касающихся их биохимические показатели в целом ограничены. В основном, вителлогенин, как запасной и антиоксидантный белок, связан с долголетием медоносных пчел [13,20,26,27,43,44]. Однако другим важным параметрам, которые также могут характеризовать отдельные популяции медоносных пчел, уделялось меньше внимания.В попытке восполнить этот пробел и улучшить знания о долголетии, основная цель настоящего исследования состояла в том, чтобы оценить все основные физиологические и иммунологические параметры взрослых рабочих и сопоставить их с долгоживущими и короткоживущими поколениями медоносных пчел. В соответствии с опубликованной литературой [13] мы разделили популяции медоносных пчел в соответствии с сезонным развитием. Пчелы с октября по март считались долгожителями, а пчелы в остальное время года относились к короткоживущим.Сентябрь и апрель считались месяцами перехода между сезонами, и им уделялось меньше внимания, поскольку была высокая вероятность равномерного распределения обеих популяций медоносных пчел в улье.

Согласно предыдущим наблюдениям, более высокое содержание белков и липидов в гемолимфе озимых пчел совпало с более высоким содержанием этих соединений в их жировом теле [45]. Это увеличение ожидается, потому что медоносные пчелы должны создавать запасы питательных веществ для зимнего сезона.Все организмы, включая пчел, должны поддерживать стабильную концентрацию основных питательных веществ в своей системе кровообращения, и, в случае необходимости, эти питательные вещества могут быть восполнены из тканей хранения. Соответственно, мы обнаружили, что уровень углеводов очень стабилен в течение года. Неудивительно, что мы обнаружили быстрое увеличение углеводов в сентябре 2018 года, когда отбор образцов проводился на следующий день после введения раствора сахарозы в ульи в качестве замены меда. Поскольку такая практика может помешать оценке сезонного развития уровня углеводов, а также уровней других питательных веществ в гемолимфе, она ясно показывает, что отбор проб для оценки предполагаемых биохимических параметров долголетия должен планироваться именно с учетом лечения колонии.В течение года единственными источниками белков и углеводов для пчел являются пыльца и нектар соответственно [46]. Различия между летом 2017 г. и летом 2018 г. могли быть вызваны различиями в источниках пищи в течение сезона [47].

Поскольку клеточная часть иммунной системы долгоживущих поколений ограничена, нарушен фагоцитоз и образование узелков [27,28], медоносные пчелы вынуждены полагаться на гуморальную часть иммунной системы в зимний период.Это соответствует более высокой антибактериальной активности гемолимфы у зимней популяции, которая может быть вызвана индуцибельными антибактериальными пептидами, такими как апидецин, гименоптецин, абаецин, или конститутивными антибактериальными соединениями, такими как лизоцим, присутствующими в гемолимфе [10,48,49,50]. Более того, это увеличение антибактериальной активности коррелирует с более высоким уровнем белка в поколении зимних медоносных пчел. С другой стороны, некоторые авторы сообщили о снижении экспрессии иммунных генов у долгоживущих поколений и, следовательно, более высокой восприимчивости к заболеваниям [27,28,51].Другая важная часть гуморальной иммунной системы — активность фермента фенолоксидазы [52] — зимой не проявляла значительно более высокой активности. Однако мы наблюдали небольшую тенденцию к увеличению активности ПО в долгоживущем поколении, согласующуюся с Lourenço et al. [53], которые также показали увеличение активности ПО у долгожителей. Геном медоносной пчелы содержит только один ген, кодирующий предшественник ПО, пропенолоксидазу, тогда как три и девять присутствуют у Drosophila и Anopheles соответственно [49].Кроме того, ферментативную активность ПО трудно определить из-за быстрой активации и истощения системы ПО [52]. Этот динамический процесс приводит к сильно различающимся результатам, поэтому необходимо использовать только что собранные образцы гемолимфы. По этим причинам этот параметр не подходит для периодического тестирования долголетия медоносных пчел в практике пчеловодства.

В зимний период медоносные пчелы полагаются на хранение меда как на основной и единственный источник пищи. Эта диета, состоящая в основном из углеводов, может влиять на состав и функцию гемоцитов в популяциях долгоживущих медоносных пчел [28,54], что приводит к подавлению клеточного иммунитета.Зимой гемоциты меньше участвуют в борьбе с болезнетворными микроорганизмами, чем летом. В качестве одной из основных причин были определены высокие энергетические затраты на поддержание гемоцитов у различных организмов [55,56,57], что требует многих ресурсов, которые подавляются зимой. Более того, многие авторы описали, что количество гемоцитов в циркуляции зависит от возраста медоносной пчелы, а сильное снижение количества гемоцитов наблюдалось у старых пчел [24,25,29,30]. Наши результаты показали небольшое увеличение количества гемоцитов летом 2017 и зимой 2017/2018 по сравнению со среднегодовыми значениями, но без какой-либо статистической значимости.Хотя нам не удалось подтвердить сезонную изменчивость количества гемоцитов, это может частично быть вызвано отбором проб у пчел неопределенного возраста.

Вителлогенин — это известный внутренний запасающий гликолипопротеин, синтезируемый в клетках жирового тела и высвобождаемый в гемолимфу [58,59]. Предыдущие исследования, в дополнение к настоящему, считали, что более высокий уровень вителлогенина в гемолимфе является маркером зимних пчел [43,60,61,62,63]. Поскольку более высокое количество вителлогенина в гемолимфе указывает на существование долгоживущих медоносных пчел, он считается основным компонентом, важным для перезимовки [64].Чтобы подтвердить, что самая распространенная форма вителлогенина 180 кДа присутствует в гемолимфе [58,59], мы использовали образец гемолимфы трутня в качестве отрицательного контроля. Как было описано ранее, у трутней есть вителлогенин только на ранних этапах их жизни, и он исчезает, когда им исполняется три недели или более [40,65,66,67,68]. Наши результаты подтвердили эти выводы; однако использования только одного измерения параметра в качестве маркера долговечности может быть недостаточно. Согласно анализу основных компонентов, общий уровень белков гемолимфы сильно коррелировал с физиологическими изменениями в теле медоносной пчелы в течение зимнего сезона, а также с антибактериальной активностью, измеренной против непатогенных модельных бактерий M.luteus . Наши выводы подтверждаются предыдущими исследованиями [12,63,69,70]. Dainat et al. (2012) сообщили о повышении активности иммунных генов как прогностическом маркере; одновременно они упомянули заражение Varroa как прогностический маркер расстройства коллапса колонии [10].

Поскольку некоторые авторы описали физиологические различия между медоносными пчелами, выращиваемыми в разных условиях [71], и даже различия между колониями [72], мы использовали измерения еще двух семей в июне 2018 года.Все протестированные ульи не различались по физиологическим параметрам (Рисунок S3). Точно так же между колониями наблюдается постоянство измеренных иммунологических реакций (Рисунок S4), за исключением активности ПО, которая была ниже в колонии 1, чем в других. Однако активность ПО является сильно изменяющимся параметром, и было обнаружено, что он не подходит для сравнения летних и зимних популяций медоносных пчел.

Известно, что погода может иметь значительное влияние на медоносную пчелу во время ее зимовки [73], кормовой активности [74] или вирусной нагрузки [75] в ульях.Вместо прямого воздействия погодных условий на особей медоносных пчел снижение потока пыльцы и, как следствие, нарушение питания может вызвать проблемы, связанные с недоеданием [7,76,77]. Таким образом, мы собрали данные о погоде, в частности о температуре и влажности на пасеке. В ходе эксперимента изменения погодных параметров были типичны для умеренного климата, особенно для низких зимних температур. Незначительные различия наблюдались между 2017 и 2018 годами. Однако, например, изменение температуры в апреле 2017 года по сравнению с апрелем 2018 года, когда средняя температура в последнем была ниже 10 ° C, предположительно, окажет влияние на развитие колонии в течение остальное время года.Аналогичным образом, почти вдвое более высокая температура в мае 2018 года по сравнению с маем 2017 года может повлиять на начало выращивания расплода [78,79,80] или фенологию [81,82,83] пчел в колонии.

Преимущество выбранных методов — относительная простота; Таким образом, пчеловоды могут сотрудничать с широким спектром лабораторий, в которых могут проводиться анализы. Однако, если будет рассматриваться более длительное время транспортировки и хранения пчел или образцов гемолимфы, следует учитывать влияние этих факторов на результаты анализов.Что касается результатов нашего исследования, общая концентрация белка, уровни вителлогенина и антибактериальная активность в гемолимфе могут быть использованы в качестве относительно простых маркеров для определения присутствия долгоживущих медоносных пчел в колонии. На основании результатов анализов и их сравнения с физиологическими показателями, приведенными в, пчеловоды могли скорректировать уход за своими семьями. Они могут принять практические меры для защиты ульев. Например, объединение двух или более слабых семей для создания сильной является возможным решением, или несколько слоев изоляции, добавленных к улью, могут быть использованы для лучшей защиты слаборазвитых семей [23,35].Более того, лечение короткоживущих популяций против патогенов может отразиться на повреждении долгоживущих популяций. Следовательно, слаборазвитые колонии могут быть устранены, чтобы сэкономить деньги на кормление и другие расходы. Эти меры, основанные на результатах анализов, могут снизить зимние потери медоносных пчел.

В текущем исследовании продемонстрирована способность выбранных маркеров различать летние и зимние популяции медоносных пчел в умеренном климате. Поскольку это исследование проводилось на одном улье, будущие эксперименты будут включать в себя попытки измерить все три предложенных параметра на большом количестве семей медоносных пчел, чтобы дифференцировать генотип и переменные среды и сопоставить результаты анализов с показателем успешности перезимовки.На основании этого исследования мы предлагаем проводить два профилактических отбора проб в год в июне и октябре. При сравнении друг с другом и с данными, представленными в нашем исследовании, результаты профилактических выборок могут дать полезное представление о готовности пчел-долгожителей, которые необходимы для успешной перезимовки. Возможность надежно различать две популяции медоносных пчел может стать сильным и полезным инструментом для пчеловодов. Они могли оценить долю долгоживущих пчел в ульях и на основе результатов предсказать возможные проблемы перезимовки.Наша работа дает базовые знания об изменениях физиологических и иммунологических параметров в созданных семьях медоносных пчел за длительный период, почти два года. Собранные данные могут быть использованы в качестве краеугольного камня для дальнейших исследований по оценке доли долгоживущих медоносных пчел в их колонии.

5. Выводы

В этом исследовании сравнивались различия между долгоживущими и короткоживущими популяциями медоносных пчел. Подробно описаны различия в физиологических и иммунологических параметрах обеих популяций.Зимние медоносные пчелы имели более высокое количество общих белков, липидов и вителлогенина, а также более высокий уровень антибактериальной активности в их гемолимфе по сравнению с летними пчелами. На основе этих знаний и в соответствии с результатами PCA мы предлагаем уровни общего белка, антибактериальной активности и вителлогенина в качестве маркеров долгоживущих популяций медоносных пчел. Наши результаты могут помочь пчеловодам подтвердить наличие долгожителей в семьях.

Благодарности

Авторы благодарят Ing.Олдржиху Веверке за его высокопрофессиональную помощь в работе с медоносными пчелами и Мэтью Николлсу за английские исправления в рукописи. Мы также благодарим Чешский гидрометеорологический институт за предоставление метеорологических данных; Данные были измерены автоматической метеостанцией, размещенной в районе ВАП Трубско. Наконец, что не менее важно, мы благодарим Люси Волощукову за помощь в проведении вестерн-блоттинга.

Дополнительные материалы

Следующие материалы доступны в Интернете по адресу https: // www.mdpi.com/2075-4450/10/8/244/s1, Рисунок S1: Гель-электрофоретический анализ концентрации вителлогенина; Фигура S2: Вестерн-блот-анализ вителлогенина; Рисунок S3: Сравнение физиологических параметров; Рисунок S4: Сравнение иммунологических параметров; Таблица S1: Сбор статистических данных; Таблица S2: p — Значения теста Данна.

Вклад авторов

P.H., P.D. и M.K. задумал исследования и разработал эксперименты; L.V., D.T., J.D. и J.H. (Ярослав Гавлик) участвовал в разработке и интерпретации данных; М.K., P.D., P.H. и J.H. (Яна Гурычова) проводила эксперименты и анализ; S.B.P. выполняли многомерную статистику и интерпретацию данных; М.К., П.Д., С.Б.П. и П.Х. написал статью и участвовал в доработке. Все авторы прочитали и одобрили окончательную рукопись.

Финансирование

Это исследование финансировалось грантом NAZV номер QJ1610248 и грантом Фонда исследований Сан-Паулу (FAPESP) 2017 / 19718-0.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.Финансирующие организации не играли никакой роли в разработке исследования; при сборе, анализе или интерпретации данных; при написании рукописи или в решении опубликовать результаты.

Ссылки

-1. [CrossRef] [Google Scholar] 68. Piulachs M.D., Guidugli K.R., Barchuk A.R., Cruz J., Simões Z.L.P., Bellés X. Вителлогенин медоносной пчелы, Apis mellifera : структурный анализ кДНК и исследования экспрессии. Насекомое Biochem. Мол. Биол. 2003. 33: 459–465. DOI: 10.1016 / S0965-1748 (03) 00021-3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 69. Кунерт К., Крайлсхейм К. Сезонные изменения содержания углеводов, липидов и белков у молодых рабочих пчел и их смертность.J. Apic. Res. 1988. 27: 13–21. DOI: 10.1080 / 00218839.1988.11100775. [CrossRef] [Google Scholar] 70. Амдам Г. В., Омхольт С. В. Нормативная анатомия продолжительности жизни медоносных пчел. J. Theor. Биол. 2002; 216: 209–228. DOI: 10.1006 / jtbi.2002.2545. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 71. Де Соуза Д.А., Кафтаноглу О., Де Йонг Д., Пейдж Р.Э., Амдам Г.В., Ван Ю. Различия в морфологии, физиологии и экспрессии генов маток и рабочих медоносных пчел, выращиваемых in vitro, по сравнению с in situ. Биол. Открытым. 2018; 7: bio036616. DOI: 10.1242 / биография.036616. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 72. Отис Г., Уиллер Д.Э., Бак Н.А., Маттила Х.Р. Запасные белки у зимних медоносных пчел. APIACATA. 2004. 38: 352–357. [Google Scholar] 73. Свитанек М., Крайльсхайм К., Трухетц Х., Бродшнайдер Р. Моделирование сезонного воздействия температуры и осадков на зимнюю смертность медоносных пчел в умеренном климате. Sci. Total Environ. 2017; 579: 1581–1587. DOI: 10.1016 / j.scitotenv.2016.11.178. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 74. Нильсен А., Рейтан Т., Ринволл А.В., Бристинг А.К. Влияние конкуренции и климата на сообщество опылителей сельскохозяйственных культур. Agric. Экосист. Environ. 2017; 246: 253–260. DOI: 10.1016 / j.agee.2017.06.006. [CrossRef] [Google Scholar] 75. Далмон А., Перуцци М., Ле Конте Й., Ало К., Пиоз М. Температурные изменения вирусной нагрузки у медоносной пчелы Apis mellifera . J. Invertebr. Патол. 2019; 160: 87–94. DOI: 10.1016 / j.jip.2018.12.005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 76. Хуан З. Питание пыльцой влияет на устойчивость медоносных пчел к стрессу.Terr. Arthropod Rev.2012; 5: 175–189. DOI: 10.1163 / 187498312X639568. [CrossRef] [Google Scholar] 77. Файн Дж.Д., Шпиглер Х.Ю., Рэй А.М., Бич Н.Дж., Санки А.Л., Ахмед-Каш А., Хуанг З.Й., Астраускайте И., Чао Р., Чжао Х. и др. Количественная оценка воздействия питания пыльцой на кладку яиц медоносных пчел с помощью новой лабораторной системы. PLoS ONE. 2018; 13: e0203444. DOI: 10.1371 / journal.pone.0203444. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 78. Нюрнбергер Ф., Хертель С., Штеффан-Девентер И.Влияние температуры и фотопериода на сроки появления расплода в зимующих семьях медоносных пчел. PeerJ. 2018; 6: e4801. DOI: 10.7717 / peerj.4801. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 79. Medrzycki P., Sgolastra F., Bortolotti L., Bogo G., Tosi S., Padovani E., Porrini C., Sabatini A.G. Влияние температуры выращивания расплода на развитие медоносных пчел и восприимчивость к отравлению пестицидами. J. Apic. Res. 2010; 49: 52–59. DOI: 10.3896 / IBRA.1.49.1.07. [CrossRef] [Google Scholar] 80.Иноуэ Д.В. Влияние изменения климата на фенологию, повреждение морозами и обилие горных полевых цветов. Экология. 2008. 89: 353–362. DOI: 10.1890 / 06-2128.1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 81. Уильямс К.М., Генри Х.А.Л., Синклер Б.Дж. Холодные истины: как зима влияет на реакцию земных организмов на изменение климата. Биол. Ред. 2015; 90: 214–235. DOI: 10.1111 / brv.12105. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 82. Шенк М., Краусс Дж., Хольцшух А. Десинхронизация во взаимодействиях пчела с растением вызывает серьезную потерю приспособленности у одиночных пчел.J. Anim. Ecol. 2018; 87: 139–149. DOI: 10.1111 / 1365-2656.12694. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 83. Langowska A., Zawilak M., Sparks T.H., Glazaczow A., Tomkins P.W., Tryjanowski P. Долгосрочное влияние температуры на медосбор и фенологию пчел. Int. J. Biometeorol. 2017; 61: 1125–1132. DOI: 10.1007 / s00484-016-1293-х. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

объявляет о новых шагах по укреплению здоровья опылителей

опылители имеют решающее значение для экономики страны, продовольственной безопасности и здоровья окружающей среды.Одно только опыление пчелами увеличивает стоимость сельскохозяйственных культур более чем на 15 миллиардов долларов каждый год и помогает обеспечить, чтобы в нашем рационе было много фруктов, орехов и овощей. Эту чрезвычайно ценную услугу обществу оказывают медоносные пчелы, местные пчелы и другие насекомые-опылители, птицы и летучие мыши.

Медоносная пчела с пыльцой на задней лапе, опыляющая цветок арбуза. (Фото Стивена Осмуса / USDA)

Но опылители борются. В прошлом году пчеловоды сообщили о потере около 40% семей медоносных пчел, что поставило под угрозу жизнеспособность их средств к существованию и основные услуги по опылению, которые пчелы оказывают сельскому хозяйству.Под угрозой оказались и бабочки-монархи. Число зимующих монархов в лесах Мексики сократилось на 90% или более за последние два десятилетия, что поставило под угрозу культовую ежегодную миграцию североамериканских монархов.

Именно поэтому в июне прошлого года президент Обама издал президентский меморандум, предписывающий межведомственной целевой группе разработать стратегию по укреплению здоровья медоносных пчел и других опылителей . Сегодня под руководством Агентства по охране окружающей среды США (EPA) и U.S. Министерство сельского хозяйства (USDA), Целевая группа публикует свою стратегию с тремя всеобъемлющими целями:

1. Снизить потери колоний медоносных пчел до экономически устойчивого уровня;
2. Увеличивайте количество бабочек-монархов, чтобы защитить ежегодную миграцию; и
3. Восстановите или улучшите миллионы акров земли для опылителей за счет совместных государственных и частных действий.

Опубликованная сегодня Стратегия и сопровождающий ее научно обоснованный план действий по исследованиям опылителей определяют потребности и приоритетные действия для лучшего понимания потерь опылителей и улучшения здоровья опылителей.Эти действия будут поддерживаться координацией существующих федеральных исследовательских усилий и сопровождаться запросом в Конгресс о дополнительных ресурсах для реагирования на потери опылителей, которые происходят сейчас.

Увеличение количества и качества среды обитания опылителей является основной частью этих усилий — от строительства садов для опылителей в зданиях федерального правительства до восстановления миллионов акров земель, находящихся в федеральном управлении, и аналогичных действий на частных землях.Чтобы поддержать эти усилия, ориентированные на среду обитания, Министерство сельского хозяйства США и Министерство внутренних дел сегодня издают набор Оптимальных для опылителей передовых методов управления федеральными землями , предоставляя практические рекомендации для планировщиков и менеджеров, ответственных за управление земельными ресурсами.

Президент подчеркнул необходимость применения «всеобщего внимания» подхода к укреплению здоровья опылителей, включая участие граждан и сообществ и налаживание партнерских отношений между государственным и частным секторами. Для развития сотрудничества межведомственная целевая группа по охране здоровья опылителей будет работать над разработкой плана действий партнерства , который направляет координацию со многими государственными, местными, промышленными и гражданскими группами, заинтересованными и способными помочь в решении проблем, с которыми сталкиваются опылители.

Люди всех возрастов и сообществ по всей стране могут сыграть свою роль, откликнувшись на призыв президента к действию. ВЫ можете разделить часть земли с опылителями — пчелами, бабочками, другими насекомыми, птицами, летучими мышами — посадив в саду опылителей или выделив какую-нибудь естественную среду обитания. ВЫ можете хорошо подумать, прежде чем применять какие-либо пестициды, и всегда следуйте инструкциям на этикетке. ВЫ можете узнать больше о видах опылителей, которые живут рядом с вами.

Сегодняшнее объявление знаменует собой важный шаг на пути к укреплению здоровья опылителей, которые критически важны для нашей экономики, окружающей среды и здоровья.

• Ознакомьтесь с Национальной стратегией по укреплению здоровья опылителей ЗДЕСЬ
• Ознакомьтесь с Планом действий по исследованию опылителей ЗДЕСЬ
• Прочтите Лучшие методы управления, благоприятные для опылителей для федеральных земель ЗДЕСЬ
• Доступ Приложения к Национальной стратегии ЗДЕСЬ

Д-р Джон П. Холдрен — помощник президента по науке и технологиям и директор Управления научно-технической политики Белого дома.